李洪雨，劉小娟，梁東玉，劉登才，郝 明，袁中偉，甯順腙，張連全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

普通小麥馴化過程中經(jīng)歷了嚴重的進化瓶頸，導(dǎo)致遺傳變異資源的丟失[1]?，F(xiàn)代育種導(dǎo)致小麥遺傳多樣性進一步降低，遺傳基礎(chǔ)變得越來越狹窄[2]。因此，挖掘小麥屬及其近緣屬物種中優(yōu)異的基因資源，并將其轉(zhuǎn)入普通小麥顯得尤為重要[1]。烏拉爾圖小麥(T.urartu,AuAu,2n=2x=14)最早在1937年被發(fā)現(xiàn)[3]，它是四倍體小麥和六倍體小麥A基因組的供體[4]，易與小麥同源染色體發(fā)生聯(lián)會和交換，并將其優(yōu)異基因?qū)肫胀ㄐ←溁蚪M中。烏拉爾圖小麥蛋白質(zhì)含量較高，具有能改善小麥面粉加工品質(zhì)的新型高分子量谷蛋白亞基和醇溶蛋白基因[5-7]，同時還具有早熟、抗旱、抗病、抗逆等優(yōu)異性狀[3,8-10]，將這些基因或優(yōu)異性狀異入普通小麥有利于普通小麥的遺傳改良。

烏拉爾圖小麥遺傳物質(zhì)向普通小麥轉(zhuǎn)移的途徑主要有兩種：一是烏拉爾圖小麥與普通小麥直接雜交[11-12]；二是以硬粒小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體為“橋梁”進行轉(zhuǎn)移[13-14]。2014-2015年本課題組利用中國的3個四倍體小麥地方品種圓錐小麥為母本，國外引進的4個烏拉爾圖小麥為父本進行雜交，獲得雜種F1，然后利用0.1%秋水仙素溶液進行加倍處理，成功獲得了4份圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體。本研究擬對這4份新合成的雙二倍體的染色體組成、農(nóng)藝性狀及高分子量谷蛋白亞基組成進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料，包括普通小麥SY95-71和4份圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體(Syn-TAU-1、Syn-TAU-2、Syn-TAU-3和Syn-TAU-4)及其親本圓錐小麥和烏拉爾圖小麥(表1)。圓錐小麥(T.turgidumL. ssp.turgidum)AS2313、AS2380和AS2382均是中國四倍體小麥地方品種；烏拉爾圖小麥TA#831來自于伊朗，PI428224來自于土耳其，PI428270和PI428274來自于黎巴嫩。雙二倍體是以圓錐小麥為母本與烏拉爾圖小麥為父本進行遠緣雜交，雜種F1植株通過0.1%秋水仙素溶液加倍處理獲得S1代。其中PI編號的材料由美國國家種質(zhì)資源庫 (http://www.ars-grin.gov)提供，其他材料均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供。條銹病混合菌種(條種31、條種32、條種33、條種34和水源11-4生理小種)由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

小麥成熟期，隨機選取每個材料的10個單株進行株高(株高是地面到穗頂部之間除去芒的高度)、分蘗數(shù)、穗長、每穗小穗數(shù)(不包括無效小穗)、穗粒數(shù)(第一和第二小花的結(jié)實粒數(shù))和自交結(jié)實率等性狀的測量。自交結(jié)實率=穗粒數(shù)/(2×總小穗數(shù))× 100%。利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.3 條銹病鑒定

所有材料均種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江實驗基地。成株期的條銹病抗性田間鑒定在2015-2016年小麥生長季節(jié)進行。實驗材料行距30 cm，行長1 m，株距10 cm，誘發(fā)材料SY95-71種植于實驗行的兩側(cè)，用于條銹病的接種和誘發(fā)。在小麥成株期，使用條銹菌混合菌種(條中31、條中32、條中33、條中34和水源11-4生理小種)進行田間接種。在誘發(fā)材料充分發(fā)病時，調(diào)查每個材料旗葉和倒二葉的發(fā)病程度(反應(yīng)型)，每隔 10 d調(diào)查一次，調(diào)查三次，反應(yīng)型參照Wellings等[15]的標準劃分為1～9級(1～2為高抗，3為抗病，4為中抗，5為中間型，6～7為中感，8為感病，9為高感)。

1.4 細胞學(xué)觀察

根尖體細胞及花粉母細胞染色體數(shù)目的觀察參照Zhang等[16]的方法。熒光原位雜交操作參照Tang等[17]和Zhao等[18]的方法，寡核苷酸序列探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa71-2、pTa-713及簡單重復(fù)序列探針(AAC)5由成都擎科公司合成(中國，成都)。使用奧林巴斯BX63熒光顯微鏡進行雜交信號檢測，奧林巴斯DP70 CCD相機進行圖像采集。A和Au基因組染色體的鑒定參照Badaeva等[19]、Zeng等[20]、Li等[21]的方法，B基因組染色體的鑒定參照Li等[21]的方法。對雙二倍體的花粉母細胞減數(shù)分裂中期I染色體進行觀察時，選擇50個細胞統(tǒng)計單價體(I)、二價體(II)、三價體(III)和四價體(IV)的個數(shù)并計算平均數(shù)。

1.5 SDS-PAGE分析

種子高分子量谷蛋白的提取和SDS-PAGE分析參照 Yan等[22]的方法。標準高分子量谷蛋白亞基對照為川育12 (1，7+8，5+10)，中國春(null，7+8，2+12)和龍輻麥1號(2*，7+8，5+10)，每份圓錐小麥-烏拉爾小麥雙二倍體均選擇5粒種子進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙二倍體農(nóng)藝性狀及條銹病成株抗性

新合成的圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體植株生長旺盛 (圖1a)，穗子變長 (圖1b)。4份雙二倍體的株高介于108.45～129.43 cm，分蘗數(shù)介于7.3～17.5個，穗長介于10.23～12.17 cm，小穗數(shù)介于16.26～22.06個，自交結(jié)實率介于37.77%～70.46%(表1)。在成株期，4份雙二倍體與誘發(fā)材料SY95-71相比，均高抗條銹病(表1和圖2)。前期的觀察結(jié)果表明，4份雙二倍體的親本中，除烏拉爾圖小麥PI428274高感條銹病外，其他3份烏拉爾圖小麥均抗條銹病，而3份圓錐小麥均高抗條銹病，因此雙二倍體Syn-TAU-1、Syn-TAU-2和Syn-TAU-3中的條銹病抗性無法確定是來自圓錐小麥還是烏拉爾圖小麥，只有Syn-TAU-4的條銹病抗性確定來自圓錐小麥。

a：普通小麥 SY95-71；b：Syn-TAU-1；c：Syn-TAU-2；d：Syn-TAU-3；e：Syn-TAU-4。

表1 圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體的農(nóng)藝性狀及條銹病抗性

a、b：從左到右依次為雙二倍體Syn-TAU-1的親本圓錐小麥AS2313、Syn-TAU-1及親本烏拉爾圖小麥PI428224。

2.2 雙二倍體的染色體觀察

4份圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體的根尖體細胞染色體數(shù)目觀察結(jié)果表明，28株植株中有24株染色體數(shù)目為42條，3株植株染色體數(shù)目為41條，1株植株染色體數(shù)目為40條(表2)。利用寡核苷酸序列探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa71-2、Oligo-pTa535-1、pTa-713和(AAC)5對42條染色體的植株進行了多色FISH鑒定。

紅色標記的探針Oligo-pSc119.2-1在B基因組所有染色體上均有很強的熒光信號，在A基因組的染色體4A長臂的端部有較強的熒光信號。黃色標記的探針Oligo-pTa71-2在1BS和6BS染色體的亞端部區(qū)有很強的熒光信號(圖3)。綠色標記的探針Oligo-pTa535-1、紅色標記的探針pTa-713和綠色標記的重復(fù)序列探針(AAC)5結(jié)合可以用來區(qū)分Au和A基因組的所有染色體(圖3)。探針Oligo-pTa535-1在A和Au基因組的所有染色體上都有熒光信號，但在染色體3A與3Au、4A與4Au上的熒光信號不同。探針pTa-713在染色體1A和1Au上熒光信號不同，在染色體1A的近著絲粒區(qū)域有熒光信號，而在染色體1Au的長臂亞端部有熒光信號；在染色體5A和6A短臂的端部有熒光信號，而在染色體5Au和6Au上沒有熒光信號。重復(fù)序列探針(AAC)5在染色體7A和7Au上熒光信號不同(圖3a)，在染色體7A和7Au的著絲粒位置均有熒光信號，但在染色體7Au上的熒光信號更強，且在長臂上有較弱的信號；在2A染色體短臂近著絲粒區(qū)有很強的熒光信號，但在2Au染色體上沒有信號。因此，Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa71-2、Oligo-pTa535-1、pTa-713和(AAC)5這五個探針結(jié)合可以用來區(qū)分圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體的42條染色體(圖3a)。

a圖為Syn-TAU-1及其親本A、B和Au染色體組的FISH核型圖；b、c、d圖依次為Syn-TAU-1、PI428224(T.urartu )、AS2313(T.turgidum ssp.turgidum )的FISH鑒定；寡核苷酸序列探針為Oligo-pSc119.2-1 (紅色),Oligo-pTa535-1 (綠色),Oligo-pTa71-2 (黃色),pTa-713 (紅色) 和(AAC)5 (綠色)。

對染色體數(shù)為42條的雙二倍體植株進行花粉母細胞減數(shù)分裂中期I觀察，結(jié)果表明，42條染色體大多配對成二價體(85.09%～97.10%)，存在少量的單價體(1.00%～2.60%)、三價體(0.40%～ 10.00%)和四價體(0.00～3.40%)(圖4，表2)，這些多價體的存在說明A和Au染色體發(fā)生了配對。

a：Syn-TAU-1，具有 18個二價體、1個四價體和2個單價體；b：Syn-TAU-2，具有 20個二價體、1個三價體和1個單價體；c：Syn-TAU-3，具有 17個二價體和2個四價體；d：Syn-TAU-4，具有 17個二價體、1個三價體、1個四價體和1個單價體。短箭頭、三角箭頭和長箭頭分別指示單價體、三價體和四價體。

表2 圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體染色體構(gòu)型

2.3 SDS-PAGE 分析

已有研究表明[23]，PI428224的高分子量谷蛋白亞基組成為Glu-Au1-II(圖5，泳道1)，TA# 831的高分子量谷蛋白亞基組成為Glu-Au1-III(圖5，泳道4)，PI428270和PI428274高分子量谷蛋白亞基組成為Glu-Au1-VII(圖5，泳道7和10)。其中，2份烏拉爾圖小麥PI428224和TA#831的1Ax亞基的遷移率均與1Ax2*相同，而四倍體小麥AS2313的亞基為1Ax2*，所以無法確定雙二倍體Syn-TAU-1和Syn-TAU-2的1Ax亞基是來自親本烏拉爾圖小麥還是四倍體小麥(圖5，泳道2和泳道5)。除PI428224的1Ay亞基不表達外，其他3份烏拉爾圖小麥的1Ay亞基均能表達，但其遷移率均慢于中國春的亞基1Dy12。其中，來自于TA#831的1Ay亞基在雙二倍體Syn-TAU-2中得到了表達，但在雙二倍體中其遷移率發(fā)生了變化(圖5，泳道5)；來自于PI428270和PI428274的1Ax和1Ay亞基分別在雙二倍體Syn-TAU-3和Syn-TAU-4中得到了表達(圖5，泳道8和泳道11)。

CS：中國春；CY12：川育12；LM1：龍輻麥1號；1:PI428224;2:Syn-TAU-1;3:AS2313;4:TA#831;5:Syn-TAU-2;6:AS2313;7:PI428270;8:Syn-TAU-3;9:AS2380;10:PI428274;11:Syn-TAU-4;12:AS2382. 黑色箭頭指示烏拉爾圖小麥的1Ax亞基，白色箭頭指示烏拉爾圖小麥的1Ay亞基，綠色箭頭指示在合成雙二倍體中遷移率發(fā)生了變化的來自烏拉爾圖小麥的1Ay亞基。

3 討 論

烏拉爾圖小麥具有豐富的未被開發(fā)利用的遺傳多樣性[13]。雖然與普通小麥直接雜交可以導(dǎo)入烏拉爾圖小麥的優(yōu)異基因，但是該方式存在一定的局限性，比如普通小麥與烏拉爾圖小麥雜交不能正常結(jié)實，必須通過幼胚拯救才能獲得雜種苗，雜種F1自交高度不育，回交結(jié)實率很低[11]。研究表明，人工合成的雙二倍體不但是檢測和轉(zhuǎn)移新性狀的永久資源，而且經(jīng)改良也可以成為新物種[24]。硬粒小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體已被成功合成[13-14]，通過種內(nèi)雜交豐富了二倍體烏拉爾圖小麥的多樣性，為小麥育種提供了兼聚硬粒小麥和二倍體祖先抗性基因的獨特方法[21]。本課題組前期獲得的4份圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體不同于前人獲得的硬粒小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體，為小麥育種提供了新的資源。

條銹病是嚴重影響全球小麥產(chǎn)量的病害之一。新的條銹菌生理小種CYR34 (V26)的出現(xiàn)和流行使得中國許多小麥品種喪失了抗性，因此，種植新的抗性種質(zhì)資源[25]是防治條銹病最經(jīng)濟有效的措施。本課題組前期獲得的4份新合成雙二倍體在成株期均對中國小麥條銹菌當前流行小種表現(xiàn)高抗。由于親本圓錐小麥AS2313、AS2380和AS2382均高抗條銹病，因此我們無法確定來自于烏拉爾圖小麥的抗性基因是否在雙二倍體Syn-TAU-1、Syn-TAU-2和Syn-TAU-3中正常表達。這些新合成的雙二倍體是普通小麥育種改良的新的條銹病抗性資源。

HMW-GSs是麥谷蛋白聚合物的組成部分，在決定小麥面團獨特的粘彈性方面起著關(guān)鍵作用[5]。烏拉爾圖小麥是普通小麥品質(zhì)改良的新的種質(zhì)資源[9-11,26]。在普通小麥中，lAx不經(jīng)常表達，1Ay根本不表達[5,7]。本研究中，來自于烏拉爾圖小麥TA#831的1Ay亞基在雙二倍體Syn-TAU-2中得到了表達，但在雙二倍體中其分子量發(fā)生了變化；來自于PI428270和PI428274的1Ax和1Ay亞基分別在雙二倍體Syn-TAU-3和Syn-TAU-4中得到了表達。這些雙二倍體在普通小麥品質(zhì)改良中的作用還有待進一步研究。

Au和A基因組染色體發(fā)生配對和重組是四倍體小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體向普通小麥轉(zhuǎn)移基因所必需的。已有研究表明，四倍體小麥和烏拉爾圖小麥雜種F1的染色體可以配對成7個二價體和7個單價體[27]，而普通小麥/烏拉爾圖小麥雜種F1每個花粉母細胞染色體平均配對成4.94個二價體和0.01個三價體[28]。本研究中，圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體的染色體在減數(shù)分裂中期I配對時有少量多價體形成，為將烏拉爾圖小麥的優(yōu)異基因通過雙二倍體作為“橋梁”轉(zhuǎn)入普通小麥提供了可能。

熒光原位雜交(FISH)可用來鑒別烏拉爾圖小麥的Au基因組及四倍體小麥A、B基因組[19-21]。本研究結(jié)合利用寡核苷酸序列探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa71-2、pTa-713和簡單重復(fù)序列探針(AAC)5成功將圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體中的42條染色體區(qū)分開，這些探針可進一步作為細胞學(xué)標記用于圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體育種改良工作中。

本研究我們對前期所創(chuàng)制的4份圓錐小麥-烏拉爾圖小麥雙二倍體進行了細胞遺傳學(xué)鑒定，下一步將利用這些雙二倍體材料與普通小麥品種進行雜交和回交，進一步將雙二倍體攜帶的優(yōu)異性狀轉(zhuǎn)移到普通小麥中，促進小麥育種改良。