董馨憶

（昆明醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，云南 昆明 650000）

在研究植物的過程中，往往要對其生長發(fā)育和基因等因素進(jìn)行檢測研究，其中，對植物的基因組大小以及其DNA倍性的研究對該植物的品系、性狀及營養(yǎng)和藥用價(jià)值等都有著極其密切的關(guān)聯(lián)。特別是在植物遺傳育種中，植物染色體倍性鑒定是不可缺少的步驟，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。在植物研究中，檢測植物的基因組大小和DNA倍性是有非常重要意義的。

除細(xì)菌和藍(lán)藻的細(xì)胞以外，所有的動(dòng)物細(xì)胞以及植物細(xì)胞都屬于真核細(xì)胞。研究表明包括植物細(xì)胞在內(nèi)的真核生物的細(xì)胞增殖主要都是通過有絲分裂的方式。我們首先要知道，細(xì)胞有絲分裂的一個(gè)循環(huán)被稱為細(xì)胞周期，它指細(xì)胞從上一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所完成的活動(dòng)過程。整個(gè)周期被人為的分為：有絲分裂期（M）、有絲分裂后間期（G1）、DNA合成期（S）和合成后間期（G2）[1]。另外，除了有絲分裂這個(gè)增殖的周期之外，在許多雙子葉植物的發(fā)育過程中，組織細(xì)胞也會(huì)受到一些其他的發(fā)育信號以及環(huán)境因素的影響，在S期完成后會(huì)直接重新回到Gl期開始新一輪的DNA復(fù)制，這個(gè)過程是跳過了G2和M期的，經(jīng)過如此特殊的一個(gè)循環(huán)，就可以促使植物形成多倍體細(xì)胞，而在植物育種過程研究中，多倍體育種是特別重要的途徑之一，它不僅可以對植物的性狀進(jìn)行改良，還可以提高植物體內(nèi)各種有效成分的含量。這種特殊的導(dǎo)致多倍體形成的細(xì)胞周期在雙子葉植物的葉、下胚軸、花器官和果實(shí)等器官的發(fā)育過程中是普遍存在的，而且這還與該植物細(xì)胞的擴(kuò)展、分化密切相關(guān)。

正是因?yàn)閷χ参锉缎缘挠行цb定是了解其遺傳背景和進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，所以我們才要找到并利用有效且快速的倍性鑒定方法，才能夠準(zhǔn)確地辨認(rèn)多倍體并將其挑選出來。

流式細(xì)胞儀（Flow cy tometry ，簡稱FCM，是一種可以對動(dòng)植物細(xì)胞或者一些微粒進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的儀器。該儀器運(yùn)用了激光技術(shù)和光電測量技術(shù)，并將計(jì)算機(jī)技術(shù)和流體力學(xué)結(jié)合起來，以細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，逐漸發(fā)展成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可或缺的高科技細(xì)胞分析技術(shù)。由于流式細(xì)胞儀在檢測細(xì)胞的大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA含量、特異蛋白質(zhì)含量以及表面抗原等參數(shù)的優(yōu)勢，所以其現(xiàn)在也已廣泛應(yīng)用在植物遺傳學(xué)，植物生理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在尋求植物DNA倍性分析的高效快速的一個(gè)檢測方法。如果操作得當(dāng)，那么流式細(xì)胞儀完全可以可在半小時(shí)內(nèi)完成樣本制備及染色并檢測植物DNA倍性的全過程，如此方便快捷的方法，應(yīng)該是值得推廣應(yīng)用的。

流式細(xì)胞儀檢測植物倍性，主要以檢測其DNA含量為基礎(chǔ)。在檢測植物細(xì)胞的周期實(shí)驗(yàn)中，G1期的細(xì)胞為二倍體，其DNA含量我們將其表示為2D（這里我們用“D”表示單倍體核的DNA含量），在S期DNA完成復(fù)制之后后，細(xì)胞就會(huì)變?yōu)樗谋扼w，此時(shí)DNA含量為4D。植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞不同，在許多植物器官生長發(fā)育過程中，很多時(shí)候都是經(jīng)歷了跳過G2和M期的特殊循環(huán)，這樣特殊的方式伴隨細(xì)胞的擴(kuò)展和分化，細(xì)胞由有絲分裂進(jìn)入內(nèi)復(fù)制，就會(huì)使植物細(xì)胞的倍性呈指數(shù)的增長，不僅僅只有2D、4D，甚至是會(huì)增加至8D、16D，乃至到32D或者更高，在二倍體與四倍體區(qū)域以外的統(tǒng)稱異倍體[3]。利用分析型流式細(xì)胞儀，就可以精確地測定細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，以此快速準(zhǔn)確的判斷其倍性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中使用的流式細(xì)胞儀是德國partec，其型號是CyFlow? Space，DAPI熒光染料也同樣購自德國partec。4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI），是一種標(biāo)記細(xì)胞DNA的染料，可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)200倍，而與單鏈DNA結(jié)合時(shí)無熒光增強(qiáng)，與RNA結(jié)合不會(huì)形成強(qiáng)熒光，明顯弱于DNA[4]，染色前無需用RNase處理細(xì)胞。

1.2 樣品的采集、保存和處理

試驗(yàn)中所用的植物為馬鈴薯嫩葉，已經(jīng)過前期處理。并對新鮮樣品的保存條件、保存時(shí)間、制取方法等進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。

加入DPAI熒光染料之前一定要用過濾網(wǎng)（至少300目）過濾，不少于2遍。留取至少1mL濾液備用。將濾液放入離心機(jī)，室溫下離心5min，1500rpm。棄上清，加入1mL超純水混勻，室溫下離心5min，1500rpm，棄上清，備用。

1.3 樣品的染色

每管樣品中加入1mLDAPI，充分混勻。上樣前再次過濾，300目。將制備好的細(xì)胞懸液充分混勻，轉(zhuǎn)至3.5mL專用流式管中，備用。

1.4 上機(jī)檢測

開機(jī)，根據(jù)DAPI染料，選擇使用UV激發(fā)光。調(diào)整好對應(yīng)的接收通道、合適的進(jìn)樣速度之后，將染色好的樣品逐一檢測。

樣品檢測之前要以每種植物的已知二倍體為對照，以它為標(biāo)準(zhǔn)，給待測樣本DNA的含量提供一個(gè)對照。對照樣本的所有處理過程要以其他樣品一致。

調(diào)節(jié)FL9通道的電壓值，將已知二倍體樣品的熒光峰即G1期峰調(diào)至熒光道數(shù)為100處，收集信號，等到收集細(xì)胞數(shù)量達(dá)到20000后取下樣品，保持該電壓不動(dòng)，逐一上樣，收集每管樣品細(xì)胞大約在10000～20000即可取下樣品，記錄該樣品DNA峰型位置并將其保存好。測樣結(jié)束后用專用清洗劑清洗管道之后再用超純水清洗即可關(guān)機(jī)。

2 流式檢測植物倍性的參數(shù)設(shè)置

2.1 參數(shù)的選擇與調(diào)節(jié)

在德國partec CyFlow? Space型流式細(xì)胞儀所用的軟件界面， 根據(jù)DAPI染料的接收通道，選用第一張圖為FL9-A／FL9-W雙參數(shù)散點(diǎn)圖。橫軸為FL9-A，縱軸為FL9-W。這是一個(gè)采用了面積信號和寬度信號共同體現(xiàn)的散點(diǎn)圖，選用該散點(diǎn)圖是為了通過調(diào)節(jié)FL9-A和FL9-W的光電倍增管電壓，從該散點(diǎn)圖上選定目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行下一步的分析，如下圖（圖1）所示，圈起來的表示R1的這部分細(xì)胞即為我們所要分析的細(xì)胞，其余細(xì)胞碎片、雜質(zhì)和一些黏連細(xì)胞就可以被不在分析的范圍內(nèi)，這樣可以使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

根據(jù)圖1中的R1細(xì)胞群，我們選擇使用第二張圖為橫坐標(biāo)為FL9的單參數(shù)直方圖，如下圖（圖2）所示：在橫坐標(biāo)的100和200的位置分別出現(xiàn)了兩個(gè)高尖峰，該圖為一個(gè)典型的二倍體。

3 結(jié)語

我們可以看到，利用流式細(xì)胞儀檢測植物細(xì)胞倍性的結(jié)果是十分明顯的，而且也比較可靠。經(jīng)過流式細(xì)胞儀對大量的處于分裂間期的植物細(xì)胞DNA含量進(jìn)行檢測，然后經(jīng)其計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析后形成的非常直觀的DNA含量的分布曲線圖，我們就能看到已知的二倍體、四倍體的峰型，然后穩(wěn)定其檢測電壓不變，用已知樣本來比對位置樣本，在流式細(xì)胞儀極其快速的檢測過程中，一分鐘之內(nèi)即可快速的得到每一個(gè)樣本的倍性，其結(jié)果穩(wěn)定、直觀、可靠、快速，不失為一種有效地檢測方法，值得我們大力的推廣使用。而且該方法取材部位多種多樣，不僅僅可以是葉片，還可以是植物的根莖、花、果皮和種子等等，完全不受植物的取材部位和細(xì)胞所處時(shí)期限制，這點(diǎn)是優(yōu)于其他檢測方法的，例如需要取根尖才能檢測的常規(guī)壓片法，必須取卷須的去壁低滲法等等。只是該方法一定要依靠一個(gè)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，配備相應(yīng)的儀器，即使是一臺簡單的只有488激光器的最常規(guī)的流式細(xì)胞儀也比較昂貴，并且需要專業(yè)的儀器維護(hù)人員和專業(yè)熟練的操作才能得到真實(shí)可靠的結(jié)果，這也是制約了該技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要原因。筆者也希望在將來能夠?qū)⒘魇郊?xì)胞儀技術(shù)更多的運(yùn)用和發(fā)展，使之成為一項(xiàng)簡單且操作性強(qiáng)的儀器，使更多的實(shí)驗(yàn)者了解和認(rèn)知，才能更有力的推廣使用。