唐俊瑜 蘇云順 鐘順平 趙謙

（1，云南農(nóng)業(yè)大學 652100；2，云南省永勝縣動物疫病預防控制中心 674200；3，云南省姚安縣動物疫病預防控制中心 675300；4，云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務中心 666303；5，云南省楚雄州動物疫病預防控制中心 675000）

出血性腸炎是由于腸黏膜遭到嚴重破壞，導致豬只排泄物中含有血液、黏液及脫落黏膜的一種疾病，臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和便血等[1]。出血性腸炎病程短，發(fā)病迅速，死亡率較高。出血性腸炎可由有毒有害的化學物質、微生物或寄生蟲導致[2,3]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，豬出血性腸炎時有發(fā)生，由于該病病原具有多樣性，容易出現(xiàn)誤診，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失，依其原因，與傳染性因素相關的可能是魏氏梭菌、豬痢疾密螺旋體、胞內(nèi)勞森氏菌、莢膜桿菌、彎曲桿菌、腸出血性大腸桿菌等條件性致病因子[4,5]。

胞內(nèi)勞森菌侵害豬回腸和小腸與大腸前端連接處的黏膜部位的腸腺窩細胞和未成熟的上皮細胞，經(jīng)由“呼應作用”使細菌被細胞吞入而進入細胞質中，細胞被胞內(nèi)勞森菌感染，維持在快速增殖的有絲分裂狀態(tài)，不能發(fā)育成熟，而隨著感染細胞增殖，當被細菌感染的細胞代替老化上皮細胞，小腸絨毛開始萎縮消失，留下一個肥大的隱窩，其吸收營養(yǎng)的功能消失，引起患豬生長緩慢[6,7]。

本研究為了解某豬場爆發(fā)出血性腸炎的病因，采用臨床診斷，病理解剖對病豬進行初步診斷。初步診斷后推斷出引發(fā)豬出血性腸炎的可能病原，采取逐一排除法對病原進行檢測，最終確診了此次豬出血性腸炎是由胞內(nèi)勞森菌引起的。此結果可為豬增生性、出血性腸炎，胞內(nèi)勞森菌感染的確診提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本試驗樣品采自云南省某豬場的豬糞便及結腸、回腸、盲腸組織樣品。

1.1.2 試驗試劑

分子生物學試劑、細菌分離培養(yǎng)試劑等均由云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院傳染病實驗室提供。根據(jù)NCBI 公布的胞內(nèi)勞森菌基因序列，設計一對特異性引物，N-F：TTACAGGTGAAGTTATTGGG，N-R：CTTTCTCATGTCCCATAAGC，預期擴展片段為270bp。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷

對病豬進行群體檢查（年齡、品種、性別等），個體檢查（排便次數(shù)、糞便顏色、糞便味道、糞便稀軟等臨床癥狀），病理剖檢（病變部位的剖檢，如結腸、回腸、盲腸黏膜增厚、壞死、出血）可作出初步診斷。

1.2.2 病料采集

采集病豬排泄物及死亡豬只結腸、回腸、盲腸組織。

1.2.3 魏氏梭菌的分離

將腸道橫斷面剪開，暴露組織液和內(nèi)容物，在無菌條件下將橫斷面在血瓊脂平板上涂抹一點后，進行常規(guī)劃線分離，采用焦性沒食子酸法于37℃條件下厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察細菌生長情況。

1.2.4 豬痢疾密螺旋體的檢查

在載玻片上滴上一滴生理鹽水，刮取腸道黏膜或糞便與生理鹽水充分混勻，蓋上蓋玻片，在400 倍暗視野顯微鏡下觀察有無發(fā)亮的疑似菌體與數(shù)目。

1.2.5 胞內(nèi)勞森菌的PCR 檢測

使用基因組DNA 提取試劑盒對采集的樣品進行DNA 提取，取50～100mg 腸黏膜（腸道組織用滅菌生理鹽水清理內(nèi)容物，用手術刀刮取腸黏膜放入離心管）放入1.5ml 的離心管，按照全血基因組DNA 提取試劑盒的操作說明書進行操作。PCR擴增體系為：Mix (含10×PCR buffer，dNTPs，TransTaq 酶)12.5ul，dH2O 10.5ul，上下游引物各0.5ul，DNA 1ul，總反應體系為25ul。PCR 擴增反應條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35 次循環(huán)；72℃5min。取10ul PCR 擴增產(chǎn)物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在120V 電壓下進行30min 的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果，并拍照。

1.2.6 目的基因片段的克隆酶切鑒定將PCR 產(chǎn)物回收純化后克隆于pMD18-T 載體

對重組質粒進行酶切鑒定。隨機選擇4 份陽性重組質粒送至昆明碩擎生物科技有限公司測序。將測序結果經(jīng)BLAST 線分析，同時利用生物信息學軟件MEGA 將所測序列與GeneBank中胞內(nèi)勞森菌進行核苷酸同源性比對。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

根據(jù)群體檢查、個體檢查、病理剖檢等臨床診斷手段做出初步診斷，多為6～20 周齡的仔豬，病豬精神沉郁，皮膚蒼白，消瘦，站立不穩(wěn)，食欲減退，出現(xiàn)腹瀉，糞便變軟、變稀，呈現(xiàn)糊狀，排焦油樣黑色糞便或血便。剖檢病死仔豬主要可見腸道的病變，其他器官無明顯變化[8]，小腸局部增厚，小腸后端和盲腸、直腸腫脹充血，回腸壁增厚，直徑增加，腸道內(nèi)黏膜充血、出血，有血凝塊和未凝固的血液，增厚的腸黏膜產(chǎn)生橫向的皺褶，呈分枝狀或腦回狀，如圖1-3。

2.2 魏氏梭菌的分離結果

將死亡豬腸道橫斷面的組織液或內(nèi)容物涂抹于血瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)24～48h，血瓊脂平板沒有細菌長出，魏氏梭菌分離結果陰性，見圖4。

2.3 豬痢疾密螺旋體的鏡檢結果

病料通過暗視野顯微鏡鏡檢，沒有觀察到疑似豬痢疾密螺旋體，表明引起豬出血性腸炎的病原不是豬痢疾密螺旋體，見圖5。

2.4 PCR 檢測結果

用針對胞內(nèi)勞森菌特異性引物對疑似胞內(nèi)勞森菌進行擴增，擴增產(chǎn)物電泳結果顯示擴增片段大小與預期的270bp 相符，見圖6。

2.5 同源性分析

利用DNA Star 軟件測序結果進行分析，分析結果見圖7，從圖中可以看出本試驗所測序列與11 株胞內(nèi)勞森菌16SrDNA同源性為97.0%～99.6%，提示本菌即為胞內(nèi)勞森菌。

3 討論

本試驗對出血性腸炎的病原進行檢測，主要區(qū)別魏氏梭菌、豬痢疾密螺旋體及胞內(nèi)勞森菌。魏氏梭菌主要引起1～3d的仔豬發(fā)生紅??；豬痢疾密螺旋體主要引起42～84 日齡仔豬發(fā)生血痢；胞內(nèi)勞森菌多發(fā)生于6～20 周齡的生長育肥豬，引起豬只糊樣糞便，混有血液和組織碎片，可做出初步診斷。本試驗采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)和暗視野檢測方法，排除魏氏梭菌和豬痢疾密螺旋體后，采用PCR 方法，對疑似胞內(nèi)勞森菌進行檢測，結果擴增出的片段大小與預期片段270bp 相符。擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定和測序，利用DNA Star 軟件對疑似菌進行分析，疑似菌與胞內(nèi)勞森菌之間的同源性為97.0%～99.6%，結果證明兩份病料胞內(nèi)勞森菌抗原檢測結果都為陽性。從而確診某豬場出血性腸炎是由胞內(nèi)勞森菌引起的，此結果通過查閱資料在云南省未見報道。對本病的防控首先需要加強飼養(yǎng)管理，采取全進全出的方法，提供良好的采食環(huán)境和干凈的水源，增強畜舍通風，保持干凈的畜舍環(huán)境，使用季銨鹽類噴灑周圍環(huán)境，對可能感染的器具、物品進行消毒。有條件的可進行免疫接種，提高豬只免疫力。藥物防治可用紅霉素、林可霉素、泰妙菌素、泰樂菌素等。