戴菁 王學(xué)鋒

血友病是常見的遺傳性出血性疾病，分為A(HA)和B(HB)兩型，其發(fā)病原因是凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因(F8)或Ⅸ(FⅨ)基因(F9)缺陷導(dǎo)致蛋白的合成缺陷或質(zhì)的異常，或兩者兼有。根據(jù)國(guó)際血友病聯(lián)盟(WFH)的統(tǒng)計(jì)，男性HA發(fā)生率為1/5 000，HB約為HA的1/5，且疾病的發(fā)生與地域、種族無關(guān)[1]。我國(guó)人口眾多，血友病患者的絕對(duì)人數(shù)較多，據(jù)中國(guó)血友病協(xié)作組統(tǒng)計(jì)，自我國(guó)開展血友病患者信息登記工作以來，目前共登記的HA患者例數(shù)為23 000例，HB患者為3 600例[2]。近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室篩查和檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)，對(duì)輕型血友病患者的診斷率提高，發(fā)病率有所上升。

一、血友病的發(fā)病機(jī)制

F8基因位于Xq28，全長(zhǎng)186 kb，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成，F(xiàn)Ⅷ mRNA全長(zhǎng)約為9 kb，編碼由2 351個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中包括1條19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，成熟的肽鏈由2 332個(gè)氨基酸以A1-A2-B-A3-C1-C2的方式排列，F(xiàn)Ⅷ蛋白分泌入血后，在血液中與血管性血友病因子(vWF)結(jié)合，以FⅧ/vWF復(fù)合物形式存在，后者可穩(wěn)定FⅧ，防止其過早降解。F8基因結(jié)構(gòu)龐大，且導(dǎo)致HA的基因突變種類繁多，其中基因內(nèi)含子22倒位突變引起的FⅧ蛋白缺乏占重型HA分子發(fā)病機(jī)制的42%[3]；而內(nèi)含子1倒位的發(fā)生率約占重型HA的2%～5%[4]，其余幾乎每個(gè)家系都有不同的突變。目前，F(xiàn)8基因突變數(shù)據(jù)庫報(bào)道了2 015種不同的突變[5]，包括點(diǎn)突變、基因缺失、基因插入、無義突變、剪接突變等，從而提示F8基因異常具有高度的異質(zhì)性；中型和輕型血友病中，86%為錯(cuò)義突變。上海瑞金醫(yī)院分別對(duì)933例有家族史的HA患者及393例散發(fā)HA患者的基因突變譜進(jìn)行整理分析(圖1)，各突變類型與突變數(shù)據(jù)庫的報(bào)道結(jié)果類似[6]。

F9基因片段較小，相對(duì)于F8結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，長(zhǎng)約34 kb，含8個(gè)外顯子，F(xiàn)Ⅸ mRNA長(zhǎng)約2.8 kb，編碼由461個(gè)氨基酸組成的多肽鏈前體，經(jīng)信號(hào)肽酶和蛋白酶切除信號(hào)肽和原肽，并經(jīng)過糖基化、二硫鍵形成、氨基端12個(gè)氨基酸羧基化及第I類表皮生長(zhǎng)因子區(qū)第64位天冬氨酸β羥化等一系列化學(xué)修飾后形成含415個(gè)氨基酸的成熟FⅨ。FⅨ基因突變包括缺失、插入和點(diǎn)突變，目前F9突變數(shù)據(jù)庫收錄的突變位點(diǎn)有1 094種，其中約80%為單個(gè)堿基突變[7]。

二、血友病基因診斷

通過基因診斷可以更精準(zhǔn)地為血友病患者及其家屬開展優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)，尤其是對(duì)家族中有生育希望及可能的女性進(jìn)行攜帶者基因檢測(cè)，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育有重要價(jià)值[8-11]。同時(shí)，對(duì)血友病患者進(jìn)行明確的基因診斷有利于接受預(yù)防治療的患者更明確地知曉導(dǎo)致疾病的基因類型。越來越多的研究提示某些特殊的基因突變位點(diǎn)與抑制物的發(fā)生相關(guān)[12-14]，針對(duì)不同突變位點(diǎn)采取不同治療方案的措施也在逐步探索中，有望在未來實(shí)現(xiàn)對(duì)血友病患者的個(gè)體化治療[15]。我們現(xiàn)對(duì)目前常用的基因診斷策略及基因診斷存在的問題作一簡(jiǎn)要評(píng)述。

1.HA基因診斷常規(guī)流程

(1)內(nèi)含子倒位的檢測(cè)：內(nèi)含子22倒位是20% HA患者的致病突變，是45%重型HA患者的致病突變。內(nèi)含子22倒位是F8基因第22內(nèi)含子內(nèi)的Int22h序列與基因外的兩個(gè)與之高度同源的序列(Int22h-2、Int2h-3)之一發(fā)生染色體內(nèi)的同源重組(圖2A)，導(dǎo)致F8基因在外顯子1～22與23～26間發(fā)生斷裂，不能合成正常的凝血因子FⅧ，導(dǎo)致重型HA。內(nèi)含子1倒位是繼內(nèi)含子22倒位后被發(fā)現(xiàn)的另一導(dǎo)致HA的重要發(fā)病機(jī)制，系內(nèi)含子1內(nèi)的Inth-1與基因外的高度同源的序列Inth-2發(fā)生染色體內(nèi)的同源重組(圖2B)，導(dǎo)致FⅧ蛋白不能正常合成。因此，首先需要對(duì)HA患者的F8基因內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位進(jìn)行檢測(cè)。用于檢測(cè)內(nèi)含子22倒位的經(jīng)典方法是Southern Blot法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要使用熒光標(biāo)記物，不利于實(shí)驗(yàn)室開展[16]；長(zhǎng)鏈PCR(LD-PCR)方法是由Steve Sommer設(shè)計(jì)的一種簡(jiǎn)便的內(nèi)含子22倒位檢測(cè)方法， 但由于需要擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為11 kb和12 kb，因此該檢測(cè)方法對(duì)技術(shù)要求比較高[17]；Rossetti等[18]用反轉(zhuǎn)位移PCR(IS-PCR)的方法進(jìn)行內(nèi)含子22倒位的檢測(cè)，雖然可將擴(kuò)增片段縮小，但由于其要求大量的DNA(1～2 μg)及很多步驟的酶切、自連接過程，使用起來也不是很方便；我們團(tuán)隊(duì)建立了一種結(jié)合LD-PCR和AccuCopy技術(shù)定量的方法對(duì)內(nèi)含子22倒位進(jìn)行檢測(cè)[19]，能準(zhǔn)確地區(qū)分各種不同類型的倒位組合，使得內(nèi)含子22倒位檢測(cè)的便利性和準(zhǔn)確性得到了很大提升。當(dāng)內(nèi)含子22倒位或內(nèi)含子1倒位檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，我們需要對(duì)F8基因的編碼序列進(jìn)行檢測(cè)。

(2)F8基因26個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列的基因檢測(cè)：分別針對(duì)F8基因的共26個(gè)外顯子及5’端和3’端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用PCR的方法將上述目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后采用Sanger法進(jìn)行基因序列的檢測(cè)。使用該方法可以檢測(cè)出絕大部分的F8基因突變位點(diǎn)，包括小片段的缺失、插入、點(diǎn)突變(無義突變和錯(cuò)義突變)、剪切位點(diǎn)突變等。F8基因的第14號(hào)外顯子是最大的外顯子片段，該外顯子編碼FⅧ蛋白的B區(qū)，約占總編碼區(qū)的43%，有研究[20]顯示，21%的點(diǎn)突變可發(fā)生在該外顯子區(qū)段，但更多的是小片段的缺失和插入(約占47%)，雖然B區(qū)在FⅧ蛋白成熟過程中會(huì)被剪切，但發(fā)生在該區(qū)段的基因改變?nèi)钥捎绊慒Ⅷ蛋白的分泌效率[21-22]。

(3)間接基因診斷：對(duì)于HA患者，由于F8基因不僅龐大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，直接查找突變費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故可以采用結(jié)合遺傳連鎖分析的間接診斷方法進(jìn)行HA的攜帶者與產(chǎn)前診斷，發(fā)掘高信息量的多態(tài)性位點(diǎn)并通過遺傳連鎖分析的方法可以定位致病基因所在的染色體，但這些多態(tài)性位點(diǎn)的信息量在各個(gè)人群中存在差異性，如在歐美地區(qū)有高診斷信息量的常用位點(diǎn)(STR、CA12、CA22、BclI)在我國(guó)人群的信息量?jī)H為27%[23]，我們先后開發(fā)了適合中國(guó)人群的二代、三代連鎖分析位點(diǎn)結(jié)合性別位點(diǎn)，利用多重PCR一次擴(kuò)增，累計(jì)識(shí)別能力達(dá)到99%以上[24]，很好地彌補(bǔ)了直接診斷的短板，但由于基因的復(fù)雜性，遺傳連鎖分析所選擇的位點(diǎn)并不能完全避免基因重組的發(fā)生對(duì)結(jié)果的干擾和誤判。

2.HB基因診斷流程

由于F9基因較小，可采用直接的核酸測(cè)序方法進(jìn)行基因突變檢測(cè)；F9基因外的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增可用于HB的遺傳連鎖分析，但也無法排除基因重組的發(fā)生對(duì)其結(jié)果的干擾。

3.特殊血友病患者的基因檢測(cè)方法

(1)拷貝數(shù)檢測(cè)：運(yùn)用上述基因診斷策略基本能對(duì)90%以上的HA患者作出明確的基因診斷，但仍有10%左右的患者未能找到明確的突變位點(diǎn)，需要用其他的技術(shù)進(jìn)行診斷?；蚩截悢?shù)變化也是導(dǎo)致蛋白異常表達(dá)的一種基因改變，但應(yīng)用常規(guī)的測(cè)序技術(shù)并不能檢出，多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)可用于檢測(cè)基因拷貝數(shù)的變化，如雙重拷貝、三重拷貝等異常[25-26]。AccuCopy是一種在多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上進(jìn)行拷貝數(shù)變異性檢測(cè)的技術(shù)[27]，利用該技術(shù)可以對(duì)目的基因片段中的拷貝數(shù)情況進(jìn)行檢測(cè)。我們對(duì)10例利用常規(guī)方法未找到基因異常位點(diǎn)的HA患者進(jìn)行了AccuCopy拷貝數(shù)檢測(cè)[28]，均明確了拷貝數(shù)異常的位點(diǎn)，為HA基因診斷提供了可靠的補(bǔ)充檢測(cè)手段。

(2)NGS(Next-Generation Sequencing)檢測(cè)：NGS又稱二代測(cè)序[29]，其相對(duì)于Sanger一代測(cè)序而言，是近幾年發(fā)展起來的一種高效率的基因測(cè)序方法，其檢測(cè)深度和廣度、高通量等特性使其在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，如腫瘤篩查等。Sanger法測(cè)序需要事先知道目的基因的序列，但NGS則無此要求，從而使NGS方法可以發(fā)現(xiàn)更多未知的致病基因，例如在兒科，多種先天性疾病之前無法明確致病基因，但隨著NGS方法的運(yùn)用，越來越多的先天性疾病得到了明確的基因診斷。由于NGS方法獲得的數(shù)據(jù)信息量很大，如何從海量的信息中捕獲具有疾病診斷意義的異?；蛐枰?jīng)驗(yàn)豐富的科研人員進(jìn)行篩選。Jose等[30]建立了一種針對(duì)F8、F9和vWF基因的NGS檢測(cè)組合，對(duì)102份標(biāo)本(97例HA/HB患者和5例女性攜帶者)進(jìn)行了檢測(cè)，其診斷率可達(dá)到99%；應(yīng)用NGS方法對(duì)F8基因進(jìn)行檢測(cè)還可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子深部的位點(diǎn)變異，這種類型的變異往往可導(dǎo)致輕型或中型血友病的發(fā)生，這也是為何輕型或中型血友病用常規(guī)基因檢測(cè)方法未能找到基因異常的原因。

(2)女性HA的基因診斷：女性HA十分罕見，首先需要注意和血管性血友病在表型上進(jìn)行鑒別；在對(duì)F8基因進(jìn)行檢測(cè)后，若能發(fā)現(xiàn)基因缺陷，則對(duì)確立女性血友病的診斷具有重要價(jià)值。上海瑞金醫(yī)院診斷的3例女性HA患者中的2例分別是內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位導(dǎo)致的重型HA，其另一條X染色體非隨機(jī)滅活；另1例女性患者存在雙雜合突變導(dǎo)致重型血友病A的發(fā)生[31]。

(4)散發(fā)家系：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大約1/3的HA家系為無家族史的散發(fā)家系，對(duì)于這些家系，目前主要通過直接診斷和間接診斷相結(jié)合的策略。但是散發(fā)家系的診斷需要考慮細(xì)胞嵌合現(xiàn)象的存在，本課題組對(duì)2005～2016年來院就診的393個(gè)散發(fā)HA家系的基因突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大部分散發(fā)HA患者的母親為攜帶者，其致病基因的來源可追溯到患者的外公(60%)或母親(12%)，28%的散發(fā)患者為自發(fā)突變，體細(xì)胞嵌合現(xiàn)象在散發(fā)家系中存在的比例較高[6]。

三、血友病基因診斷存在的問題

由于基因診斷是近十幾年來逐漸在臨床上推廣應(yīng)用的新技術(shù)，對(duì)于疾病與基因之間的關(guān)系也隨著越來越多研究工作的開展而逐漸揭開了神秘的面紗，我們所面臨的問題也越來越清晰、明確。

(1)技術(shù)問題：以F8基因內(nèi)含子22倒位檢測(cè)為例，從最早發(fā)明該突變熱點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)以來，檢測(cè)方法不斷更新?lián)Q代，從Southen Blot、LD-PCR、IS-PCR到AQ-PLP等技術(shù)，使得對(duì)內(nèi)含子22倒位的檢測(cè)方法靈敏度和準(zhǔn)確度均得到較好改善，各種非經(jīng)典的內(nèi)含子22倒位類型不斷被發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞嵌合標(biāo)本的最低檢測(cè)率可達(dá)到2%，有效提高了散發(fā)家系基因突變的檢出率。我們利用AQ-PLP技術(shù)對(duì)1例無家族史的HA家系進(jìn)行內(nèi)含子22倒位檢測(cè)[32]，發(fā)生該先證者F8基因存在一種新型的22倒位模式(Int22h-2、Int22h-3、Int22h-2/-1)，并通過對(duì)其母親的各種體細(xì)胞嵌合率檢測(cè)結(jié)果分析，認(rèn)為其母親為嵌合攜帶者，且突變發(fā)生在胚胎發(fā)育早期。

F8和F9基因結(jié)構(gòu)異常也是影響基因檢測(cè)的一個(gè)重要因素,常規(guī)技術(shù)對(duì)基因結(jié)構(gòu)異常無法檢出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在重型HA和HB患者中存在結(jié)構(gòu)異常的概率分別為6%和10%[33]。結(jié)構(gòu)異常合并突變位點(diǎn)同時(shí)存在的案例也有報(bào)道[34]，進(jìn)一步體現(xiàn)了血友病基因診斷的復(fù)雜性。

(2)患者家族對(duì)基因診斷的認(rèn)識(shí)：2012年美國(guó)一項(xiàng)針對(duì)血友病基因檢測(cè)患者的調(diào)查結(jié)果顯示[35-36]，僅有20%的血友病患者進(jìn)行了基因檢測(cè)，分析其原因，一部分是由于檢測(cè)費(fèi)用高昂，無法由保險(xiǎn)支付；另一個(gè)重要原因就是缺乏可靠的檢測(cè)技術(shù)手段。目前所有的檢測(cè)技術(shù)由于各種原因限制及基因突變復(fù)雜性、異質(zhì)性等特點(diǎn)的影響，均無法達(dá)到100%的檢測(cè)準(zhǔn)確率。加拿大的一項(xiàng)對(duì)10年間全國(guó)血友病基因檢測(cè)的研究數(shù)據(jù)表明，HA和HB的基因檢測(cè)可診斷率分別為91%和94%[20]。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，即使是最新的NGS技術(shù)用于血友病的基因檢測(cè)，仍有患者無法得到明確的基因結(jié)果[37-38]，利用最新的NGS技術(shù)結(jié)合MIP分子檢測(cè)策略，HA和HB的可診斷率分別達(dá)到了98.1%和99.3%[39]，但仍然有血友病患者在所有能使用的基因檢測(cè)方法后還是無法明確基因異常位點(diǎn)。

綜上所述，血友病基因檢測(cè)所面臨的問題和挑戰(zhàn)并存，對(duì)于血友病患者來說，他們需要正確認(rèn)識(shí)血友病基因診斷在疾病的治療、優(yōu)生優(yōu)育及抑制物產(chǎn)生的指導(dǎo)作用，以及基因診斷的現(xiàn)狀；醫(yī)務(wù)科研工作者需要不斷地改進(jìn)基因檢測(cè)技術(shù)及分析基因診斷結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，梳理基因與疾病的關(guān)系，更好地為血友病的基因治療、個(gè)體化治療探索基因?qū)殠臁?/p>