孫雪東 嚴(yán)一核 褚韋韋 張亦婷 劉芳 應(yīng)利君

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）是ICU機(jī)械通氣患者最常見的感染性疾病之一。重癥患者易發(fā)生VAP，多與其基礎(chǔ)狀態(tài)、診療操作、藥物治療等有關(guān)[1]。臨床上，往往在患者發(fā)生VAP后，醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果給予抗生素治療，如果早期使用廣譜抗生素會增加細(xì)菌的耐藥性。但是VAP病情進(jìn)展快、過程復(fù)雜，因此亟需尋找一種能有效預(yù)測VAP病情的指標(biāo)，指導(dǎo)盡早撤機(jī)拔管，進(jìn)而改善患者的預(yù)后。研究表明，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）與巨噬細(xì)胞的吞噬活性、宿主的免疫反應(yīng)等密切相關(guān)，對肺部感染的診斷與預(yù)后評估具有一定的價(jià)值[2]；但其對VAP患者能否早期撤機(jī)拔管的預(yù)測價(jià)值尚未明確[3]，故本研究作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2018年12月在紹興市人民醫(yī)院行機(jī)械通氣且發(fā)生VAP的62例患者為研究對象，所有患者在確診VAP后采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）進(jìn)行培養(yǎng)。其中男 34例，女 28例；年齡（62.87±15.34）歲；入組時(shí)臨床肺部感染評分（clinical pulmonary infection score，CPIS）為（4.06±1.67）分，急性生理和慢性健康評分Ⅱ（APACHE Ⅱ）為（17.55±5.32）分；外科術(shù)后36例（包括腹部外科術(shù)后19例，骨科術(shù)后12例，泌尿系統(tǒng)術(shù)后5例），腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)病變20例，心肺復(fù)蘇后3例，其他3例。VAP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2013年中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會制定的《VAP預(yù)防、診斷和治療指南》，即有創(chuàng)機(jī)械通氣48 h以上或撤機(jī)、拔管后48 h內(nèi)胸部X線片可見新發(fā)或進(jìn)展性浸潤陰影，且同時(shí)滿足以下任意2項(xiàng)可考慮診斷為 VAP：（1）體溫＞38 ℃或＜36 ℃；（2）外周血WBC＞10×109/L 或＜4×109/L；（3）氣管支氣管內(nèi)出現(xiàn)膿性分泌物；同時(shí)除外肺水腫、急性呼吸窘迫綜合征、肺結(jié)核、肺栓塞等疾病，結(jié)合微生物學(xué)診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有肺纖維化、免疫性疾病、肺部腫瘤的患者；（2）長期使用激素者；（3）妊娠婦女；（4）年齡＜18 歲；（5）入 ICU 前已明確存在肺部感染者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。根據(jù)臨床上發(fā)生VAP的時(shí)間分成VAP早發(fā)（機(jī)械通氣≤4 d）組32例和晚發(fā)（機(jī)械通氣＞4 d）組30例。

1.2 方法

1.2.1 收集資料 收集患者臨床資料，包括性別、年齡、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間以及確診VAP當(dāng)天APACHE Ⅱ、CPIS、氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）、7 d 機(jī)械通氣撤機(jī)拔管率等。

1.2.2 BALF中細(xì)胞因子水平檢測 采用ELISA法。參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會制定2002年制定的《BALF細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范（草案）》。用雙層紗布過濾BALF，去除黏液，將濾液放入50 ml的聚丙烯試管中，1 500 r離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱內(nèi)備用。取BALF上清液，使用ELISA試劑盒（Thermo Scientific公司）檢測TNF-α、IL-8、HMGB1等細(xì)胞因子水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 肺泡巨噬細(xì)胞提取及吞噬活性檢測 取BALF離心后沉淀物，用10 ml預(yù)冷的Hanks液再行懸浮；然后用10 ml預(yù)冷的Hanks液清洗2次。將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2環(huán)境下孵育90～120 min。輕輕震蕩搖勻，去除介質(zhì)與非黏附細(xì)胞；加入1 ml預(yù)熱的RPMI 1640培養(yǎng)液，輕輕搖勻，清洗3～4次。用1 ml含有5 mM EDTA的PBS孵育5 min，提取黏附的巨噬細(xì)胞，移液，加入1 ml肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基冷浸。用0.1%的臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)評價(jià)細(xì)胞活力，要求在95%以上。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，分別置于培養(yǎng)板中及若干個(gè)有載薄片的培養(yǎng)皿中。成功分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞后進(jìn)行熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)，在上述培養(yǎng)皿中按1∶100比例加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記乳膠微球，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育60 min，最后用4℃ PBS清洗未被吞噬的微球。使用表面熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)巨噬細(xì)胞的FITC標(biāo)記微球個(gè)數(shù)，每張標(biāo)本計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞。

1.2.3 肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。取分離培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，分別置于培養(yǎng)皿中，在冰上操作（加RIPA液裂解，吹打、震搖、離心），取上清液進(jìn)行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，用一抗 HMGB1（1∶1 000，美國 Santa Cruz公司）、β-actin（1∶2 000，美國 Santa Cruz公司）孵育過夜；最后用二抗孵育2h，ECL試劑顯色，利用JYClear ECL型化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像。目標(biāo)蛋白吸光值與內(nèi)參的比值，即為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。繪制ROC曲線，分析相關(guān)指標(biāo)對7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較 VAP早發(fā)組與晚發(fā)組患者性別、年齡以及確診VAP當(dāng)天APACHEⅡ、CPIS、PaO2/FiO2比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；晚發(fā)組機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間明顯短于早發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 兩組患者BALF中細(xì)胞因子水平比較 早發(fā)組確診 VAP時(shí) BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平明顯高于晚發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 兩組患者肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達(dá)量比較 VAP晚發(fā)組肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性（6.6±2.0）強(qiáng)于早發(fā)組（4.8±2.7），巨噬細(xì)胞中 HMGB1蛋白相對表達(dá)量（1.2±0.6）低于早發(fā)組（1.9±0.8），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.82、3.98，均 P＜0.05），見圖 1。

2.4 BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達(dá)量對7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的預(yù)測效能 62例患者7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管44例，占71.0%。BALF中HMGB1水平預(yù)測7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的 AUC 為 0.75（95%CI：0.65～0.79），截?cái)嘀禐?50.0 μg/L，靈敏度為0.78，特異度為0.70；肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性預(yù)測7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的AUC為0.79（95%CI：0.68～0.90），截?cái)嘀禐?6.5，靈敏度為 0.73，特異度為 0.70；巨噬細(xì)胞HMGB1蛋白相對表達(dá)量預(yù)測7 d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的 AUC 為 0.73（95%CI：0.61～0.86），截?cái)嘀禐?.4，靈敏度為 0.72，特異度為 0.73，見圖2。

3 討論

人工氣道解決了患者急性呼吸衰竭的問題，但是會破壞呼吸系統(tǒng)的防御機(jī)制。由于危重癥患者基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重、全身免疫功能低下，VAP然是機(jī)械通氣患者最常見的感染性疾病之一。有文獻(xiàn)報(bào)道重癥患者VAP發(fā)病率高達(dá)6%～52%，病死率為14%～50%[3]。因此，亟需尋找一種預(yù)測患者VAP病情的指標(biāo)，指導(dǎo)早期撤機(jī)拔管，進(jìn)而改善患者預(yù)后[4-5]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道多種臨床指標(biāo)可能有助于VAP預(yù)后的判斷，但是存在一些問題，如APATCH Ⅱ、CPIS等在VAP發(fā)生早期的特異度或靈敏度不高，降鈣素原、CRP等受全身因素的干擾[6-7]。近年來研究表明，HMGB1可能參與了膿毒癥的全部病理過程，與巨噬細(xì)胞的吞噬活性、宿主的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，對肺部的感染診斷和預(yù)后評估或許有很大價(jià)值[8-9]。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，廣泛分布在哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)，一旦分泌到細(xì)胞外即可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。研究表明，減少HMGB1從巨噬細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外釋放，可以減少組織的炎癥反應(yīng)[11]。有動物實(shí)驗(yàn)證明，急性肺損傷促使大鼠肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1高表達(dá)并向外周組織釋放，予以干預(yù)后可以明顯抑制肺組織HMGB1的表達(dá)，并激活細(xì)胞凋亡通路，對肺組織有一定的保護(hù)作用[12]。本研究結(jié)果顯示，VAP確診當(dāng)天兩組患者APATCHⅡ、CPIS、PaO2/FiO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，VAP早發(fā)組 BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平以及肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1蛋白相對表達(dá)量高于VAP晚發(fā)組，巨噬細(xì)胞吞噬活性低于VAP晚發(fā)組。但是這些指標(biāo)不能反映組內(nèi)患者的預(yù)后情況，而筆者更關(guān)注VAP發(fā)生后患者7 d內(nèi)撤機(jī)拔管率，因?yàn)楹粑鼨C(jī)使用超過1周會增加二次感染發(fā)生率，甚至需要采取氣管切開等措施[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1蛋白相對表達(dá)量、巨噬細(xì)胞吞噬活性對患者7 d撤機(jī)拔管均有較高的預(yù)測效能。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者BALF中細(xì)胞因子水平比較

圖1 兩組患者肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白相對表達(dá)量比較[a：兩組肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的電泳圖及相對表達(dá)量比較；b：兩組患者肺泡巨噬細(xì)胞熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果及吞噬活性比較；與VAP早發(fā)組比較，*P＜0.05]

圖2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）水平、肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達(dá)量預(yù)測7d機(jī)械通氣撤機(jī)拔管的ROC曲線

綜上所述，HMGB1和肺泡巨噬細(xì)胞吞噬活性可作為預(yù)測VAP患者短期內(nèi)撤機(jī)的可靠指標(biāo)，有助于指導(dǎo)VAP的治療；但對HMGB1的干預(yù)是否能進(jìn)一步改善VAP患者的預(yù)后，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。