于殿宇 陳 俊 鄒丹陽 程 杰 劉天一* 李藝琳 楊 龍 王立琦*
(1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 哈爾濱150028)
豆腐是我國傳統(tǒng)的大豆制品,是變性大豆蛋白在凝固劑作用下所產(chǎn)生的凝膠產(chǎn)物,具有營養(yǎng)豐富、食用方便等特點(diǎn)[1-2]。豆腐中含有多種人體必需的微量元素及維生素[3]。大豆蛋白質(zhì)中氨基酸組成非常接近于人體所需的理想比例,被人們稱為“完全蛋白質(zhì)”[4]。研究表明豆腐具有預(yù)防高膽固醇和降血糖的功效,對神經(jīng)衰弱和體質(zhì)虛弱的人有很大益處,對高血壓、冠心病等患者在治療過程中有一定的輔助療效[5-6]。大豆中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,如胰蛋白酶抑制劑、血球凝集素、植酸等,這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會影響豆腐中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[7]。
大豆經(jīng)發(fā)芽處理后,異黃酮和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的含量顯著增加[8-9]。異黃酮具有雌激素活性,有利于治療和預(yù)防因雌激素水平下降而引發(fā)的更年期綜合癥[10-11]。異黃酮還具有多種生理功能,如抗癌,抗氧化,抗衰老,預(yù)防骨質(zhì)疏松等[12-14]。γ-氨基丁酸又名酪氨酸,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[15],具有多種生理活性功能,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有降血壓,增進(jìn)肝功能,延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老,增強(qiáng)記憶力等多種功效[16-18]。在傳統(tǒng)豆腐生產(chǎn)過程中約有12%的大豆蛋白和5%的油脂以及其它營養(yǎng)成分在壓制過程中隨黃漿水流失,而內(nèi)酯豆腐在制作過程中省去了壓制工序,從而可以使豆?jié){全部凝固,保存其中大部分營養(yǎng)成分。葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL)本身不能使蛋白質(zhì)膠凝,只有在水解后,生成了葡萄糖酸才使蛋白質(zhì)膠凝,GDL 在常溫下水解緩慢,而加熱后能迅速分解[19]。這種特性使內(nèi)酯豆腐在加入GDL 后有充足的灌裝時間,凝膠生產(chǎn)機(jī)械化、包裝化,并且容易保存和運(yùn)輸。本研究以發(fā)芽大豆為原料,以GDL 為凝固劑制作內(nèi)酯凝膠,探討不同發(fā)芽時間及制備條件對內(nèi)酯凝膠強(qiáng)度及營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響,以確定制作發(fā)芽大豆內(nèi)酯豆腐的最佳工藝,為內(nèi)酯豆腐的開發(fā)提供了新思路。
材料:大豆,市售;食用級葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯,安徽省興宙醫(yī)藥食品有限公司。
設(shè)備:GP/TH 恒溫培養(yǎng)箱,上海廣品實(shí)驗設(shè)備制造有限公司;DJ13B-D86SJ 豆?jié){機(jī),九陽股份有限公司;DZDW-1000W 電熱爐,興化市駿輝電熱電器廠;TA-xTZi 物性測試儀,上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司;HWS-24 恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SP-756 紫外分光光度計,上海光譜儀器有限公司;HX-1800 氨基酸自動分析儀,武漢恒信世紀(jì)科技有限公司;S-3400N 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),日本日立公司;TA.XTC-16 質(zhì)構(gòu)分析儀,上海保盛實(shí)業(yè)有限公司。
1.2.1 發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠制備 挑選成熟飽滿的大豆,用蒸餾水洗去大豆表面的雜質(zhì),再用5 倍蒸餾水于室溫下浸泡大豆8 h,瀝水后將其置于培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件:溫度25 ℃、濕度85%)內(nèi)培養(yǎng)一段時間,使大豆發(fā)芽至一定長度,將發(fā)芽后的大豆和水以一定質(zhì)量比倒入豆?jié){機(jī)中磨漿;將所得物質(zhì)過100 目篩除去豆渣,使用電熱爐加熱豆?jié){,其間進(jìn)行消泡處理,防止假沸現(xiàn)象的產(chǎn)生;消泡完畢在95~100 ℃煮沸5 min 后取出;冷卻至30 ℃加入一定量的GDL 飽和溶液,混合均勻;在85 ℃下保溫一定時間再將凝膠取出,并將其立即放入冷水中快速降溫,冷卻成型,即得到內(nèi)酯凝膠。發(fā)芽時間為0 h,即為普通大豆內(nèi)酯凝膠。
1.2.2 凝膠強(qiáng)度測定方法 將內(nèi)酯凝膠樣品放在物性測試儀的載物臺上,采用P0.5 型探頭對準(zhǔn)試樣中心,以1 mm/s 的速度壓至15 mm,測定其凝膠強(qiáng)度。其它參數(shù):探頭直徑25 mm,探頭穿刺前速度3 mm/s,返回速度3 mm/s[20]。
1.2.3 營養(yǎng)成分含量測定 蛋白質(zhì)含量:參照GB 5009.5-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》 中凱氏定氮法;脂肪含量:參照GB/T 14488.1-2008《植物油料含油量測定》;異黃酮:參考En-Ming 等[21]的紫外分光光度法進(jìn)行測定;GABA:參考Guo 等[22]的方法測定。
1.2.4 掃描電鏡觀察 在最優(yōu)結(jié)果條件下制成普通大豆內(nèi)酯凝膠和發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠。然后將制成的樣品經(jīng)脫水干燥后,用導(dǎo)電膠帶粘在掃描電鏡樣品臺上,噴金鍍膜,最后將樣品轉(zhuǎn)移到SEM臺面上,并在5 kV 條件觀察并拍照。
1.2.5 凝膠質(zhì)構(gòu)的測定 利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行內(nèi)酯凝膠質(zhì)構(gòu)分析,采用TA36 探頭。測定參數(shù)為:測前速度5 mm/s,檢測速度2 mm/s,測后速度3 mm/s,檢測時間5 s,激發(fā)力5.0 g,記錄其質(zhì)構(gòu)各個指標(biāo),3 次測樣取平均值[23]。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有指標(biāo)測定重復(fù)3 次,試驗結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 進(jìn)行分析和繪制。用SPSS 17.0 進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析,并采用Duncan 檢驗(P<0.05)檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性。
選擇發(fā)芽時間為0,8,16,24,32 h 的發(fā)芽大豆,按豆芽∶水為1∶4(質(zhì)量比),GDL 溶液添加量為0.3%,保溫時間為40 min 制作成內(nèi)酯凝膠,測定其凝膠強(qiáng)度(如圖1所示)和營養(yǎng)物質(zhì)含量(表1)。
凝膠強(qiáng)度是評價凝膠品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,反映大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)狀態(tài),決定凝膠產(chǎn)品的加工質(zhì)量[20]。不同發(fā)芽時間對內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度的影響如圖1所示,內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度隨大豆發(fā)芽時間的延長呈下降趨勢,在0~16 h 內(nèi)凝膠強(qiáng)度下降緩慢,而在16 h 之后凝膠強(qiáng)度下降加快。這可能由于發(fā)芽時間的延長,大豆中蛋白質(zhì)減少及水分增加所致,大豆中蛋白質(zhì)分解成小組分,為大豆發(fā)芽提供能量,導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降[24]。蛋白質(zhì)濃度是凝膠形成的決定性因素之一[25],發(fā)芽前期(0~16 h),隨發(fā)酵時間延長,芽長變化不明顯,即芽中含水量增加不明顯,因此凝膠強(qiáng)度下降較緩,在16 h 后,由于芽長增加,芽內(nèi)水分含量增加,導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度下降較大,因此在發(fā)芽16 h后,凝膠強(qiáng)度下降較快。
發(fā)芽時間與營養(yǎng)物質(zhì)含量的關(guān)系如表1所示,凝膠中脂肪含量稍有下降,這是由于一部分脂肪轉(zhuǎn)化成大豆發(fā)芽時所需要的能量[26]。GABA、異黃酮含量都有明顯提高,可能由于大豆在發(fā)芽過程中呼吸作用增強(qiáng),使得發(fā)芽大豆內(nèi)酶的種類和數(shù)量顯著增加,苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)是其中之一,PAL 是異黃酮生物合成代謝的關(guān)鍵酶,因此發(fā)芽大豆中異黃酮的含量有所增加[27];大豆在發(fā)芽過程中由于谷氨酸脫羧酶活性被激活以及外界環(huán)境的刺激等各種因素都可能造成大豆內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA,使GABA 積累[28]。
綜合比較凝膠強(qiáng)度和營養(yǎng)物質(zhì)兩種因素的變化趨勢,當(dāng)16 h 時,凝膠強(qiáng)度及營養(yǎng)物質(zhì)含量都較好,因此選擇16 h 為最佳發(fā)芽時間。
以發(fā)芽大豆為原料,將發(fā)芽時間16 h 的發(fā)芽大豆,按豆∶水 (質(zhì)量比)1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6,GDL 溶液添加量為0.3%,保溫40 min 制作成內(nèi)酯凝膠,測定其凝膠強(qiáng)度(圖2)和營養(yǎng)物質(zhì)含量(表2)。
圖1 發(fā)芽時間對凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 The effect of germination time on the gel strength
圖2 豆水比對凝膠強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of bean to water ratio on gel strength
表1 發(fā)芽時間對營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Table 1 Effect of germination time on nutrient content
表2 豆水比對營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of bean to water ratio on the nutrient content
不同豆水比與內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度關(guān)系如圖2所示。豆水比在1∶2~1∶4 時,凝膠強(qiáng)度上升,在加水量較小時(即豆水比小于1∶4),隨著加水量的增加,發(fā)芽大豆在磨漿時大豆蛋白會更加充分地釋放于豆?jié){中,使得其蛋白質(zhì)濃度增加,因此內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度會有所增加。在豆水比大于1∶4 時(即加水越多),雖然此時可使蛋白質(zhì)充分釋放,豆?jié){中蛋白質(zhì)含量最多,然而由于過量的水使得豆?jié){的相對濃度下降,GDL 添加量不足以使豆?jié){中的蛋白質(zhì)變性,沒有充分形成凝膠網(wǎng)絡(luò),因此,導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度顯著降低。
豆水比與營養(yǎng)物質(zhì)含量關(guān)系如表2所示,豆水比小于1∶4 時,發(fā)芽大豆研磨不充分使得營養(yǎng)物質(zhì)殘留在濾渣中,從而營養(yǎng)物質(zhì)含量較??;豆水比大于1∶4 時,豆?jié){濃度降低,導(dǎo)致內(nèi)酯凝膠中異黃酮、GABA 等營養(yǎng)物質(zhì)含量相對下降。結(jié)合圖2、表2結(jié)果,豆水比在1∶4 時最佳,凝膠強(qiáng)度和營養(yǎng)物質(zhì)含量較好。
以發(fā)芽大豆為原料,將發(fā)芽時間16 h 的發(fā)芽大豆,按豆芽∶水(質(zhì)量比)為1∶4,GDL 添加量分別為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,保溫40 min制作成內(nèi)酯凝膠,測定其凝膠強(qiáng)度(圖3)和營養(yǎng)物質(zhì)含量(表3)。
GDL 在豆?jié){中被分解成葡萄糖酸,使豆?jié){的pH 值逐漸下降,導(dǎo)致大豆蛋白在等電點(diǎn)附近凝聚,改變蛋白質(zhì)分子的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而影響內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度。不同GDL 添加量與凝膠強(qiáng)度關(guān)系如圖3所示,GDL 含量在0.1%~0.3%時,呈顯著上升趨勢;在0.3%~0.5%時,稍有降低。當(dāng)GDL 添加量過少時,不足以使豆?jié){中的蛋白質(zhì)完全凝固,從而導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度較低。GDL 添加量升高使得豆?jié){的pH 值降低,蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力變小,分子間的結(jié)合力增強(qiáng),因此凝膠強(qiáng)度升高;當(dāng)GDL添加量在0.3%時,豆?jié){的pH 值降低至蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn),此時凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大;當(dāng)GDL 添加量繼續(xù)增加,豆?jié){的pH 值低于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)時,蛋白質(zhì)帶有正電荷,使得其分子間的斥力增大,凝膠強(qiáng)度下降[29]。
不同GDL 添加量與營養(yǎng)物質(zhì)含量關(guān)系如表3所示,隨著GDL 添加量的增加,pH 值逐漸下降,發(fā)芽大豆中含有的β-葡萄糖苷酶活性增強(qiáng),作用于異黃酮糖苷,水解出大量異黃酮組成成分——染料木素和大豆黃素,因此異黃酮的含量會有所增加[30]。發(fā)芽大豆中谷氨酸脫羧酶的最佳pH 值為5~6,隨著pH 值逐漸下降,谷氨酸脫羧酶活性增強(qiáng),使谷氨酸脫羧形成GABA,導(dǎo)致GABA 含量增多,pH 值下降到5 以下會影響谷氨酸脫羧酶活性從而使GABA 含量下降[31]。結(jié)合圖3、表3,GDL 添加量在0.3%時最佳。
以發(fā)芽大豆為原料,選擇發(fā)芽時間16 h 的發(fā)芽大豆,豆芽∶水(質(zhì)量比)為1∶4,GDL 溶液添加量為0.3%,保溫時間為20,30,40,50,60 min 時,制作成凝膠,測定其凝膠強(qiáng)度(圖4)和營養(yǎng)物質(zhì)含量(表4)。
圖3 GDL 含量對凝膠強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of GDL content on the gel strength
圖4 保溫時間對凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of coagulation time on the gel strength
表3 GDL 含量對營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Table 3 Effect of GDL content on the nutrient content
表4 保溫時間對營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響Table 4 Effect of coagulation time on the nutrient content
不同保溫時間對凝膠強(qiáng)度的關(guān)系如圖4所示,凝膠強(qiáng)度呈先上升之后基本保持不變的趨勢,可能隨保溫時間的延長,蛋白質(zhì)不斷變性,使巰基基團(tuán)以及疏水區(qū)域不斷增多,形成更加緊密的網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu),進(jìn)而提高了凝膠強(qiáng)度。當(dāng)保溫時間超過40 min 時,形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的變性蛋白分子不再增加,因此,在保溫40 min 后凝膠強(qiáng)度基本保持不變[5]。
不同保溫時間對營養(yǎng)物質(zhì)含量變化如表4所示,隨保溫時間的延長,蛋白質(zhì)形成更加緊密的網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu),使得內(nèi)酯凝膠的營養(yǎng)成分得以保存。保溫時間超過40 min 時,形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的變性蛋白分子不再增加,凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不在改變,此時凝膠網(wǎng)絡(luò)所包裹的營養(yǎng)物質(zhì)含量也不再增加。綜上,在保溫40 min 后,凝膠強(qiáng)度基本不變,且時間延長會消耗更多的能量,因此,40 min 為最佳保溫時間。
綜合單因素試驗結(jié)果,對發(fā)芽大豆凝膠的凝膠強(qiáng)度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,研究采用Box-Benhnken 中心組合設(shè)計,以發(fā)芽時間(A)、豆水比(B)、GDL 添加量(C)、保溫時間(D)為自變量,凝膠強(qiáng)度(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計4 因素3 水平響應(yīng)面試驗,因素水平編碼見表5,試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表6。
表5 因素水平表Table 5 Table of factors and levels
表6 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 6 Design proposal and experiment result of response surface
(續(xù)表6)
利用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表7(P<0.05 為顯著項)。將試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到發(fā)芽時間(A)、豆水比(B)、GDL 添加量(C)、保溫時間(D)的回歸方程為:
R=48.62+0.36A+1.78B+0.25C-1.09D+1.91AB-3.83AC+1.40AD+0.31BC+2.77BD-3.07CD-4.13A2-5.93B2-6.31C2-4.23D2。
表7 方差分析結(jié)果Table 7 The results of variance analysis
由表7可知,整體模型的F=45.33,P<0.0001,模型極顯著,表明通過回歸方程可以看出因變量與所有自變量之間具有顯著的線性關(guān)系,即這種試驗方法是可靠的。失擬項F=3.67,P=0.1108,失擬項不顯著,表明該模型選擇正確,模型中的調(diào)整系數(shù)R2Adj=95.68%,說明95.68%的響應(yīng)值變化可以通過模型進(jìn)行解釋,相關(guān)系數(shù)R2=97.84%,說明該模型與試驗擬合良好??梢杂么四P蛠矸治龊皖A(yù)測凝膠。圖5分別給出了發(fā)芽時間、豆水比、GDL 添加量、保溫時間的交互作用對凝膠強(qiáng)度的響應(yīng)曲面圖。
圖5 凝膠強(qiáng)度響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of variables on gel strength
由圖5可以看出,4 個變量:發(fā)芽時間(A)、豆水比(B)、GDL 添加量(C)、保溫時間(D),在兩兩交互時,保持其中兩個變量不變,隨著另外兩個變量的增加,凝膠強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢。其中,發(fā)芽時間(A)和豆水比(B),發(fā)芽時間(A)和GDL 添加量(C),豆水比(B)和保溫時間(D),GDL添加量(C)和保溫時間(D)交互作用顯著,對凝膠濃度的影響較大。
應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析,尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表8。
為檢驗在響應(yīng)面優(yōu)化條件下所得結(jié)果的可靠性,驗證試驗得到的凝膠強(qiáng)度48.76 g/cm2,響應(yīng)面優(yōu)化的預(yù)測值與試驗值之間的擬合性良好,從而證實(shí)了模型的有效性。
圖6為普通大豆內(nèi)酯凝膠與發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠SEM 對比圖,圖6a 為普通大豆內(nèi)酯凝膠SEM圖,圖6b 為發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠SEM 圖。由圖6a可知,普通大豆內(nèi)酯凝膠的孔隙比較密集,孔的個數(shù)較多;由圖6b 可知,發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠的孔隙稍大,孔的個數(shù)有所減少。有文獻(xiàn)表明,凝膠的微觀空間結(jié)構(gòu)與凝膠強(qiáng)度及持水性有直接聯(lián)系[32]。發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠的孔隙稍大,是由于發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠所含蛋白質(zhì)含量略有下降,導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低,所得結(jié)果與上述試驗結(jié)果一致。雖然發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠比普通大豆內(nèi)酯凝膠的孔隙稍大,但差異不顯著,因此對內(nèi)酯凝膠的凝膠強(qiáng)度和持水性沒有顯著影響。
表8 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 8 Results of response surface optimization
圖6 普通大豆內(nèi)酯凝膠與發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠SEM 對比圖Fig.6 SEM comparison of soybean lipid gel and germinated soybean lipid gel
質(zhì)構(gòu)可綜合反映凝膠的各項感官品質(zhì),是品評食品優(yōu)劣程度的重要因素之一[33],彈性、硬度、咀嚼性等指標(biāo)越高,豆腐的保溫效果越好,豆腐的斷面越光滑細(xì)膩,口感越好;而黏附性越小,感官品質(zhì)綜合評價越好。將表8中最優(yōu)條件下制作的內(nèi)酯凝膠與普通大豆內(nèi)酯凝膠進(jìn)行TPA 測定和營養(yǎng)物質(zhì)含量測定,見表9、表10。由表9可知,發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠的質(zhì)構(gòu)特性與普通大豆內(nèi)酯凝膠感官品質(zhì)相似,而發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠較普通大豆內(nèi)酯凝膠中的異黃酮和γ-氨基丁酸含量分別提高了66.07%和208.01%。
表9 發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠與普通大豆內(nèi)酯凝膠質(zhì)構(gòu)比較Table 9 Comparison of texture of germinated soybean lactone gel and normal soybean lactone gel
表10 發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠與普通大豆內(nèi)酯凝膠營養(yǎng)物質(zhì)含量比較Table 10 Comparison of nutrient contents between germinated soybean lactone gel and normal soybean lactone gel
本試驗考察了發(fā)芽時間、豆水比、GDL 含量及保溫時間對發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠強(qiáng)度、營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響。在最佳工藝條件下凝膠強(qiáng)度為48.76 g/cm2。發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠與普通大豆內(nèi)酯凝膠微觀結(jié)構(gòu)無顯著差異,質(zhì)構(gòu)特性相近,而發(fā)芽大豆內(nèi)酯凝膠較普通大豆內(nèi)酯凝膠蛋白質(zhì)及脂肪含量略有下降,營養(yǎng)成分異黃酮和γ-氨基丁酸含量均有所提高。因此,使用發(fā)芽大豆制作內(nèi)酯凝膠既可有效提高內(nèi)酯凝膠的營養(yǎng)價值還可較好的保持凝膠的相關(guān)特性。