占繡萍，陳 秀，黃蘭淇，馬 琳，陳建波，朱衛(wèi)芳，趙 莉

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海)，上海 201103；2.上海市青浦區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201799)

單氰胺(cyanamide)是一種特殊的化合物，分子式為CH2N2，它是一種氨基氰。這種氰類(lèi)化合物普遍都有著比較強(qiáng)的毒性，尤其是單氰胺這一種化合物，有著極強(qiáng)的生物腐蝕性。作為一種毒性較強(qiáng)的化學(xué)藥物，單氰胺能夠腐蝕人體皮膚組織，并且刺激呼吸道，以及呼吸道黏膜。一旦單氰胺中毒，就會(huì)使中毒者呼吸急促，頭暈頭痛等情況[1-4]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)組織EPA將單氰胺列為高毒Ⅰ類(lèi)危險(xiǎn)農(nóng)藥[5]。

目前在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)登記的主要為50%單氰胺水劑，允許登記使用的作物為葡萄，并且不同廠家的產(chǎn)品毒性略不同，分別為低毒或中毒，它的主要作用是刺激葡萄的活性物質(zhì)，致使新陳代謝所需的核苷酸合成減少，起到打破休眠、促進(jìn)萌芽、提前成熟等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，可促使作物萌動(dòng)初期芽齊、芽壯，還可增加作物單產(chǎn)，改善品質(zhì)等。根據(jù)本市地產(chǎn)草莓、葡萄使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品質(zhì)和質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目的開(kāi)展，調(diào)查發(fā)現(xiàn)單氰胺也是上海葡萄種植戶(hù)使用非常普遍的植調(diào)劑之一。并且在GB2763-2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量中也明確規(guī)定了葡萄中的最大殘留限量為0.05mg/kg (臨時(shí)限量)，因此迫切需要建立葡萄中快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)單氰胺的殘留方法。

單氰胺極易溶于水，使用常規(guī)有機(jī)溶劑難以提取，相對(duì)分子量小，濃縮過(guò)程易揮發(fā)，無(wú)特征吸收峰，遇酸堿不穩(wěn)定，其殘留檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性。目前，單氰胺的檢測(cè)還沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于單氰胺的殘留檢測(cè)方法報(bào)道也較少，主要以柱前衍生間接測(cè)定為主。本文參照一些文獻(xiàn)[6-10]的方法，進(jìn)行不斷的優(yōu)化改進(jìn)，只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的衍生處理，無(wú)需凈化，即可滿(mǎn)足殘留檢測(cè)要求，建立了一種在葡萄中相對(duì)簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確的單氰胺殘留檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置 Agilent1290 UPLC-Agilent6460 MS/MS超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配ESI源，超聲波(Jump Ultrasonic cleaning)，高速勻漿機(jī)(IKA T25 digital)；GB11240-89電熱恒溫水浴鍋；AC-40氮吹濃縮器；國(guó)華SHAC恒溫振蕩器；TDL-5-A離心機(jī)；Milli Q超純水系統(tǒng)；漩渦混合器(SCI LoGex MX-S)。

1.2 試劑及溶液的配制 甲醇(色譜純，德國(guó)Merck)，丙酮(色譜純，TEDIA)，甲酸(色譜純，美國(guó)Fluka)，高純水，氯化鈉(分析純)；乙酸乙酯(分析純)；單氰胺(純度≥98%)和丹磺酰氯(DNS)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)。

5g/L DNS衍生劑：稱(chēng)取0.5g DNS，用丙酮溶解至50 mL。

碳酸鈉溶液(0.2mol/L):稱(chēng)取0.53g碳酸鈉，用水溶解并定容至25mL。

碳酸氫鈉溶液(0.2mol/L):稱(chēng)取1.68g碳酸氫鈉， 用水溶解并定容至100mL。

碳酸鈉/碳酸氫鈉混合溶液(0.2mol/L，4+46):吸取4 mL 0.2mol/L碳酸鈉水溶液，加入46 mL 0.2 mol/L 碳酸氫鈉水溶液混合均勻。

單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至25 mL，轉(zhuǎn)移到棕色標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備瓶中保存，然后再稀釋至120 mg/L備用。臨用前根據(jù)需要用丙酮稀釋成0.000 3、0.003、0.03、0.15、0.3mg/kg 的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的葡萄樣品5.0g ( 精確至0.01g) ，置于50 mL 塑料離心管中，補(bǔ)水1.0mL，然后加入25 mL 丙酮，并蓋上蓋子，渦旋振蕩3 min，超聲20min，以 4 000r/min 離心3min，待衍生化。

1.3.2 衍生化 葡萄樣品衍生化：取0.5mL 上清液于10mL離心管中，加入0.5mL碳酸鈉/碳酸氫鈉混合溶液，混勻后再加入0.5mL丹磺酰氯丙酮溶液，渦旋1min，于50℃水浴中靜置衍生1h，衍生后，過(guò)0．22μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液也按照此方法同時(shí)進(jìn)行衍生化。

1.4 檢測(cè)條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱: Agielnt Eclipse Plus C18柱( 3.0 mm×150mm，3.5μm) ; 以0.1%甲酸水溶液( A 相) 和甲醇(B 相)=50+50為流動(dòng)相進(jìn)行等度度洗脫; 流速為0.4mL/min; 進(jìn)樣量: 2μL; 柱溫: 40℃。目標(biāo)化合物出峰時(shí)間為3.5min左右。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用AJS ESI源，ESI-電離模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè)；霧化氣壓力：310.3kPa(40psi)；干燥氣溫度與流速：300℃，7L/min；鞘氣溫度與流速：350℃，12L/min；毛細(xì)管電壓：負(fù)離子 3 500V。

表1 單氰胺的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 提取劑的選擇 文獻(xiàn)研究表明，單氰胺在水中溶解度高，但是提取不易濃縮，而且易提取出一些極性物質(zhì)，影響衍生；單氰胺用乙腈提取，有機(jī)層衍生，回收率低，所以本研究不考慮水和乙腈做提取劑。本試驗(yàn)選取沸點(diǎn)低、對(duì)單氰胺有較高溶解度的丙酮、甲醇、乙酸乙酯等3種常用試劑來(lái)考察，再通過(guò)高速勻漿提取1min，用乙酸乙酯提取的需要加無(wú)水硫酸鈉除水后衍生，其他試劑不需除水，直接衍生。結(jié)果表明，在丙酮、甲醇、乙酸乙酯3組試驗(yàn)中，單氰胺回收率均不足50%，回收率具體數(shù)據(jù)(表2)。原因可能是提取方式、提取時(shí)間不夠，導(dǎo)致不能完全提取出該化合物。

表2 葡萄基質(zhì)中采用不同提取劑時(shí)單氰胺的回收率

2.1.2 提取方式的選擇 根據(jù)2.1.1中提取劑篩選試驗(yàn)的結(jié)果，本試驗(yàn)首選用丙酮進(jìn)行提取方式的進(jìn)一步優(yōu)化，勻漿1min、勻漿2min、超聲10min 和超聲20min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲20min，回收率能夠滿(mǎn)足要求。原因可能是超聲波穿透作用強(qiáng)，加速了單氰胺從基質(zhì)中萃取到大量溶劑中，而超聲10min，穿透的時(shí)間還不夠，導(dǎo)致回收率不夠，所以本試驗(yàn)最終選擇了自動(dòng)超聲20min的提取方式。需要注意的是建議使用扣蓋的離心管，并且在管口和蓋子接觸的地方再用保鮮膜封一層，避免因?yàn)槌晻r(shí)間久、溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。具體結(jié)果(表3)。

表3 葡萄基質(zhì)中不同方式、不同時(shí)間提取單氰胺的回收率

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 本試驗(yàn)基于三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀確立單氰胺衍生物的質(zhì)譜條件，衍生產(chǎn)物分子量為275，質(zhì)譜通過(guò)MS SCAN方式分別進(jìn)行正、負(fù)離子模式全掃描，調(diào)節(jié)碎裂電壓，發(fā)現(xiàn)正離子模式掃描方式下，可以得到較強(qiáng)的[M+H]峰母離子276，負(fù)離子模式掃描方式下，得到較強(qiáng)的[M-H]峰母離子274 。根據(jù)子離子掃描、MRM方式，正離子模式下得到豐度較好的2個(gè)碎片離子，分別為156.1(定量離子)、171.1(定性離子)；負(fù)離子模式下得到豐度較好的2個(gè)碎片離子，分別為258(定量離子)、230(定性離子)。經(jīng)過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式出峰時(shí)間更快，并且靈敏度、峰形略?xún)?yōu)于正離子模式方式，因此本試驗(yàn)選擇負(fù)離子模式MRM電離方式。0.1mg/kg的色譜圖和碎片圖譜正負(fù)離子模式(圖1、2)。

圖1 0.1mg/kg單氰胺的色譜圖、碎片圖(MRM/ ESI-)

圖2 0.1mg/kg單氰胺的色譜圖、碎片圖(MRM/ ESI+)

2.3 結(jié)果計(jì)算 試樣中單氰胺的殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，以mg/kg表示，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

A——試樣溶液中單氰胺衍生物的峰面積；

As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中單氰胺衍生物的峰面積；

ρs——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中單氰胺的質(zhì)量濃度， mg/L;

V——提前液的總體積(提取有機(jī)溶劑體積加補(bǔ)水的體積再加上基質(zhì)含水的體積)，mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

3——衍生稀釋倍數(shù)。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留2位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果>1mg/kg時(shí)，保留3位有效數(shù)字。

2.4 回收率、精密度和定量限 按0.001、0.01、0.05、0.1mg/kg 4個(gè)添加水平向葡萄樣品中添加單氰胺，每個(gè)添加水平重復(fù)5次，并做空白對(duì)照。按本方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和測(cè)定，考察單氰胺的回收率，具體結(jié)果(表4)。單氰胺在葡萄中的平均回收率為79.7%～92.9 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～5.1%?？梢?jiàn)該方法具有較高的回收率和較好的精密度，可以滿(mǎn)足葡萄中單氰胺殘留量檢測(cè)要求。根據(jù)添加回收試驗(yàn)確定葡萄中單氰胺殘留檢測(cè)定量限為0.001mg/kg 。

表4 葡萄中單氰胺平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 線性方程 取一定量的單氰胺儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋成0.000 3、0.003、0.03、0.15、0.3 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照1.3.2衍生化條件進(jìn)行衍生，實(shí)際上機(jī)濃度為0.000 1、0.001、0.01、0.05、0.1mg/kg。以標(biāo)樣的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制成單氰胺衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到線性回歸方程y = 3E+06x + 16 448，R=0.991，線性較好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定 按所建立的方法對(duì)2019年抽取了上海散戶(hù)種植的葡萄中單氰胺殘留量進(jìn)行測(cè)定。20個(gè)葡萄樣品中有6個(gè)樣品檢測(cè)單氰胺殘留，殘留量為0.001 1～0.008 4mg/kg。對(duì)照最新發(fā)布的GB 2763-2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，葡萄中單氰胺MRL為0.05mg/kg(臨時(shí)限量)，檢出的6個(gè)樣品均未超標(biāo)。

3 結(jié)論

本研究利用丙酮超聲提取，無(wú)需凈化直接與DNS衍生反應(yīng)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定葡萄中單氰胺殘留的方法。前處理過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確，靈敏度高、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，適用于葡萄樣品中大批量檢測(cè)。