秦 鑫，王亞東，李紅梅，李 冉，王 暄

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095)

短體線蟲(Pratylenchus)，又稱根腐線蟲(root-lesion nematodes)，是一類寄主眾多、分布廣泛的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，能夠侵染植物地下組織，引起組織腐爛壞死，并影響植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，同時(shí)短體線蟲造成的傷口為病原真菌和細(xì)菌的侵染提供便利[1]，引起復(fù)合病害的發(fā)生，進(jìn)一步加重經(jīng)濟(jì)損失，因此，短體線蟲也是全球10種最具破壞性的植物寄生線蟲之一[2]。近年來，在黃淮麥區(qū)孢囊線蟲(cereal cyst nematodes，CCN)發(fā)生分布的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，小麥根系及根際土壤中普遍存在短體線蟲和孢囊線蟲混合發(fā)生的現(xiàn)象[3-4]，劉海璐等[5]對(duì)采自中國(guó)江蘇、河南、山東和安徽4省麥區(qū)的10個(gè)短體線蟲樣品進(jìn)行分子鑒定，擴(kuò)增了核糖體rDNA(rDNA)18S、28S D2-D3和線粒體DNA(mtDNA)COI基因片段并測(cè)序，通過序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析明確了黃淮麥區(qū)短體線蟲種類有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲3個(gè)種，并證實(shí)了不同種群復(fù)合侵染小麥的現(xiàn)象較為普遍。短體線蟲和孢囊線蟲復(fù)合侵染的普遍發(fā)生將會(huì)進(jìn)一步加重中國(guó)小麥產(chǎn)量的損失，對(duì)中國(guó)糧食生產(chǎn)安全造成潛在的嚴(yán)重威脅。

短體線蟲屬種類比較多，迄今為止，已確定的有效種有104個(gè)[6-7]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定需要足夠數(shù)量的成蟲用于形態(tài)學(xué)特征比較和測(cè)計(jì)，尤其當(dāng)樣品中存在短體線蟲混合種群時(shí)，需要先將不同的種區(qū)分后再依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，因此操作較為繁瑣且鑒定周期相對(duì)較長(zhǎng)[5]。此外，短體線蟲屬種類間的形態(tài)鑒別特征較少，種群內(nèi)常存在形態(tài)特征的變異，容易導(dǎo)致種類鑒定出現(xiàn)偏差[8]。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和PCR技術(shù)的普及，為短體線蟲種類的鑒定提供了有效的技術(shù)手段。Janssen等[6]通過分析核糖體rDNA的 28S、ITS和mtDNA-COI(mtCOI)基因序列，澄清了穿刺短體線蟲(P.penetrans)、偽短體線蟲(P.fallax)以及鈴蘭短體線蟲(P.convallariae)的分類爭(zhēng)議，并且通過比較這3個(gè)基因區(qū)域的序列，認(rèn)為mtDNA-COI基因是短體線蟲的一條可靠的條形碼標(biāo)記。劉海璐等[5]基于mtCOI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以有效地區(qū)分短體線蟲的近緣種，相比 rDNA 18S 和 28S 基因更適于短體線蟲種類的分子鑒定。因此，本研究利用mtCOI基因分子標(biāo)記對(duì)采自中國(guó)12個(gè)省(市、自治區(qū))的42個(gè)小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行鑒定，以探明中國(guó)小麥種植區(qū)短體線蟲的種類以及地理分布，為今后小麥短體線蟲的田間檢測(cè)以及制定小麥根部線蟲病害的防控策略提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

在2018年1-5月小麥生長(zhǎng)期間，通過五點(diǎn)采樣法隨機(jī)采集中國(guó)江蘇、安徽、河南、山東、河北、湖北、天津、陜西、山西、新疆、甘肅和青海省(市、自治區(qū))的小麥苗和根圍土壤樣品；采用淺盤法分離各樣品中的線蟲，收集線蟲懸浮液，在體視顯微鏡下觀察懸浮液中的線蟲，隨機(jī)挑取短體線蟲制成臨時(shí)破片，在光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)特征，共采集到42個(gè)小麥短體線蟲樣品，各樣品的采集地點(diǎn)和地理信息見表1。

1.2 單條線蟲DNA的提取

從42個(gè)樣品的線蟲分離液中，各隨機(jī)挑取 3～5條短體線蟲，用于DNA分子鑒定。單條線蟲DNA的提取參照宋志強(qiáng)等[9]的方法，將單條線蟲挑入滅菌ddH2O水滴中清洗1～2次后，挑取線蟲放入加有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)的200 μL PCR管中，液氮中冷凍2 min后，65 ℃處理4 min，重復(fù)3次；加入 1 μL 10 μg·μL-1蛋白酶K，65 ℃溫育1 h， 95 ℃處理10 min后，將得到的DNA粗提液置于 -20 ℃保存，備用。

1.3 短體線蟲mtCOI基因片段的擴(kuò)增

以上述各樣品的單條短體線蟲DNA樣本為模板，用通用引物JB3(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和JB5(5′-AGCACCTAAACTTAAAACATAATGAAAATG-3′)[10]擴(kuò)增mtCOI基因片段，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板為1 μL，5 μmol·L-1的上、下游引物各2 μL，2×Ex Taq Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將所有擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物公司進(jìn)行純化和 測(cè)序。

1.4 短體線蟲mtCOI序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測(cè)序所得的短體線蟲mtCOI序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)并提交GenBank獲得序列號(hào)，下載有關(guān)短體線蟲種類的同源序列，進(jìn)行序列相似度分析。同時(shí)將所測(cè)的短體線蟲與已報(bào)道的不同短體線蟲的mtCOI序列利用軟件Geneious 7.1.4(Biomatters；http://www.geneious.com)[11]整理，去除同源性較低的位點(diǎn)。用在線軟件TranslatorX[12](http://translatorx.co.uk)選擇無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體遺傳密碼，采用氨基酸編碼序列比對(duì)mtCOI序列。用軟件jModelTest2[13]進(jìn)行核苷酸替換模型的評(píng)估，在赤池信息準(zhǔn)則(Akaike Information Criterion，AIC)下選擇模型GTR+I+G為構(gòu)建mtCOI系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的最佳模型。在CIPRES Science Gateway (www.phylo.org)運(yùn)算平臺(tái)上，用MrBayes 3.2.3[14]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹，在4條馬爾科夫鏈(Markov Chain)下獨(dú)立進(jìn)行3條熱鏈和1條冷鏈的1×106次運(yùn)行，每1 000代取樣一次且“burn-in”值設(shè)置為25%，采用多數(shù)一致(50%)原則，通過軟件FigTreev.1.4.3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的可視化處理。

1.5 小麥短體線蟲種類的鑒定和地理分布分析

根據(jù)mtCOI序列的比對(duì)、序列相似度和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果，對(duì)采集自12個(gè)省(市、自治區(qū))的42個(gè)小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行鑒定，并對(duì)短體線蟲種類發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥短體線蟲種類的形態(tài)鑒定結(jié)果

對(duì)采自12個(gè)省(市、自治區(qū))的42個(gè)小麥根圍和土樣樣品進(jìn)行線蟲分離后，分別從各樣品中隨機(jī)挑取約20條短體線蟲通過顯微鏡觀察其形態(tài)特征，同時(shí)查閱多岐檢索表及核對(duì)有關(guān)參考文獻(xiàn)[1]，發(fā)現(xiàn)這42個(gè)樣品主要含3種短體線蟲，分別為咖啡短體線蟲(P.coffeae)、落選短體線蟲(P.neglectus)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)，它們之間最主要的區(qū)別在于雌蟲的尾部和側(cè)帶區(qū)形態(tài)特征(圖1～圖3)。

咖啡短體線蟲的雌蟲唇區(qū)較低平，與體壁稍微縊縮，唇環(huán)2個(gè)；口針相對(duì)強(qiáng)壯，基部球圓形(圖1A)；中食道球卵圓形，食道腺長(zhǎng)葉狀，腹面覆蓋腸(圖1B)；后陰子宮囊是陰門處體寬的1.0～ 1.5倍(圖1C)；尾圓錐形，末端寬圓，或平截，或缺刻，頂端無(wú)環(huán)紋(圖1D)；側(cè)帶區(qū)一般4～5條側(cè)線，偶爾6條(圖1E)。

A：體前端；B：食道；C：陰門；D：尾；E：側(cè)線(標(biāo)尺= 10 μm)。圖2和圖3同。

落選短體線蟲的雌蟲唇區(qū)前部輪廓呈角狀，唇環(huán)2個(gè)；頭架中度骨化，口針發(fā)達(dá)，中等長(zhǎng)度，口針基部球較寬，前端平或凹陷(圖2A)；中食道球發(fā)達(dá)，食道腺覆蓋腸(圖2B)；后陰子宮囊約等于陰門處體寬(圖2C)；尾端錐形，末端圓，頂端光滑(圖2D)；側(cè)帶區(qū)一般4條側(cè)線(圖2E)。

圖2 落選短體線蟲雌蟲的光學(xué)顯微鏡照片

斯克里布納短體線蟲的雌蟲唇區(qū)較低略縊縮，唇環(huán)2個(gè)；頭骨化明顯，口針強(qiáng)壯，口針基部球圓，前端凹陷(圖3A)；中食道球卵圓形，食道腺覆蓋腸，覆蓋長(zhǎng)度中等(圖3B)；后陰子宮囊中等長(zhǎng)度，通常大于陰門處體寬(圖3C)；尾寬圓，或半圓，頂端平滑，沒有缺刻(圖3D)；側(cè)帶區(qū)一般4條側(cè)線(圖3E)。

圖3 斯克里布納短體線蟲雌蟲的光學(xué)顯微鏡照片

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在同一樣品中如果有短體線蟲混合種群發(fā)生時(shí)，單純依靠形態(tài)特征觀察、測(cè)計(jì)值比較和文獻(xiàn)核查進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定，很難將咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲準(zhǔn)確區(qū)分開，因此本研究對(duì)42個(gè)樣品的種類進(jìn)行了分子鑒定。

2.2 短體線蟲樣品的mtCOI基因片段擴(kuò)增結(jié)果

以42個(gè)短體線蟲樣品中隨機(jī)挑取的單條線蟲DNA為模板，分別用通用引物JB3/JB5擴(kuò)增mtCOI基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均得到1條約440 bp的條帶(部分結(jié)果見圖4)。將所有的擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后所有序列的長(zhǎng)度為412～432 bp。

M:DNA marker DL2000; 1～24:來自不同樣品的單條線蟲。 1-24：Individual nematodes from different Pratylenchus samples.

2.3 短體線蟲種群的mtCOI序列分析

將測(cè)序獲得的短體線蟲mtCOI序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并與GenBank下載的來自不同國(guó)家不同短體線蟲種群mtCOI序列進(jìn)行比對(duì)和相似度分析。結(jié)果顯示，有9條短體線蟲的序列與咖啡短體線蟲日本群體(GenBank登錄號(hào)KU198942和KU198943)和中國(guó)群體(GenBank登錄號(hào)KY424072和KY424073)序列相似度最高，為98.8%～100%，這9條短體線蟲的序列差異值為0.000，序列相似度為100%；有30條短體線蟲的序列與落選短體線蟲玻利維亞群體(KU198940)、美國(guó)群體(KU198941)和中國(guó)群體(KX349423和KY424104)序列相似度最高，達(dá)96.5%～99.3%，這30條短體線蟲的序列差異值為0.000～0.037，相似度為96.3%～100%；有13條短體線蟲的序列與斯克里布納短體線蟲中國(guó)群體(KY424090)序列的相似度為95.0%～ 98.7%，這13條短體線蟲的序列差異值為 0.000～0.007，相似度為99.3%～100%。序列比對(duì)和相似度分析揭示，來自中國(guó)12個(gè)省(市、區(qū))的42個(gè)短體線蟲樣品中主要有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲3個(gè)種，并且樣品中存在單一種群侵染和復(fù)合種群侵染的現(xiàn)象。42個(gè)短體線蟲樣品的種群及其代碼見表1。

表1 小麥短體線蟲樣品的采集信息和種類鑒定

2.4 短體線蟲種群系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將測(cè)序所得的短體線蟲mtCOI序列(代碼見表1)與從NCBI下載的來自美國(guó)、英國(guó)、日本、南非和玻利維亞等國(guó)家的不同短體線蟲種群的mtCOI序列進(jìn)行比對(duì)后構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇北方根結(jié)線蟲(Meloidogynehapla)和山茶根結(jié)線蟲(M.camelliae)作為外群。從圖5可以看出，有30個(gè)短體線蟲種群(即：安徽種群AH8-2等，河南種群HN4-2等，山東種群SD2-1等，江蘇種群JS3-2等，天津種群TJ1-1等，山西種群SXY1-1，陜西種群SX1-4等，甘肅種群GS1-1等，青海種群QH1-1以及新疆種群XJ3-1等)與落選短體線蟲中國(guó)、美國(guó)、玻利維亞群體聚類在一個(gè)大分支，置信度達(dá)到100%。在這個(gè)大分支中有兩個(gè)明顯的亞分支，其中，有8個(gè)種群(GS1-1、GS2-1、QH1-1、SX3-2、TJ1-1、TJ2-1、XJ3-1和XJ7-1)與落選短體線蟲中國(guó)群體(KX349423和KY424104)、美國(guó)群體(KU198941)以及玻利維亞群體(KU198940)聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到84%，其他22個(gè)種群則聚在另一個(gè)亞分支。

從圖5還可以看出，有9個(gè)短體線蟲種群(安徽種群AH6-1等，山東種群SD6-1，河北種群HEB1-1以及湖北種群HUB1-1)與咖啡短體線蟲日本群體(KU198942 和KU198943)和中國(guó)群體(KY424072和KY424073)聚類在一個(gè)分支，置信度達(dá)到100%。此外，HN4-1、SD4-2、SX2-1等13個(gè)種群均與斯克里布納短體線蟲中國(guó)群體(KY424090)聚類在同一個(gè)分支，置信度達(dá)到100%。

圖5 基于mtDNA-COI序列構(gòu)建的中國(guó)小麥短體線蟲種群Bayesian系統(tǒng)進(jìn)化樹

總之，通過貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，進(jìn)一步證實(shí)了采自中國(guó)12個(gè)省(市、自治區(qū))的42個(gè)短體線蟲樣品中有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲這3個(gè)種。

2.5 中國(guó)小麥短體線蟲的種類發(fā)生和地理分布

根據(jù)mtCOI序列的分子鑒定結(jié)果，對(duì)42個(gè)短體線蟲樣品的種類發(fā)生情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)落選短體線蟲單一侵染樣品有21個(gè)，占總樣品數(shù)的50%，是中國(guó)麥區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品分別有6個(gè)和5個(gè)，分別占總樣品數(shù)的14.3%和 11.9%。短體線蟲的兩兩復(fù)合侵染樣品有10個(gè)，占總樣品數(shù)的23.8%，其中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有7個(gè)，而咖啡短體線蟲分別與落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有2個(gè)和1個(gè)。無(wú)論是單一種群侵染還是復(fù)合種群侵染，落選短體線蟲都呈現(xiàn)明顯的種群優(yōu)勢(shì)。

此外，在安徽省的7個(gè)樣品中，咖啡短體線蟲和落選短體線蟲單一侵染樣品分別有4個(gè)和1個(gè)，二者復(fù)合侵染的樣品有2個(gè)，咖啡短體線蟲為安徽省的優(yōu)勢(shì)種群；在河南省的5個(gè)樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染的樣品分別有2個(gè)和1個(gè)，二者復(fù)合侵染的樣品有2個(gè)；在山東省5個(gè)樣品中，咖啡短體線蟲和落選短體線蟲單一侵染的樣品分別有1個(gè)和2個(gè)，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有2個(gè)；在陜西省的4個(gè)樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品各1個(gè)，二者復(fù)合侵染的樣品有2個(gè)；在江蘇省的2個(gè)樣品中，1個(gè)為落選短體線蟲單一侵染，1個(gè)為落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染；在湖北省僅采集的1個(gè)樣品是咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲的復(fù)合侵染；在河北省采集的樣品中，咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品各有1個(gè)；在新疆采集的樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品分別有7個(gè)和2個(gè)；而天津、山西、甘肅和青海4省的7個(gè)樣品均為落選短體線蟲單一侵染。

總之，落選短體線蟲在華東、華中和西北地區(qū)都有廣泛分布，是中國(guó)麥區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，咖啡短體線蟲主要分布在華東地區(qū)，而斯克里布納短體線蟲雖然不是優(yōu)勢(shì)種群，但是分布比較廣泛，在安徽、河南、山東、江蘇、河北、湖北、陜西和新疆等省都有零星發(fā)生。

3 討 論

國(guó)外已有大量關(guān)于短體線蟲危害麥類作物的報(bào)道，種類主要包括六裂短體線蟲(P.hexincisus)、盧斯短體線蟲(P.loosi)、落選短體線蟲(P.neglectus)、穿刺短體線蟲(P.penetrans)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)、桑尼短體線蟲(P.thornei)和玉米短體線蟲(P.zeae)等，其中對(duì)小麥危害較大的是落選短體線蟲、穿刺短體線蟲和桑尼短體線蟲[15]。中國(guó)安徽、四川、廣西、河南和西藏等地也有短體線蟲危害小麥的報(bào)道，已知種類包括落選短體線蟲、穿刺短體線蟲、咖啡短體線蟲、玉米短體線蟲、盧斯短體線蟲、敏捷短體線蟲(P.agilis)和草地短體線蟲(P.pratensis)等[5]。劉海璐等[5]對(duì)采自黃淮流域的江蘇、山東、河南和安徽4省的10個(gè)小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行了分子鑒定。

本研究在劉海璐等[5]的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)采自華東、華北和西北地區(qū)的12個(gè)省(市、自治區(qū))的42個(gè)短體線蟲進(jìn)行了鑒定，更加明確了短體線蟲種類在中國(guó)的發(fā)生分布情況。李廣帥等[16]對(duì)從河南省9個(gè)地區(qū)采集的23個(gè)小麥短體線蟲進(jìn)行了分子鑒定，認(rèn)為有15個(gè)樣品為敏捷短體線蟲(P.agilis)，其他均為盧斯短體線蟲(P.loosi)，劉海璐等[5]對(duì)采自河南商丘的3個(gè)樣品進(jìn)行了鑒定，并未發(fā)現(xiàn)上述2種短體線蟲，本研究中采自河南的5個(gè)樣品中也未發(fā)現(xiàn)李廣帥等[16]發(fā)現(xiàn)的2種短體線蟲，據(jù)此本研究推測(cè)這些樣品的鑒定結(jié)果不同可能與采樣地點(diǎn)不同有關(guān)。綜合劉海璐等[5]和本研究的分析檢測(cè)，可以得知咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲這3種短體線蟲在江蘇、山東、河南和安徽4省的不同地區(qū)都有發(fā)生。

綜上所述，本研究采自12個(gè)省(市、自治區(qū))的小麥短體線蟲種類主要有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲，其中，落選短體線蟲是優(yōu)勢(shì)種群，在華東、華中和西北地區(qū)都有廣泛分布，咖啡短體線蟲主要分布在華東地區(qū)，而斯克里布納短體線蟲地理分布比較廣泛，在安徽、河南、山東、江蘇、河北、湖北、陜西和新疆等省都有零星分布。本研究基本明確了中國(guó)小麥主要種植省份的短體線蟲種類分布情況，為小麥短體線蟲病的防治提供了理論指導(dǎo)。