李愛明，劉 克，王園園，王 乾

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的85%[1, 2]。盡管近年來在癌癥研究和治療方面取得了較大進展，但NSCLC的預后仍然很差，其5年生存率僅為15%[3]。因此，了解NSCLC的發(fā)病機制并確定新的治療靶點非常重要[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與肺癌的發(fā)展密切相關，且有用miRNA陣列實驗發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p在NSCLC組織中的表達顯著下調[5-7]。然而，miR-30a-5p在非小細胞肺癌中的作用和分子機制仍未完全闡明。新式激酶家族1[Novel (nua) kinase family 1，NUAK1]，也稱為KIAA0537/ARK5，已被確定為單磷酸腺苷激活蛋白激酶相關激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase related kinase，ARK)家族的第5個成員[8]。NUAK1可以被Akt直接激活，活化的NUAK1可以在葡萄糖饑餓和死亡受體刺激過程中促進細胞存活[8]。最近有研究表明，NUAK1的高表達與結腸癌的腫瘤進展有關，并且可以通過與p53的直接相互作用來調節(jié)細胞增殖[9]。此外，NUAK1高表達與預后不良相關，并參與NSCLC細胞的遷移和侵襲[8]。然而，NUAK1在NSCLC中的調控機制仍不清楚。本研究將通過研究miR-30a-5p、NUAK1在NSCLC中的表達及miR-30a-5p靶向NUAK1對NSCLC細胞A549增殖、遷移和侵襲的影響，以揭示NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機制，為臨床診斷治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016-09至2019-03我院行手術切除治療的NSCLC患者癌組織和癌旁組織標本各64例，其中男37例，女27例，年齡37～76歲，平均(47.3±10.8)歲；高分化26例，中低分化38例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期24例，Ⅲ/Ⅳ例40例。所有樣本組織均經至少2名病理醫(yī)師診斷為NSCLC，且患者術前未接受任何治療。本研究方案經醫(yī)院倫理學委員會審核批準，受試患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 細胞 人正常肺上皮細胞BEAS-2B和非小細胞肺癌細胞系H460、H1299和A549購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(american type culture collection，ATCC)，保存于我院中心實驗室的液氮罐中。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、F-12K培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、青-鏈霉素、胰蛋白酶溶液購自美國Hyclone公司；Lipofectmine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM購自大連TaKaRa公司；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗、購自上海碧云天生物技術有限公司；pmiRGLO載體、Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒購自美國Promega公司；miR-NC、miR-30a-5p、pcDNA3.1 載體和pcDNA3.1-NUAK1載體購自廣州銳博生物技術有限公司；噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；NUAK1、GAPDH抗體購自美國abcam公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜、增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自德國Merck Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) BEAS-2B和H1299用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，A549用含10%胎牛血清的F-12k培養(yǎng)液培養(yǎng)，H460用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。

1.4.2 細胞轉染 取2×105個對數生長期A549細胞接種于6孔板中，隨機分為4組，每組3個復孔，待細胞融合度達60%時，用Lipofectmine 2000轉染試劑分別將miR-NC、miR-30a-5p、miR-30a-5p聯(lián)合pcDNA 3.1載體或pcDNA 3.1-NUAK1載體轉入A549細胞中，分別記為miR-NC組、miR-30a-5p組、miR-30a-5p+Vector組和miR-30a-5p+NUAK1組，培養(yǎng)48 h后，提取RNA和蛋白進行后續(xù)實驗研究。

1.4.3 qPCR檢測 利用RNAiso plus試劑盒提取非小細胞肺癌樣本和細胞中總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行逆轉錄，SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒上機檢測各個樣本中miR-30a-5p和NUAK1的表達，分別以U6和GAPDH為內參。miR-30a-5p正向引物：5′-CAC TCT CAT GTA AAC ATC CTC GAC-3′，反向引物:5′-TAT GGT TGT TCT GCT CTC TGT GTC-3′；U6正向引物：5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物：5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。NUAK1正向引物：5′-ATG CTA AGT ACC CTC TGA ATG-3′ ，反向引物：5′-GCA ACA AGC AGT CAG TCG ATC-3′；GAPDH正向引物：5′-AAG GTG AAG GTC GGA GTC A-3′，反向引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT T-3′。

1.4.4 Western blot檢測 用RIPA裂解液提取非小細胞肺癌樣本和細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel-electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白樣品，后轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別用NUAK1和GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜，后用Tris緩沖液吐溫20(Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST)洗滌3次，每次10 min，辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后用ECL發(fā)光液孵育條帶并置于化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行曝光顯影，Image J軟件相應蛋白的相對表達水平。

1.4.5 雙熒光素酶報告實驗 用RNAiso plus提取A549細胞總RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄得cDNA，后擴增NUAK1的3′UTR并將其克隆至pmirGLO載體中構建pmirGLO-NUAK1-Wt重組載體。根據TakaRa點突變試劑盒將pmirGLO-NUAK1-Wt中miR-30a-5p的結合位點進行突變，構建pmiRGLO-NUAK1-Mut重組質粒。用Lipofectmine 2000將pmirGLO-NUAK1-Wt/Mut報告載體分別與miR-NC或miR-30a-5p共轉至A549細胞中，48 h后用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.4.6 細胞增殖檢測 取對數生長期的miR-NC組、miR-30a-5p組、miR-30a-5p+Vector組和miR-30a-5p+NUAK1組細胞分別接種于96孔板中，每孔接種4000個細胞，每組設3個復孔，分別于24 h、48 h和72 h時，每孔加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，后棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，用酶標儀震蕩10 min以溶解結晶并檢測490 nm處各孔吸光值。

1.4.7 細胞遷移侵襲檢測 取預鋪基質膠和無預鋪基質膠的Transwell小室置于24孔板中，其中預鋪基質膠的小室每孔加入50 μl無血清培養(yǎng)液潤化30 min，無預鋪基質膠的小室不做任何處理。取1×105個對數生長期的miR-NC組、miR-30a-5p組、miR-30a-5p+Vector組和miR-30a-5p+NUAK1組細胞接種至Transwell小室中，添加無血清培養(yǎng)液至200 μl，下室中加600 μl完全培養(yǎng)液，每組設置3個復孔。培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌2次，100%甲醇固定10 min，晾干，0.1%結晶紫染色10 min，去離子水洗去殘留染液，顯微鏡下觀察并拍照，計數各組遷移侵襲細胞數。

2 結 果

2.1 miR-30a-5p和NUAK1在NSCLC組織中的表達 與癌旁組織相比，NSCLC組織中miR-30a-5p的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NUAK1 mRNA和蛋白表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1，表1)。

圖1 非小細胞肺癌組織中NUAK1蛋白表達

表1 非小細胞肺癌組織和癌旁組織中miR-30a-5p和NUAK1的表達量

2.2 miR-30a-5p和NUAK1在NSCLC細胞中的表達 與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，非小細胞肺癌細胞系H460、H1299和A549中miR-30a-5p相對表達量降低(P<0.05)，NUAK1 mRNA和蛋白相對表達量增加(P<0.05，圖2、表2)。

圖2 非小細胞肺癌細胞中NUAK1蛋白表達A.BEAS-2B；B.H460；C.H1299；D.A549

表2 人正常肺上皮細胞BEAS-2B和非小細胞肺癌細胞系H460、H1299和A549中miR-30a-5p和NUAK1的表達

2.3 miR-30a-5p與NUAK1靶向結合 利用TargetScan網站預測發(fā)現(xiàn)NUAK1可能是miR-30a-5p的潛在靶基因(圖3)。與miR-NC組(1.00±0.09)相比，miR-30a-5p組后A549細胞中miR-30a-5p表達量(4.23±0.42)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.025，P<0.05)。miR-30a-5p組A549細胞中NUAK1-Wt熒光素酶活性(0.45±0.05)較miR-NC組(1.00±0.09)顯著降低(t=9.253，P<0.05)，而miR-30a-5p組NUAK1-Mut熒光素酶活性(0.96±0.09)與miR-NC組(1.01±0.10)比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.644，P>0.05)。

圖3 預測的miR-30a-5p與NUAK1 3′UTR結合位點

2.4 miR-30a-5p可抑制A549細胞中NUAK1蛋白表達 與miR-NC組(0.62±0.06)相比，miR-30a-5p組中NUAK1蛋白相對表達量(0.26±0.03)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.295，P<0.05)。miR-30a-5p+NUAK1組A549細胞中NUAK1蛋白相對表達量(1.08±0.11)明顯高于miR-30a-5p+Vector組(0.24±0.02)，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.013，P<0.05，圖4)。

圖4 過表達miR-30a-5p及聯(lián)合過表達NUAK1后A549細胞中NUAK1蛋白表達

2.5 miR-30a-5p對A549細胞增殖的影響 48 h和72 h時miR-30a-5p組吸光度值低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.157、6.875，P<0.05)，miR-30a-5p+NUAK1組吸光度值高于miR-30a-5p+Vector組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.118、6.245，P<0.05，表3)。

表3 過表達miR-30a-5p及聯(lián)合過表達NUAK1后A549細胞的相對吸光度值

A.miR-NC組；B.miR-30a-5p組；C.miR-30a-5p+Vector組；D.miR-30a-5p+NUAK1組

2.6 miR-30a-5p對A549細胞遷移侵襲的影響 miR-NC組、miR-30a-5p組、miR-30a-5p+Vector組及miR-30a-5p+NUAK1組遷移細胞數分別為124±21、65±12、54±13和131±24(圖5A)，侵襲細胞數分別為103±17、43±11、46±10和96±15(圖5B)。miR-30a-5p組遷移侵襲細胞數低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.255、5.132，P<0.05)，miR-30a-5p+NUAK1組遷移侵襲細胞數高于miR-30a-5p+Vector組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.886、4.804，P<0.05)。

圖5 過表達miR-30a-5p及聯(lián)合過表達NUAK1對A549細胞遷移侵襲能力的影響

3 討 論

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是小的非編碼RNA，由19～25個核苷酸組成。 MiRNA可以通過與3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結合而負調控靶基因的表達[10]。大量研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生的所有步驟中都可以充當腫瘤抑制因子或致癌基因[11]。MiR-30a-5p位于6q.13號染色體上，由內含子轉錄產生兩種成熟形式的miR-30a，分別為miR-30a-3p和miR-30a-5p[12]。MiR-30a-5p在多種惡性腫瘤中失調，例如乳腺癌[13]、肝細胞癌[14]、結腸癌[15]、鼻咽癌[16]、前列腺癌[17]、子宮內膜癌[18]及皮膚癌鱗狀細胞癌[19]。在肺癌中，Tang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a的低表達與肺癌預后不良有關。Zhu等[3, 5]通過NSCLC組織中microRNAs的表達譜分析發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p表達下調，過表達miR-30a-5p可通過靶向CD73/NT5E抑制NSCLC細胞增殖。上述研究表明，在非小細胞肺癌中miR-30a-5p是一個抑癌miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p在NSCLC樣本和細胞中低表達，過表達miR-30a-5p可抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲，與Zhu等[3, 5]研究結果一致。

NUAK1也稱為ARK5，是單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)家族的成員[20]。最近的研究證據表明，NUAK1與腫瘤的進展密切相關。據報道，NUAK1是介導人胰腺癌細胞中癌細胞遷移活性的關鍵分子。 Gen-Ichi等[21]報道NUAK1的高表達在臨床上參與了結腸癌的腫瘤進展。此外，NUAK1在乳腺癌、胃癌和卵巢癌等惡性腫瘤中高表達，且NUAK1高表達與腫瘤患者預后較差有關[22-24]。最近，Xu等[25]證明NUAK1通過誘導上皮-間充質轉化賦予肝細胞癌多柔比星耐藥性，Lu等[26]證明NUAK1的上調促進了神經膠質瘤的侵襲。盡管這些研究發(fā)現(xiàn)NUAK1在癌癥進展中的重要性，但其在NSCLC中的作用仍有待研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織和細胞中NUAK1高表達，NUAK1是miR-30a-5p的靶基因，過表達NUAK1可逆轉miR-30a-5p對非小細胞肺癌細胞A549增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，本研究證實在NSCLC組織和細胞中miR-30a-5p低表達，NUAK1高表達，miR-30a-5p可通過靶向NUAK1來抑制NSCLC細胞A549增殖、遷移和侵襲，進一步揭示了NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機制，可能為NSCLC的診斷和治療提供新的靶點。