Notch信號通路由4個(gè)Notch受體（Notch 1-4）和5個(gè)相關(guān)的Notch配體（Jagged 1、Jagged 2、Dell 1、Dell3和Dell4）組成[1]。Notch信號蛋白參與細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞間黏附等多項(xiàng)生物活動(dòng)。據(jù)報(bào)道，Notch信號通路的大多數(shù)組分在血管內(nèi)皮中表達(dá)，尤其是Notch1受體[2]。此外，Notch1受體已被證明是血管發(fā)育中最重要的Notch 受體，而Dell4和Jagged1是Notch1受體的主要配體[3]。Dell4 在血管生成中發(fā)揮重要作用，據(jù)報(bào)道，Dell4 缺陷可導(dǎo)致炎癥的血管重塑障礙及小鼠胚胎死亡[3]。雖然多項(xiàng)研究表明Notch1、Dell4和Jagged1在胚胎血管生成中起著重要作用[4]。然而，目前尚不清楚低氧對胎盤血管生成的影響是否與Notch1 及其配體有關(guān)。因此，本研究將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）在低氧條件下培養(yǎng)以模擬早期胎盤的低氧環(huán)境[5]，應(yīng)用Notch1信號通路的抑制劑DAPT和激活劑JAG-1 觀察Notch1信號通路對HUVEC遷移和血管形成能力的影響。

材料與方法

一、試劑和儀器

HUVEC（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Matrigel基質(zhì)膠（354234）、DAPT和JAG-1（美國BD Pharmingen公司）；Trizol試劑（15596-018）（美國Invitrogen公司）；M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒（M1701）[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix（QPK-201）

（日本TOYOBO公司）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體（英國Abcam公司）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL-P-100）（上海炎熙生物科技有限公司）；MTT試劑盒（HZB0375）（美國Sigma公司）。

二、方法

（一）細(xì)胞處理

將HUVEC進(jìn)行常氧和低氧[200 μmol/L，二氯化鈷（CoCl2）]誘導(dǎo)。再將常氧和低氧處理的HUVEC應(yīng)用Notch1信號通路的抑制劑DAPT（30 μmol/L，24 h）和激活劑JAG-1（30 μmol/L，24 h）干預(yù)。DAPT和JAG-1 用0.1﹪的二甲基亞砜溶解，并配置成指定濃度。細(xì)胞處理流程見圖1。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)

將HUVEC 在37℃、5﹪ CO2環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有10﹪胎牛血清和終濃度為0.1﹪二甲基亞砜的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)期間每周更換2次或3次。含有二氯化鈷（CoCl2，200 μmol/L）的培養(yǎng)基用于細(xì)胞的低氧誘導(dǎo)[6]。

（三）小管形成測定

使用300 μL Matrigel 基質(zhì)膠涂覆24孔板進(jìn)行鋪膠，然后在37℃靜置30 min。將HUVEC分別用30 μmol/L的DAPT或JAG-1處理24 h。然后將HUVEC（1×105/孔）接種到每個(gè)孔中，并在37℃下孵育24 h。然后應(yīng)用Image-Pro Plus 圖像分析軟件計(jì)算小管總長并用Nikon 倒置相差顯微鏡拍攝照片（×100）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（四）RNA提取和RT-PCR

用Trizol試劑根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明從HUVEC中提取總RNA。使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒將總RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列如表1所示。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（QPK-201）在Mx3000pTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括1 μL引物、10 μL MixSYBR、1 μL cDNA和6 μL H2O。反應(yīng)條件如下：95℃ 5 min，95℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因。使用2-△△Ct方法進(jìn)行mRNA 相對表達(dá)量的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 HUVEC細(xì)胞處理流程

表1 引物序列信息

（五）Western blot檢測

將收集的細(xì)胞在300 μL裂解緩沖液中置于冰上裂解30 min，并將裂解液以10 000 ×g在4℃下離心15 min。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，并將蛋白質(zhì)在100℃變性5 min。通過10﹪SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)（40 μg），然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中于4℃轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h。洗滌后，將膜用5﹪脫脂乳在室溫下封閉60 min。然后將膜在4℃下與以下一抗孵育過夜：Notch1（ab194123，1:2 000）、Dell4（ab23673，1:1 500）、JAG-1（ab7771，1:2 000）、HIF-1α（ab51608，1:3 000）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（ab222510，1:1 000）、MMP-9（ab141579，1:3 000）和GAPDH（ab181602，1:2 000）。然后在室溫下將膜與二抗抗兔抗體（ab6721，1:3 000）孵育90 min。然后通過超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL-P-100）進(jìn)行顯影。GAPDH作為內(nèi)部對照，將靶蛋白條帶的相對密度標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH并計(jì)算相對表達(dá)量。

（六）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

先將HUVEC分別用30μmol/L的DAPT或JAG-1處理24 h。再將Transwell 小室插入24孔板中，向Transwell小室中加入100 μL HUVEC（1×104/孔），置于37℃、5﹪ CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。將上室培養(yǎng)基更換為含有1﹪FBS的條件培養(yǎng)基，下室更換為含有15﹪FBS的普通培養(yǎng)基。后置于37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽刮去上室未遷移細(xì)胞，并將小室用多聚甲醛固定15 min，然后結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次取平均值。

（七）傷口愈合實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種在6孔板中并用無菌100 μL 槍頭在細(xì)胞生長中央?yún)^(qū)域劃線。再分別將10 μL DAPT（30 μmol/L）或JAG-1（30 μmol/L）加入培養(yǎng)基中，對照組細(xì)胞加入10 μL PBS。通過倒置相差顯微鏡在0 h和24 h 捕獲傷口圖像，使用Image J 軟件評估傷口面積。

（八）MTT法測定細(xì)胞增殖

使用MTT 測定法檢測細(xì)胞增殖，將HUVEC分別用30 μmol/L的DAPT或JAG-1處理24 h后，將細(xì)胞按每孔1×105接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h后，分別向每個(gè)孔中加入20 μL 5 g/L的MTT 并孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜并攪拌15 min。使用SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀檢測488 nm處的吸光度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，小管總長、HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)、Notch1、Dell4和JAG-1mRNA和蛋白表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)、遷移距離、MTT法測定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中488 nm處的OD值檢測結(jié)果均以表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，采用析因設(shè)計(jì)方差分析低氧和DAPT以及低氧和JAG-1對HUVEC遷移能力、距離、小管形成能力和細(xì)胞增殖的交互作用。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、常氧及低氧處理HUVEC后小管形態(tài)與長度比較

與常氧比較，低氧小管總長（8.18±0.62）mm 比（15.43±1.32）mm 增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。常氧中的“管道樣”小管結(jié)構(gòu)較少且長度較短，而低氧的細(xì)胞相互連接，“管道樣”結(jié)構(gòu)小管增多增長，血管腔完整性較好（圖2）。

二、常氧和低氧處理HUVEC后HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與常氧比較，低氧的HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA 相對表達(dá)量和蛋白相對表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，表2，圖3）。

三、常氧和低氧處理HUVEC 中Notch1信號的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與常氧比較，低氧Notch1、Dell4和Jagged1的mRNA 相對表達(dá)量和蛋白相對表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖4，表3）。

表2 HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白相對表達(dá)量（±s，n = 6）

表2 HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白相對表達(dá)量（±s，n = 6）

注：HIF-1α為低氧誘導(dǎo)因子-1α；VEGF為血管內(nèi)皮生長因子；MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9；n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 HIF-1α mRNA VEGF mRNA MMP-9 mRNA HIF-1α蛋白 VEGF蛋白 MMP-9蛋白images/BZ_44_987_2879_988_2880.png常氧 1.01±0.03 1.02±0.03 0.98±0.04 1.01±0.03 0.99±0.02 1.02±0.04低氧 4.43±0.35 3.55±0.28 3.24±0.25 3.22±0.25 2.89±0.22 2.43±0.19 t 值 13.768 11.353 11.769 9.746 8.642 5.749 P值＜0.001＜0.001＜0.001 0.002 0.009 0.019

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞Matrigel 小管形成能力（×100）

圖3 Western blot檢測HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白表達(dá)

圖4 Western blot檢測HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白表達(dá)

四、HUVEC的遷移細(xì)胞數(shù)和遷移距離比較

（一）HUVEC的遷移細(xì)胞數(shù)

低氧提高HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)（F= 138.754，P＜0.001），而DAPT 降低HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)（F= 409.246，P＜0.001），低氧和DAPT 交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1.049，P= 0.336，表4）。低氧和JAG-1均提高HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)（F= 263.776，P＜0.001；F= 227.439，P＜0.001），低氧和JAG-1 交互效應(yīng)具有協(xié)同作用（F= 43.215，P＜0.001，表4）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

（二）HUVEC的遷移距離

低氧提高HUVEC遷移距離（F= 72.600，P＜0.001），而DAPT降低HUVEC遷移距離（F= 123.267，P＜0.001），低氧和DAPT交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 0.067，P= 0.803，表5，圖5）。低氧和JAG-1均提高HUVEC遷移距離（F= 73.000，P＜0.001；F= 200.562，P＜0.001），低氧和JAG-1 交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 0.342，P= 0.575，表5）。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

五、HUVEC的小管形態(tài)和小管總長比較

低氧提高HUVEC的小管總長（F= 15.902，P= 0.004），而DAPT 降低HUVEC的小管總長（F= 8.051，P= 0.022），低氧和DAPT 對小管形成能力的交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 3.984，P= 0.081，表6）。低氧和JAG-1均提高HUVEC的小管總長（F= 22.514，P= 0.001；F= 17.277，P= 0.003），低 氧和JAG-1的交互效應(yīng)具有協(xié)同作用（F= 7.348，P= 0.027，表6）。HUVEC的小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

表3 HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白相對表達(dá)量（±s，n = 6）

表3 HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白相對表達(dá)量（±s，n = 6）

注：n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 Notch1 mRNA Dell4 mRNA Jagged1mRNA Notch1蛋白 Dell4蛋白 Jagged1蛋白常氧 0.98±0.01 0.98±0.02 0.97±0.03 1.01±0.03 1.00±0.04 1.03±0.05低氧 3.13±0.24 2.67±0.21 2.45±0.19 2.44±0.19 2.30±0.18 2.27±0.18 t 值 11.146 7.647 7.112 4.793 4.520 4.438 P值＜0.001 0.004 0.008 0.022 0.027 0.033

表4 低氧及DAPT、JAG-1對HUVEC遷移細(xì)胞數(shù)的影響（個(gè)，x±s）

圖5 倒置相差顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)（結(jié)晶紫染色，×200）

表5 低氧及DAPT、JAG-1對HUVEC遷移距離的影響（mm，x±s）

圖6 倒置相差顯微鏡下觀察不同組0和24 h HUVEC細(xì)胞傷口愈合（×100）

六、HUVEC的細(xì)胞增殖能力比較

低氧提高HUVEC的小細(xì)胞增殖（F= 54.914，P＜0.001），而DAPT 降低HUVEC的細(xì)胞增殖（F= 78.229，P＜0.001），低氧和DAPT 對細(xì)胞增殖的交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 0.914，P= 0.367）。低氧和JAG-1均提高HUVEC的細(xì)胞增殖（F= 160.013，P＜0.001；F= 98.299，P＜0.001），低氧和JAG-1的交互效應(yīng)具有協(xié)同作用（F= 21.831，P= 0.002）。（表7）

表6 低氧及DAPT、JAG-1對HUVEC 小管總長的影響（mm，x±s）

圖7 倒置相差顯微鏡下觀察HUVEC的小管形成（×100）

表7 低氧及DAPT、JAG-1對HUVEC細(xì)胞增殖的影響（488 nm OD，x±s）

討 論

血管系統(tǒng)的形成是影響人胎盤發(fā)育和功能的最早和最重要的事件之一，這是成功懷孕和胎兒生長的先決條件。人胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的建立是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，血管發(fā)生和血管生成是血管系統(tǒng)發(fā)育的兩個(gè)重要過程，血管發(fā)生之后的血管生成過程涉及血管的出芽、內(nèi)填和延長三個(gè)步驟[7]。氧分壓、氧化應(yīng)激、活性氧、炎癥因子等均可引起胎盤功能障礙，并且與血管生成因子和抗血管生成因子之間的不平衡密切相關(guān)[8]。越來越多的證據(jù)表明，人體胎盤的血管系統(tǒng)紊亂在先兆子癇、胎兒宮內(nèi)生長受限、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、胎兒窘迫等妊娠疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。因此，理解胎盤血管發(fā)生和血管生成過程中涉及的機(jī)制對正常受孕和胎兒生長具有重要意義。

胎盤的正常發(fā)育與胎盤血管生成密切相關(guān)，而氧分壓是血管生成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素。氧分壓異?？赡軐?dǎo)致人胎盤中的各種血管生成異常，從而導(dǎo)致先兆子癇、流產(chǎn)、早產(chǎn)等病理性妊娠的發(fā)生[10]。在妊娠早期階段，由于子宮螺旋動(dòng)脈為閉塞狀態(tài)且胎盤循環(huán)尚未完全建立，因此此時(shí)的胎盤約在2﹪～8﹪ O2的低氧調(diào)節(jié)下發(fā)育[11]。據(jù)報(bào)道，低氧能夠促進(jìn)毛細(xì)血管的形成及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[12]。本研究通過測試HUVEC的體外小管形成來模擬低氧條件下HUVEC的血管生成能力。研究發(fā)現(xiàn)常氧條件下HUVEC形成“管道樣”小管結(jié)構(gòu)較少且長度較短，而低氧條件可促進(jìn)“管道樣”結(jié)構(gòu)小管的生長。此外，本研究通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)評估了低氧對HUVEC的遷移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，低氧顯著提高了HUVEC的遷移能力。上述研究結(jié)果與前人報(bào)道一致，即一定程度的低氧可促進(jìn)胎盤血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

HIF-1α是細(xì)胞對低氧反應(yīng)的主要調(diào)控因子，HIF-1α 在人體內(nèi)廣泛存在[13]。低氧條件可導(dǎo)致HIF-1α 高表達(dá)，并激活其下游低氧反應(yīng)基因來調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞生成和凋亡等一系列生理過程[14]。據(jù)報(bào)道，HIF-1α 可調(diào)控編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)錄，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[15]。低氧導(dǎo)致HIF-1α 上調(diào)，然后HIF-1α 與VEGF 啟動(dòng)子中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)水平，進(jìn)而增加血管的通透性并促進(jìn)血管形成[16]。VEGF是新血管生成中的重要信號蛋白，主要由由刺激血管生成的細(xì)胞產(chǎn)生。VEGF的激活可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、存活以及血管的滲透性[17]。并且，VEGF的活化與胎盤血管形成密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可上調(diào)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的VEGF 水平，而氧分壓過高則會(huì)抑制VEGF的表達(dá)[18]。本研究應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測了低氧處理對HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)低氧處理均可顯著上調(diào)HUVEC 中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05）。表明低氧誘導(dǎo)的HUVEC 血管生成可能通過上調(diào)HIF-1α和VEGF 來介導(dǎo)。

近年來，人們越來越關(guān)注Notch信號傳導(dǎo)途徑在胎盤發(fā)育中的作用。Notch信號通路在進(jìn)化過程中高度保守，并且在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其他研究人員發(fā)現(xiàn)通過切除小鼠Notch1、Dell4或JAG-1 基因可導(dǎo)致血管嚴(yán)重紊亂和血管重塑障礙，從而引起胚胎死亡[19]。Notch信號成員在人胎盤中廣泛表達(dá)，尤其是Notch1、JAG-1和Dll4。此外，Notch信號分子是VEGF的下游靶基因，VEGF可通過激活Notch信號通路來促進(jìn)新生血管形成。有研究報(bào)道，在小鼠胚胎模型中注射VEGF的激活劑可上調(diào)VFGF的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)Notch信號通路相關(guān)因子的活化并促進(jìn)血管生成[20]。本研究應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測了低氧處理對HUVEC中Notch1信號分子的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。研究顯示低氧處理均可顯著上調(diào)HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05）。表明低氧可通過上調(diào)VEGF的表達(dá)進(jìn)而激活Notch信號通路來促進(jìn)胎盤血管生成。

各種研究表明，γ-分泌酶抑制劑（GSIs）如DAPT 可以有效阻斷Notch 受體的切割和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，相反，作為JAG-1的可溶性肽片段，JAG-1 可用于激活Notch信號傳導(dǎo)途徑[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Notch信號通路在HUVEC 血管生成中的作用，本研究分別應(yīng)用Notch1信號通路的抑制劑（DAPT）和激活劑（JAG-1）來處理HUVEC。研究發(fā)現(xiàn)DAPT處理顯著抑制了低氧誘導(dǎo)的HUVEC的小管形成、遷移和增殖能力，而JAG-1處理則進(jìn)一步提高了HUVEC的小管形成、遷移和增殖能力（P＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)了低氧通過激活Notch1信號通路來促進(jìn)胎盤血管生成。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在細(xì)胞的生長和血管生成中發(fā)揮重要作用，MMP-9 不僅參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且與胎盤血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧處理顯著上調(diào)HUVEC 中MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05）。提示低氧對HUVEC的遷移能力的促進(jìn)作用可能通過MMP-9 介導(dǎo)。

綜上所述，本研究表明低氧可通過激活HIF-1α/VEGF/Notch1信號通路顯著提高HUVEC的血管生成能力、遷移能力和增殖能力，從而促進(jìn)胎盤血管生成。