張慧敏 袁麗倩 高習華 史奎竹 馬傳寶 謝清清 王榮孝 張玉娜

再生障礙性貧血(AA)是一種因骨髓造血功能不良而導致外周血全血細胞減少的骨髓衰竭綜合征，免疫異常為其主要發(fā)病機制。最近研究表明，端粒酶基因突變、端?？s短也參與了AA的發(fā)病[1]。端粒是位于染色體末端、保護染色體完整的重復DNA序列。端粒隨細胞分裂逐漸縮短，當縮短到一定程度時會導致細胞衰老或凋亡。端粒酶可修復磨損的端粒。端粒酶基因突變會使端粒縮短或功能障礙，導致基因組不穩(wěn)定。目前AA被認為是一種端粒相關疾病，在本疾病中，抗原驅(qū)動、自身免疫失調(diào)和T細胞穩(wěn)態(tài)失衡參與造血干細胞損傷，端粒酶功能缺陷在某些情況下也發(fā)揮作用。本研究旨在探討AA患者外周血白細胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒酶核糖核酸組分(TERC)基因突變情況及其臨床意義。

對象與方法

1.對象：納入2017年3月～2018年3月于我科就診的初診獲得性AA患者30例，其中男14例，女16例，年齡24～69歲，平均年齡(35.66±10.30)歲。納入同期于我院健康體檢者15例，其中男7例，女8例，年齡25～69歲，平均年齡(36.28±9.82)歲。所有AA患者均無血液系統(tǒng)疾病家族史，均符合《血液病診斷及療效標準》(第4版)推薦的AA診斷標準。排除標準：(1)先天性AA；(2)年齡<14歲；(3)妊娠或哺乳期。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)標本采集：抽取受試者外周血2 ml，采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，加入紅細胞裂解液，以1 700r/min離心8 min。去除上清紅細胞，留取白細胞。

(2)檢測方法：①設計引物(TERT第1外顯子1對；TERT第2外顯子4對；TERC外顯子2對)：TERT1-F：CCCTCCCCTTCCTTTCCG；TERT1-R：CTGGTGGTGAAGGCCTCG；TERT2-1F：CAGTGCCTGGTGTGCGTG；TERT2-1R：AGACTTCGGCTGGCACTG；TERT2-2F：AACCATAGCGTCAGGGAGG；TERT2-2R：CGCCTGAGGAGTAGAGGAAG；TERT2-3F：CACTCCCACCCATCCGTG；TERT2-3R：GTCTGTGTCCTCCTCCTCG；TERT2-4F：TGCTCCTCAAGACGCACTG；TERT2-4R：ATTCAGCTCTGGGGCCTG。TERC-1F：CTTTATAAGCCGACTCGCCC；TERC-1R：ACTCGCTCCGTTCCTCTTC；TERC-2F：GCCTTCCACCGTTCATTCTA；TERC-2R：ATTCATTTTGGCCGACTTTG。②采用臺灣芮寶生醫(yī)股份有限公司的核酸提取儀(MagCore)及核酸提取試劑盒(MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit)提取所有受試者白細胞基因組DNA。③采用杭州博日LifePro基因擴增儀進行聚合酶鏈反應(PCR)反應。反應體系：2×Vazyme LAmp Master Mix(上海信裕生物科技有限公司)5 μl，ddH2O 3 μl，引物1 μl，DNA模板1 μl。④采用北京鼎國昌盛DG-600C電泳儀和美國BIO-RAD ChemiDocXRS和凝膠成像系統(tǒng)進行瓊脂糖凝膠電泳分析。⑤采用TaKaRa公司Alkaline Phosphatase(Shrimp)酶解試劑進行PCR產(chǎn)物酶解消化。⑥測序反應操作。⑦乙醇沉淀純化。⑧采用美國Life Technologies ABI3500XL基因分析儀進行基因測序。

(3)結(jié)果判斷：通過Mutation Surveyor軟件對TERT和TERC序列進行對比和分析。參考美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，篩選軟件指出的測序結(jié)果與參考序列不一致之處，再結(jié)合臨床信息得到各外顯子的突變信息。

3.統(tǒng)計學處理：計數(shù)資料以例和百分比表示。

結(jié) 果

所有受試者TERT、TERC基因突變及單核苷酸多態(tài)性(SNP)結(jié)果：30例AA患者中僅有1例(3.3%)TERC突變(n.389C→T)，測序結(jié)果見圖1、2，未發(fā)現(xiàn)TERT第1、2外顯子突變。15例對照組受試者中未發(fā)現(xiàn)TERC及TERT第1、2外顯子突變。30例AA患者中有11例(36.7%)存在TERT第2外顯子SNP(n.915G→A)，19例(63.3%)存在TERC外顯子SNP(n.514G→A)；15例對照組中有8例(53.3%)存在TERT第2外顯子SNP(n.915G→A)，11例(73.3%)存在TERC外顯子SNP(n.514G→A)。

討 論

AA是以造血干細胞為靶器官的自身免疫性疾病，免疫抑制治療(IST)效果顯著，但仍有1/3的患者無效，其中部分應用雄激素治療有效，這些患者可能存在端粒酶基因突變和端?？s短[2]。端粒能夠保護染色體不受損害，端?？s短會導致基因組不穩(wěn)定，引發(fā)骨髓衰竭或腫瘤。端粒長度的維持主要依靠端粒酶。端粒酶主要由TERT、TERC及端粒酶相關蛋白組成。端粒酶以TERC為模板、TERT為催化亞基逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA以彌補端粒損耗。端粒酶主要在干細胞和高度增殖的細胞(如淋巴細胞、癌細胞)中表達，在大多數(shù)成熟細胞中不表達。端粒酶活性主要受TERT基因表達的調(diào)控，TERT啟動子含有雌激素受體，雌激素和雄激素對端粒酶的表達和活性起重要調(diào)節(jié)作用。正常的端粒酶活性和端粒長度對細胞行使正常功能至關重要，端?？s短會阻礙干細胞的再生潛能。端?？s短在遺傳性AA(如先天性角化不良、Fanconi貧血)中普遍存在，原因是編碼端粒酶的基因[如TERT、TERC、Dyskerin假尿苷合成酶1(DKC1)]發(fā)生突變。約1/3的獲得性AA患者存在端粒縮短，某些情況下亦與TERT或TERC突變有關。尤其是致病性TERT啟動子突變對于端粒酶功能障礙性疾病具有特異性[3]。這些突變使端粒酶活性降低、端粒縮短加快、造血干細胞增殖能力下降，臨床上均可導致骨髓衰竭。

國外報道雖有1/3 AA患者有端?？s短，但存在端粒酶基因突變的患者不足10%，其中TERT和TERC的突變率各占4%，這些患者端粒酶活性減低、端粒縮短，對IST反應差，與克隆轉(zhuǎn)化相關[4]。本研究30例AA患者中僅發(fā)現(xiàn)1例TERC突變(n.389C→T)，TERC突變率為3.3%，與國外報道相近，但此突變位點在獲得性AA中未見報道。Vulliamy等[5]報道獲得性AA與TERC突變之間的關聯(lián)，他們在17例獲得性AA患者中發(fā)現(xiàn)2例TERC突變(n.58G→A)，然而，在4%～10%的健康非洲受試者中也發(fā)現(xiàn)這種突變，但對端粒酶活性沒有影響，被證明是非洲人常見的SNP(指基因組DNA序列中單個核苷酸變異而引起的物種多態(tài)性，一般不影響基因功能)。后續(xù)研究表明，少數(shù)AA患者存在TERC的真正致病性突變，這些患者缺乏先天性AA的疾病特征和家族史，且在大量健康對照組受試者中未觀察到這些突變。Han等[6]在中國北方地區(qū)66例AA患者中檢測出2例(3.0%)TERC雜合突變(n.37N→G、n.66G→C)均無血液系統(tǒng)疾病家族史，對IST也無反應。本研究中TERC突變的患者無家族史，且臨床癥狀較重，對IST無反應。

TERT突變與獲得性AA的關系也已被證實，突變可能發(fā)生在酶的任何區(qū)域。值得注意的是，攜帶TERT或TERC突變的患者，其健康親屬也可能存在端粒酶突變、端?？s短。如果選擇了受影響的同胞供者進行造血干細胞移植，可能會導致移植失敗。一項研究在96例日本AA患兒中發(fā)現(xiàn)了2例(2.1%)雜合TERT突變，但未發(fā)現(xiàn)TERC突變，其中1例女孩(TERT第6外顯子：n.2177C→T)端粒很短、對IST無反應。該女孩的父親無相關臨床癥狀，也存在此突變，但他的端粒卻沒有縮短[7]。該研究在患兒及對照組中均檢測到高頻率的TERT、TERC基因的SNP，與本研究結(jié)果相符，但本研究未對TERC突變的AA患者家屬進行端粒酶基因及端粒長度檢測。王西閣等[8]在69例AA患兒中未檢測到TERT、TERC基因的任何突變。本研究也未發(fā)現(xiàn)TERT突變，可能原因為地域差異或僅檢測了突變常發(fā)生的第1、2外顯子，但并不排除TERT突變在AA發(fā)病中的可能作用。最近研究發(fā)現(xiàn)TERT突變會破壞其與核酸底物結(jié)合，導致端粒酶全酶無法正確組裝核酸底物，端粒酶活性喪失，不能完整延伸端粒，從而導致端?？s短[9]。雖然亞洲人群AA發(fā)病率高于西方人群，但亞洲人群TERT、TERC突變率并不高。端粒酶基因突變率遠低于端?？s短率，說明端粒酶基因突變不是唯一導致端粒縮短的因素，還可能存在其他因素，如氧化應激、慢性炎癥、藥物暴露等，端粒酶基因突變更可能作為遺傳高危因素而不是遺傳決定因素。

雄激素很早即用于治療AA，其作用靶點可能是端粒酶，作用機制是雄激素在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為雌激素，與TERT上的雌激素受體結(jié)合，上調(diào)造血細胞TERT基因表達和端粒酶活性，使端粒延長、造血功能恢復。應用雄激素治療的AA患者端粒酶活性明顯升高，同時血液學指標改善[10]，而且，端粒酶激活可能并不會導致細胞永久增殖而致癌。Muoz-Lorente等[11]將攜帶端粒酶基因的病毒載體轉(zhuǎn)染至AA小鼠中激活端粒酶，顯示出其療效和安全性，即使TERT過表達也未觀察到致癌傾向。端粒縮短的AA患者選擇雄激素治療可能效果更佳，檢測端粒酶基因突變有助于選擇合適的造血干細胞移植家屬供者。

端粒酶基因和功能的研究開啟了人們利用端粒酶激活作為AA等端粒相關疾病治療靶點的新思路。但以端粒酶為靶點的治療策略仍存在進步空間和巨大挑戰(zhàn)，隨著這一領域的深入探索，端粒酶將會在防治AA等端粒相關疾病的臨床應用方面發(fā)揮作用。