劉玨 陳星光 朱雯 侯秋英 張旭 沈方方 滕懿群

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾病，其病情重、病死率高、預后差，部分患兒會留下腦癱、智力發(fā)育低下、癲癇等神經系統(tǒng)后遺癥[1]。加上目前尚無HIE診斷的金標準，臨床治療亦缺乏特異性，總體療效欠佳。微小RNA（microRNA，miRNA)是一類內源性非蛋白質編碼的小分子RNA，可參與諸多生命過程并發(fā)揮重要的生物學作用，是當前生命科學領域的研究熱點[2]。筆者所在團隊前期研究已通過芯片檢測篩選出HIE相關miRNA，同時應用RT-PCR法驗證差異表達明顯的miRNA，結果顯示HIE患兒血漿中miR-4472表達水平明顯升高，miR-4472可能是預測HIE預后的生物標志物[3]，但其相關調控機制尚未明確。為此，本研究擬應用生物信息學分析方法預測miR-4472的靶基因及信號通路，為miR-4472在HIE發(fā)生、發(fā)展中的調控機制研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 miR-4472的物種保守性分析 利用miRBase數據庫（http://www.mirbase.org）檢索miRNA序列，分析其物種保守性。

1.2 miR-4472的靶基因預測 通過Targetscan（http://www.targetscan.org）、miRDB（http://mirdb.org）、miRTar－Base（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）靶基因數據庫在線預測miR-4472的靶基因，對3者結果進行venny圖構建，得到交集靶基因。

1.3 miR-4472預測靶基因的生物功能及信號通路富集分析 應用DAVID數據庫，將miR-4472的預測靶基因集合進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析。GO分析包括細胞組分、分子功能及生物過程等3個部分，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。采用Fisher確切概率法統(tǒng)計基因集合相對背景生物通路的P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-4472的物種保守性分析 利用miRBase數據庫在線檢索人類、小鼠、大鼠、獼猴等各物種的miRNA序列進行對比，發(fā)現miR-4472序列“GGUGGGGGG UGUUGUUU”在各物種間高度保守。

2.2 miR-4472的靶基因預測 Targetscan、miRDB、miRTarBase等3個靶基因數據庫結果顯示，miR-4472靶基因分別有 4 943、418、179個；3者交集靶基因僅35個，不能用于數據的統(tǒng)計分析。因此，筆者選取Targetscan、miRDB等2個數據庫的結果交集，顯示共有378個預測靶基因。

2.3 miR-4472預測靶基因的生物功能及信號通路分析 將預測的378個交集靶基因通過DAVID數據庫進行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析。GO分析結果顯示，miR-4472靶靶基因富集在基底外膜、核染色質、突觸囊泡膜、突觸后致密物、異染色質等細胞組件，參與轉錄因子活性、DNA結合、蛋白連接酶結合等分子功能，涉及轉錄的正負調節(jié)、細胞凋亡、蛋白質磷酸化等生物過程，見表1～3。KEGG信號通路分析結果顯示，miR-4472的靶基因信號傳導顯著富集于PI3K-Akt信號通路、胰高血糖素相關信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導通路、醛固酮的合成和分泌相關信號通路，見表4。

3 討論

自1993年科學家發(fā)現第一個miRNA（lin-4）以來，對關于miRNA功能的細胞生物學、遺傳學及臨床各學科研究成為近年來的熱點之一[4]。越來越多證據表明，miRNA可在轉錄后水平調控基因表達，廣泛參與細胞增殖、分化以及凋亡等多種過程，同時研究證實其在缺血性腦卒中、帕金森病、腫瘤、阿爾茨海默病等多種神經系統(tǒng)性疾病中發(fā)揮重要作用[5-7]。筆者前期研究發(fā)現，HIE患兒血漿中miR-4472表達水平明顯升高，miR-4472可能是預測HIE預后的生物標志物[3]，但其相關調控機制尚不明確。因此，本研究首先通過miRBase數據庫對miR-4472物種的序列保守性進行在線分析，檢索發(fā)現其在多個物種中呈高度保守，說明在進化過程中這一段特殊序列在不同物種中均被完整保存下來，提示在功能研究方面有一定的價值，可能具有重要的生物學功能。再利用Targetscan、miRDB等靶基因數據庫進行預測，分析miR-4472可能的生物學功能，結果發(fā)現其生物過程主要在軸突發(fā)生的負調節(jié)、轉錄、轉錄的正負調節(jié)、DNA模板、細胞凋亡、蛋白質磷酸化等方面，提示miR-4472可能在神經細胞的周期調控、細胞凋亡等方面具有重要作用。

表1 miR-4472預測靶基因的細胞組分

表2 miR-4472預測靶基因的分子功能

表3 miR-4472預測靶基因的生物過程

表4 miR-4472預測靶基因的KEGG信號通路分析

在KEGG信號通路分析結果中，值得注意的是miRNA-4472的靶基因顯著富集于P13K/Akt信號通路。P13K/Akt信號通路作為經典的抗凋亡通路，又被稱為再灌注損傷救援激酶途徑。當該信號通路被激活時，可通過調節(jié)下游凋亡相關靶蛋白和靶基因抑制神經細胞凋亡，進而發(fā)揮腦保護作用，但確切作用機制并未完全清楚[8-9]。有研究構建了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，發(fā)現當神經元缺氧缺血時可激活P13K/Akt信號通路，誘導缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白表達增加，并認為P13K/Akt信號通路可能是HIE治療的新靶點[10]。miRNA不論是通過經典還是非經典的作用途徑，最終都是在轉錄、翻譯過程中下調靶蛋白的表達量，往往與靶基因的作用相反[11]。以上結果提示miRNA-4472可能通過抑制P13K/Akt信號通路相關基因如CREB、PRLR及G6PC2等的表達，加重腦損傷并增加遠期神經系統(tǒng)后遺癥發(fā)生的風險。HIE患兒除典型腦病癥狀外，缺氧持續(xù)存在，時常伴有全身多個臟器的損傷、電解質紊亂、血糖異常等[12]。生物信息學分析結果顯示，miR-4472的靶基因亦富集于胰高血糖素相關信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導通路及醛固酮的合成和分泌相關信號通路，說明miR-4472表達不僅與HIE患兒神經系統(tǒng)損害程度有關，也可能在心肌細胞功能、電解質及血糖調控方面產生影響。

綜上所述，本研究應用生物信息學分析方法預測了miR-4472的靶基因及信號通路，發(fā)現靶基因富集的信號通路均與HIE密切相關，尤其是P13K/Akt信號通路。后期將以此理論及實驗為基礎，進一步探究miR-4472在HIE發(fā)生、發(fā)展過程中的調控機制。