崔曉燕

摘 要 目的：觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells， hUC-MSCs）膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射對(duì)大鼠的毒性反應(yīng)。方法：實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組、有血清MSCs低劑量組和高劑量組、無(wú)血清MSCs低劑量組和高劑量組。觀察大鼠一般生命體征和血液尿液指標(biāo)；取主要臟器組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果：注射MSCs后，MSCs組與生理鹽水對(duì)照組相比，大鼠一般生命體征、血常規(guī)、T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子、尿常規(guī)，均無(wú)顯著差異；主要臟器組織病理學(xué)無(wú)明顯改變。一部分血液生化指標(biāo)雖然在MSCs注射后有所波動(dòng)，但仍在參考范圍內(nèi)或接近參考范圍上限。結(jié)論：膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射hUC-MSCs對(duì)大鼠沒(méi)有明顯的毒性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 大鼠 膝關(guān)節(jié)注射

中圖分類(lèi)號(hào)：R965.3； Q813.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）13-0063-07

Safety study of intra-articular administration of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in rats

CUI Xiaoyan*

（Shanghai Baonian biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201615， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the toxic reactions of intra-articular administration of human umbilical cordderived mesenchymal stem cells （hUC-MSCs） in rats. Methods： Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into a normal saline control group， a low-dose F-MSCs （MSCs cultured with fetal bovine serum） group， a high-dose F-MSCs group， a low-dose SF-MSCs （MSCs cultured with serum-free medium） group， and a high-dose SF-MSCs group. General vital signs， blood routine， blood biochemistry， subsets of T cells， serum cytokines， routine urine， pathology of vital organs and tissues were respectively determined. Results： There were no obvious differences between the MSCs group and the control group in all other indicators except some blood biochemistry indicators. Conclusion： There was no obvious toxic effect of intra-articular administration of hUC-MSCs on rats.

KEy WORDS human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells； rat； intra-articular administration

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一類(lèi)源自中胚層，可在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞等的多能干細(xì)胞[1]。人臍帶來(lái)源MSCs（human umbilical cord-derived MSCs，hUC-MSCs）由于取材方便和增殖快等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到臨床應(yīng)用的重視[2]。目前ClinicalTrials.gov官網(wǎng)注冊(cè)的hUC-MSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床試驗(yàn)研究中，大多數(shù)試驗(yàn)處于Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究階段；且已發(fā)表的MSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床研究報(bào)道中[3-5]，大多數(shù)研究為Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究。因此，hUC-MSCs用于治療膝關(guān)節(jié)疾病的安全性仍有待于探索。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出“細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)盡量避免使用動(dòng)物或人來(lái)源的物質(zhì)，比如應(yīng)盡量避免血清的使用”，因此本研究中hUC-MSCs的培養(yǎng)，除原有有血清培養(yǎng)體系之外，又使用含血清替代物的無(wú)血清培養(yǎng)體系。我們將2種培養(yǎng)體系的hUC-MSCs通過(guò)膝關(guān)節(jié)注射到正常Sprague-Dawley （SD）大鼠，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠一般生命體征、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子、尿常規(guī)等指標(biāo)的變化，主要臟器組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。闡明膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射hUC-MSCs 對(duì)SD大鼠的毒性反應(yīng)，從而為hUC-MSCs的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞

hUC-MSCs采用組織貼塊法培養(yǎng)，分為兩種不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)：①含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Gibco公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）的有血清培養(yǎng)體系，MSCs標(biāo)記為F-MSCs；②含5%的血清替代物（Helios）的α-MEM培養(yǎng)基（Gibco）的無(wú)血清培養(yǎng)體系，MSCs標(biāo)記為SF-MSCs。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠共80只，6周齡，雌雄各50%，購(gòu)自上海西普爾-必凱動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)20130016011010。

1.3 方法

1.3.1 hUC-MSCs細(xì)胞形態(tài)和表型鑒定

采用流式儀（FACSCanto II，美國(guó)BD公司）檢測(cè)細(xì)胞表型，流式抗體PE Anti-Human CD44、CD90、CD73、CD105，CD14、CD19、CD34、CD45和PerCP Anti-Human HLA-DR均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3.2 hUC-MSCs分化潛能分析

成脂試劑盒和成軟骨試劑盒（中國(guó)Cyagen公司）及成骨試劑盒（美國(guó)Gibco公司），分別用于鑒定第5代hUC-MSCs向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化潛能。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SD大鼠分為5組：生理鹽水對(duì)照組、有血清MSCs低劑量組、有血清MSCs高劑量組、無(wú)血清MSCs低劑量組和無(wú)血清MSCs高劑量組。每組各16只，雌雄各50%。

MSCs組分別于第0和21天時(shí)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 ml第5代hUC-MSCs，左右后肢關(guān)節(jié)腔各注射0.2 ml。低劑量組注射（1×106）/kg的hUC-MSCs，高劑量組注射（1×107）/kg的hUC-MSCs，生理鹽水組于第0和21天時(shí)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 ml生理鹽水。

1.3.4 安全性評(píng)價(jià)

1）檢測(cè)一般生命體征 首次MSCs注射前（D0）、首次MSCs注射后的第14（D14）和35天（D35），觀察和記錄一般生命體征，包括肛溫、血壓、心率及注射部位局部觀察，用nt X檢測(cè)肛溫，Softron 2006A檢測(cè)血壓和心率。稱(chēng)量體重。

2）移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）評(píng)分 在D0、D14、D35分別對(duì)動(dòng)物進(jìn)行GVHD評(píng)分，5個(gè)參數(shù)，各參數(shù)總分2分。①體重：每周體重下降<10%記為0分；下降10%～25%記為1分；下降>25%記為2分。②活動(dòng)度：無(wú)下降記為0分；輕度下降記為1分；重度下降記為2分。③皮膚潰瘍：皮膚完整無(wú)脫毛記為0分；小片淺潰瘍或脫毛脫毛記為1分；大片潰瘍明顯皮膚裸露記為2分。④姿勢(shì)：無(wú)異常記為0分；輕度異常記為1分；姿勢(shì)呈弓背樣改變記為2分。⑤聳毛：無(wú)聳毛記為0分；輕度聳毛記為1分；重度聳毛記為2分。

3）血常規(guī)和生化指標(biāo)檢測(cè) 在D0、D14、D35分別于眼眶靜脈叢采血，EDTA抗凝，檢測(cè)和比較血常規(guī)；采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測(cè)生化指標(biāo)。

4）T淋巴細(xì)胞亞群免疫學(xué)指標(biāo) 在D0、D14、D35分別于眼眶靜脈叢采血，EDTA抗凝，分離單核細(xì)胞，使用CD3抗體（FITC Mouse Anti-Rat CD3，美國(guó)BD公司），CD4抗體（PE-Cy 5 Mouse Anti-Rat CD4）和CD8抗體（PE Mouse Anti-Rat CD8a）均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，4 ℃避光孵育1 h，用Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。

5）血清細(xì)胞因子檢測(cè) 采用BD公司的CBA試劑盒檢測(cè)血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-10、TNF含量。

6）尿常規(guī)檢測(cè) 在D0、D14、D35分別采集大鼠尿液，檢測(cè)和比較尿常規(guī)。

7）病理學(xué)檢查 在D14、D35分別處死并解剖8只大鼠/組，取心、肝、脾、肺、腎、腦和注射部位肌肉，甲醛固定，石蠟包埋，采用徠卡公司SQ2125石蠟切片機(jī)切片，HE染色。采用Nikon Eclipse Ni顯微鏡觀察組織病理學(xué)有無(wú)改變。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的鑒定

hUC-MSCs細(xì)胞形態(tài)均為梭形。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代SF-MSCs特異性表面抗原CD44、CD90、CD73和CD105的陽(yáng)性率分別為99.9%、100.0%、99.4%、98.1%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表達(dá)為陰性。第3代F-MSCs特異性表面抗原CD44、CD90、CD73、和CD105的陽(yáng)性率分別為100.0%、100.0%、99.5%、99.0%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表達(dá)為陰性。

第3代F-MSCs和SF-MSCs在成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)條件下，形成大的脂滴、軟骨球和鈣結(jié)節(jié)。

2.2 一般生命體征

大鼠注射生理鹽水和MSCs后全部存活。注射MSCs各組和注射生理鹽水組相比，體重、肛溫、收縮壓、舒張壓和心率全部無(wú)顯著性差別（表1）。

2.3 GVHD評(píng)分

MSCs組和生理鹽水對(duì)照組，GVHD評(píng)分均為0分。

2.4 血常規(guī)

注射MSCs后，血常規(guī)指標(biāo)無(wú)顯著改變（P > 0.05，表2）。

2.5 血液生化

D14測(cè)定的血液生化指標(biāo)與生理鹽水組相比，有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALP（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無(wú)血清低劑量組和無(wú)血清高劑量組的ALB（白蛋白）和BUN（尿素氮）顯著升高，無(wú)血清高劑量組的TC（總膽固醇）顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無(wú)血清低劑量組和無(wú)血清高劑量組的GLU（葡糖糖）顯著升高，其他血液生化指標(biāo)無(wú)顯著改變（P > 0.05，表3）。

與生理鹽水組相比，D35有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALT顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無(wú)血清低劑量組和無(wú)血清高劑量組的AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、ALB和BUN顯著升高，有血清高劑量組的TC顯著升高，其他血液生化指標(biāo)無(wú)顯著改變（P > 0.05，表3）。

2.6 T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)

與生理鹽水對(duì)照組相比，MSCs注射組CD3+、 CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和CD4+/CD8+比值無(wú)顯著改變（圖1）。

2.7 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

血清IFN-γ和IL-2均未檢測(cè)到，與生理鹽水對(duì)照組相比較，MSCs組注射MSCs后TNF（腫瘤壞死因子）、IL-4、IL-10含量無(wú)顯著改變（圖2）。

2.8 尿常規(guī)

與生理鹽水對(duì)照組相比較，MSCs注射組尿常規(guī)指標(biāo)無(wú)顯著改變（P > 0.05）。

2.9 病理學(xué)檢測(cè)

病理學(xué)評(píng)價(jià)委托中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所藥物安全評(píng)價(jià)研究中心完成。經(jīng)顯微鏡下診斷，有血清MSCs低劑量組、高劑量組和無(wú)血清MSCs低劑量組、高劑量組的7種組織臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦、骨骼?。┚匆?jiàn)明顯與MSCs相關(guān)的病理組織學(xué)改變。3 討論

近年來(lái)MSCs干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床前研究和臨床研究日益增多[6-10]，臍帶由于取材方便和易于擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)成為膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞治療的重要原材料。本實(shí)驗(yàn)中2種培養(yǎng)體系的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原表型和分化潛能均符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（International Society for Cellular Therapy， ISCT）制定的MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)[11]，hUC-MSCs細(xì)胞純度在95 %以上。

GVHD是異基因造血干細(xì)胞移植引起的一種危及生命的并發(fā)癥[12]。本實(shí)驗(yàn)GVHD評(píng)分為0分，注射hUCMSCs沒(méi)有引發(fā)大鼠GVHD。hUC-MSCs表達(dá)HLA-G，HLA-G具有很強(qiáng)的免疫抑制作用[13]。同時(shí)hUC-MSCs不表達(dá)HLA-II抗原，為低免疫原性細(xì)胞。

有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALP、無(wú)血清MSCs高劑量組的TC、各實(shí)驗(yàn)組的GLU，雖然在D14顯著升高，但在D35與生理鹽水對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。

各實(shí)驗(yàn)組的ALB（D14和D35）、有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALT（D35）、各實(shí)驗(yàn)組的AST（D35），雖然這三個(gè)生化指標(biāo)在MSCs注射后有所升高，但是仍然在參考范圍內(nèi)：SD雄性大鼠ALB為3.9～4.9 g/dl，雌性大鼠ALB為4.0～5.2 g/dl；SD雄性大鼠ALT為25～55 IU/L，雌性大鼠ALT為25～50 IU/L；SD雄性大鼠AST為60～300 IU/L，雌性大鼠AST為80～250

IU/L[14]。

各實(shí)驗(yàn)組的BUN，雖然在MSCs注射后，與同時(shí)間點(diǎn)的生理鹽水對(duì)照組相比升高，但是與MSCs注射前相比，自身變化不大。即MSCs低劑量組和高劑量組大鼠，在MSCs注射前后BUN無(wú)顯著性改變。有血清MSCs高劑量組的TC在D35與生理鹽水對(duì)照組 相比有顯著性升高，鑒于接近參考值（2.59 mmol/L）[14]，且屬于個(gè)別異常，因此考慮與MSCs注射無(wú)關(guān)。

根據(jù)臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)分析的通用指導(dǎo)原則，臨床病理學(xué)參數(shù)不能孤立地進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)只有血液生化指標(biāo)活性或濃度大于正常水平上限的2倍時(shí)， 說(shuō)明臟器組織受到損傷[15]。上述血液生化指標(biāo)雖然在MSCs注射后有所波動(dòng)，但鑒于仍在參考范圍內(nèi)或接近參考范圍上限，并且組織病理學(xué)未見(jiàn)明顯與hUC-MSCs相關(guān)的病理組織學(xué)改變，因此說(shuō)明hUC-MSCs對(duì)大鼠的物質(zhì)代謝、肝、腎功能沒(méi)有造成損害。

通過(guò)尾靜脈移植的MSCs往往分布于肺、脾、腎、皮膚等含血量多的器官中[16]。本研究hUC-MSCs通過(guò)膝關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射，沒(méi)有設(shè)計(jì)hUC-MSCs的定植和分化實(shí)驗(yàn)，已在正開(kāi)展的研究中增加了該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

總之，本研究表明膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射有血清培養(yǎng)體系和無(wú)血清培養(yǎng)體系的2種hUC-MSCs，沒(méi)有引起大鼠一般生命體征、GVHD評(píng)分、血常規(guī)、T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子、尿常規(guī)和組織病理學(xué)明顯改變，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠無(wú)明顯毒性作用。本研究為hUC-MSCs的膝關(guān)節(jié)臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1] Alvarez R， Lee HL， Wang CY， et al. Characterization of the osteogenic potential of mesenchymal stem cells from human periodontal ligament based on cell surface markers[J]. Int J Oral Sci， 2015， 7（4）： 213-219.

[2] Ren Z， Zheng X， Yang H， et al. Human umbilical-cord mesenchymal stem cells inhibit bacterial growth and alleviate antibiotic resistance in neonatal imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa infection[J/OL]. Innate Immun， 2019 18： 1753425919883932. doi： 10.1177/1753425919883932.

[3] Jo CH， Lee YG， Shin WH， et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee： a proof-of-concept clinical trial[J]. Stem Cells， 2014， 32（5）： 1254-1266.

[4] Wang W， Cao W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells[J]. Sci China Life Sci， 2014， 57（6）：586-595.

[5] Song Y， Du H， Dai C， et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells for osteoarthritis： a pilot study with long-term follow-up and repeated injections[J]. Regen Med， 2018， 13（3）： 295-307.

[6] Jo CH， Chai JW， Jeong EC， et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee： a 2-year follow-up study[J]. Am J Sports Med， 2017， 45（12）： 2774-2783.

[7] Al-Najar M， Khalil H， Al-Ajlouni J， et al. Intra-articular injection of expanded autologous bone marrow mesenchymal cells in moderate and severe knee osteoarthritis is safe： a phase Ⅰ/Ⅱ study[J/OL]. J Orthop Surg Res， 2017， 12（1）： 190. doi： 10.1186/s13018-017-0689-6.

[8] Davatchi F， Sadeghi Abdollahi B， Mohyeddin M， et al. Mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis： 5 years follow-up of three patients[J]. Int J Rheum Dis， 2016， 19（3）： 219-225.

[9] Emadedin M， Labibzadeh N， Liastani MG， et al. Intraarticular implantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells to treat knee osteoarthritis： a randomized， triple-blind， placebo-controlled phase 1/2 clinical trial[J]. Cytotherapy， 2018， 20（10）： 1238-1246.

[10] Wu KC， Chang YH， Liu HW， et al. Transplanting human umbilical cord mesenchymal stem cells and hyaluronate hydrogel repairs cartilage of osteoarthritis in the minipig model[J]. Tzu Chi Med J， 2019， 31（1）： 11-19.

[11] Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy， 2006， 8（4）： 315-317.

[12] Thomas E， Storb R， Clift RA， et al. Bone-marrow transplantation （first of two parts）[J]. N Engl J Med， 1975， 292（16）： 832-843.

[13] Ding DC， Chou HL， Chang YH， et al. Characterization of HLA-G and related immunosuppressive effects in human umbilical cord stroma-derived stem cells[J]. Cell Transplant， 2016， 25（2）： 217-228.

[14] Tripathi NK， Hall RL. Clinical Pathology of Laboratory Animals [M] // Gad SC. Animal Models in Toxicology. Third Edition. Boca Raton： CRC Press， 2016： 825-876.

[15] 王越， 沈連忠， 李波. 臨床前研究中肝損傷的臨床病理指標(biāo)的選擇及意義[J]. 中國(guó)藥事， 2009， 23（8）： 813-816； 825.

[16] 王冠華， 荊寶琴， 高暢， 等. 間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志， 2015， 31（16）： 1645-1647.