劉地，李博，畢成，喬宏萍，武曉英

·生物技術與方法·

具備定點偶聯(lián)功能的HBc-VLPs的制備與性質鑒定

劉地1，李博1，畢成2，喬宏萍1，武曉英1

1 太原師范學院 生物系 天然生物活性成分創(chuàng)制獸藥工程中心，山西 晉中 030619 2 悉尼大學 科學院，澳大利亞 新南威爾士州 2006

乙型肝炎病毒核心蛋白HBc，可在體外自組裝形成二十面體對稱結構的病毒樣微粒VLPs。VLPs可將外源序列重復且高密度地展示在表面，VLPs進入機體后能夠快速誘導機體產(chǎn)生針對外源性抗原的特異性體液免疫及細胞免疫應答，具有極強的免疫原性與生物活性。因此，HBc-VLPs可以作為一種安全、有效的疫苗載體。文中設計了一種能夠實現(xiàn)與抗原定點偶聯(lián)的HBc-VLPs，并開發(fā)了一套高效制備HBc-VLPs的方法。通過定點突變技術，使翻譯后的多肽序列第80位氨基酸由Ala變?yōu)镃ys，在HBc-VLPs的主要免疫顯性區(qū)域引入一個定點交聯(lián)位點，構建了原核表達載體pET28a(+)-，表達、純化獲得了高純度的HBc(A80C) 單體蛋白；在PB緩沖體系中，HBc(A80C) 蛋白自組裝形成HBc-VLPs納米粒子。粒度儀的測定結果表明，HBc-VLPs納米微粒的平均粒徑為29.8 nm，透射電子顯微鏡觀察到HBc-VLPs形成粒徑約為30 nm的球形微粒，其形態(tài)與天然的HBV微粒相似。以流感病毒M2e抗原肽為模式抗原，通過Sulfo-SMCC氨基-巰基雙功能交聯(lián)劑，將M2e定點連接于HBc-VLPs通過突變引入的Cys殘基處，制備了M2e-HBc-VLPs模式疫苗，通過細胞熒光示蹤，驗證了HBc-VLPs結構的完整性與M2e的正確交聯(lián)。動物免疫實驗表明該疫苗能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生抗原特異性的IgG抗體，驗證了疫苗載體HBc-VLPs的有效性。研究結果為HBc-VLPs作為疫苗載體的研究奠定了基礎，能夠促進HBc-VLPs載體疫苗的研發(fā)以及HBc-VLPs在其他領域的應用。

病毒樣顆粒，乙型肝炎病毒核心蛋白，定點偶聯(lián)，疫苗載體

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs) 是一種高度結構化的多聚體納米微粒，與天然的病毒形態(tài)相似，由病毒的結構蛋白自組裝形成，但是不含病毒的遺傳物質[1-2]。因此，VLPs是非復制性和非傳染性的。VLPs具有很強的免疫原性以及生物學活性，易于被免疫系統(tǒng)識別，誘導機體固有和適應性免疫應答[3-4]。多數(shù)VLPs的直徑在20–100 nm之間，可自由進入淋巴管，被動引流至淋巴結的包膜下區(qū)域，并由專職抗原呈遞細胞攝取[5]。VLPs同多數(shù)抗原一樣是通過主要組織相容性復合體MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子加工和呈遞抗原，通過VLPs與補體成分或IgM抗體之間的特定相互作用，促進VLPs向B細胞濾泡的轉運。VLPs表面的剛性結構以及多價、高度重復的抗原表位可廣泛交聯(lián)B細胞受體，引發(fā)對B細胞的強烈刺激，誘導強烈而持久的抗體反應[6]。

VLPs的這些特性使其可作為非常有效的疫苗載體，研究發(fā)現(xiàn)VLPs的結構允許外源基因或基因片段插入形成嵌合型VLPs，然后將外源性抗原展示在表面[7]。除此之外，多數(shù)VLPs顆粒還具有包裹核酸(DNA、RNA) 以及其他小分子的能力[8]。VLPs能夠誘導機體產(chǎn)生高而持久的抗體反應，增強抗原穩(wěn)定性，保護抗原免于降解，其較高的安全性，適用于特殊人群，如嬰兒、老年人以及免疫功能低下的患者[9]。目前，已經(jīng)上市的VLPs疫苗有乙型肝炎病毒VLPs疫苗(Recombivax HB，Merck；Engerix-B，GSK；Elovac B，HBI)[1]、人乳頭狀瘤病毒VLPs疫苗(Gardasil?，Merck；Cervarix?，GSK)[10]、流感病毒VLPs疫苗(Inflexal V，Berna)[11]、甲型肝炎病毒VLPs疫苗(Epaxal，Berna)[12]。一些其他疾病的VLPs疫苗也已經(jīng)處于臨床實驗階段[13-15]。此外，作為抗腫瘤藥物的主動靶向載體，VLPs也展現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢與應用前景[16]。

乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc) 能夠形成二十面體對稱結構的病毒樣微粒，構象上近似于天然的乙肝病毒微 粒[17]。HBc所形成的衣殼在大腸桿菌、酵母、昆蟲及植物表達系統(tǒng)中均能得到正確的表達[18]。大腸桿菌所表達HBc蛋白主要可以形成2種類型的顆粒，分別是由180個單體形成直徑30 nm的T=3型顆粒和由240個單體形成直徑34 nm的T=4型顆粒[19]。其N末端、C末端和免疫顯性表位區(qū)域允許一定程度外源序列的插入，N末端插入外源序列能夠將外源序列重復且高密度地暴露在顆粒的表面，快速誘導機體產(chǎn)生針對外源性抗原的特異性體液免疫及細胞免疫應答[20]，因此，HBc-VLPs是一種安全、有效的疫苗載體。這種納米級的載藥平臺，為新型的疫苗研發(fā)提供了新的思路，在生物醫(yī)學研究、疫苗開發(fā)、藥物載體開發(fā)和基因治療中擁有廣闊的應用前景。

本研究通過基因工程技術，定向改造HBc基因，在HBc-VLPs的主要免疫顯性區(qū)域引入一個定點交聯(lián)位點，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，制備HBc(A80C) 單體蛋白，體外在適宜的緩沖體系中自組裝形成HBc-VLPs，并對其進行表征與活性測定，通過模式抗原的定點交聯(lián)以及動物免疫實驗，驗證了該疫苗載體的有效性。本研究提供了一種將抗原與HBc-VLPs定點連接的新思路，并開發(fā)了一套高效的HBc-VLPs制備方法，可大量、低成本地制備具有定點偶聯(lián)功能的HBc-VLPs，為HBc-VLPs作為疫苗載體的研究與應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達載體pET28a(+) 購于Novagen公司。工程菌株大腸桿菌DH5α和BL21(DE3) 購于Invitrogen公司。人肺腺癌細胞A549和人結直腸腺癌細胞HCT-116購于中國科學院細胞庫。流感病毒基質蛋白胞外功能區(qū)(Ectodomain of matrix protein 2，M2e) 模式抗原肽(N端-SLLTEVETPIRNEWGKRSNDSSD-C端)，由合肥國肽生物科技有限公司合成，其中賴氨酸(K) 用異硫氰酸熒光素(FITC) 標記側鏈。實驗動物BALB/c小白鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司?？敲顾?Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、4-(N-馬來酰亞胺甲基) 環(huán)己烷-1-羧酸3-磺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC) 購于Sigma-Aldrich公司。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青鏈霉素混合液購于Thermo Fisher Scientific公司，Anti-HBcAg抗體購于生工生物工程 (上海) 股份有限公司，其他分析純化學試劑購于上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 重組質粒的構建

重組質粒pET28a-由實驗室構建，構建示意圖如圖1A所示。基因原始序列參照NCBI GenBank (登錄號HE981189.1)，由蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列的合成。根據(jù)基因序列設計一對特異性引物與一對突變引物 (表1)，利用重疊延伸PCR技術，將分別以F-Rm、Fm-R為兩組引物，擴增兩個突變片段，再以F-R擴增完整的序列。通過連續(xù)的3次PCR，將序列中238–240位的GCA突變?yōu)門GT (圖1B)。反應體系(50 μL)：DNA聚合酶 0.25 μL、10×緩沖液5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL、上、下游引物各1 μL、質粒模板1 μL、ddH2O 37.75 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的片段。

圖1 pET28a(+)-hbc重組質粒的構建

表1 引物序列與特征

Note: the underlined sequences are restriction enzyme cutting sites and the yellow-shaded sequences are mutated sites.

目的DNA片段與載體pET-28a(+) 質粒分別經(jīng)限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ雙酶切回收后，使用連接試劑盒進行酶切產(chǎn)物的連接，16 ℃連接8 h。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α，從平板上挑取經(jīng)Kan抗性篩選的單克隆菌落培養(yǎng)，通過菌液PCR初步確定陽性克隆后，由華大基因(中國，上海) 完成商業(yè)化的測序工作。測序結束后，通過序列比對分析測序結果，挑選出構建正確的重組菌株提取質粒。

1.3 HBc(A80C) 蛋白的表達與純化

將重組質粒轉入BL21(DE3) 中，從抗性平板上挑取單克隆，接種到含LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取1 mL菌液加入到含100 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約2.5 h。菌液600達到約0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導劑，30 ℃誘導表達10 h。誘導結束后4 ℃、8 000 r/min離心15 min收集菌體，采用Phosphate Buffer(PB) 緩沖體系 (pH 7.4) 進行純化，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳與Western blotting分析蛋白的表達與純化的結果。

1.4 HBc-VLPs的組裝與凝膠純化

將純化后的HBc(A80C) 蛋白溶液加到處理過的透析袋內，將透析袋放入組裝緩沖液中(PB緩沖液，pH 7.4，不含尿素)，4 ℃處理12 h，緩慢除去蛋白溶液中的尿素，蛋白自組裝，期間更換2–3次緩沖液。蛋白組裝結束后，4 ℃、10 000×離心20 min，收集上清液。在上清液中加入硫酸銨溶液，室溫放置30 min，10 000×離心15 min，收集沉淀，加入磷酸鹽緩沖液使微粒復溶。復溶后的樣品通過Sepharose層析柱進一步純化，最后將洗脫后的樣品超濾濃縮。

1.5 HBc-VLPs微粒的染色與電鏡表征

采用負染色法，將50 μL樣品滴于有支持膜的銅網(wǎng)正中間，待蛋白溶液自然風干后，滴加5%磷鎢酸染液于銅網(wǎng)上，靜置5 min后，將銅網(wǎng)上多余的磷鎢酸染液用濾紙吸干，樣品處于半干狀態(tài)時使用JEM-1400透射電鏡觀察、拍照。

1.6 HBc-VLPs微粒的粒徑分布

用超純水將HBc-VLPs稀釋到幾個不同的濃度(小于1 mg/mL)，超聲處理，將合適濃度的HBc-VLPs溶液800 μL置于潔凈的測量皿中進行粒徑測定，利用馬爾文激光粒度儀Zetasizer Nano ZS測量HBc-VLPs的粒徑分布情況。

1.7 抗原肽M2e與HBc-VLPs的定點交聯(lián)

將4 mg Sulfo-SMCC溶于2 mL ddH2O，配制成2 mg/mL的Sulfo-SMCC溶液。將Sulfo-SMCC溶液緩慢滴加到2 mg/mL的M2e溶液中，等比例混合，室溫反應1 h。4 ℃條件下PBS溶液透析 6 h，除去未交聯(lián)的Sulfo-SMCC。將交聯(lián)后的M2e抗原肽與1 mg/mL的HBc-VLPs溶液按照10∶1的比例混合，室溫反應4 h，透析除去未交聯(lián)的抗原肽(交聯(lián)過程如圖2所示)。

1.8 抗原肽M2e與HBc-VLPs交聯(lián)產(chǎn)物的熒光示蹤

將處于對數(shù)期生長的A549和HCT-116細胞用胰酶消化，待細胞能夠從瓶壁上脫落時，加入培養(yǎng)基終止消化。用一次性無菌吸管吹散細胞，制備單細胞懸液，用血球計數(shù)板統(tǒng)計細胞數(shù)量，取出部分細胞懸液，添加培養(yǎng)基將細胞稀釋為2×104/mL。將稀釋后的細胞懸液加入6孔板中，每孔添加1 mL，再加入1 mL細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加入含有M2e與HBc-VLPs交聯(lián)產(chǎn)物(50 μg/mL) 的培養(yǎng)液2 mL。作用細胞3 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2遍，在熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光分布情況。

1.9 模式疫苗M2e-HBc-VLPs的動物免疫

選取6–8 周齡的BALB/c雌性小鼠，隨機分配到籠內，每組6只。將M2e-HBc-VLPs、未交聯(lián)的M2e抗原肽分別對不同組內的小鼠進行皮下注射，根據(jù)實驗設計50 μg或100 μg/只，空白對照組注射相同體積的無抗原緩沖液作為陰性對照。初次免疫后，間隔2周免疫1次，共免疫3次。動物實驗依照3R原則，并給予相應的人道關懷。

圖2 通過Sulfo-SMCC介導的兩步法定點交聯(lián)抗原肽M2e與HBc-VLPs示意圖

1.10 免疫動物血清中抗原特異抗體的檢測

每孔加入100 μL稀釋到5 μg/mL的M2e抗原肽包被液，4 ℃包被過夜，次日，棄去包被液，洗滌。加入300 μL封閉液，37 ℃孵育2 h，棄去封閉液，洗滌。將稀釋后的血清樣品加入反應孔中，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，棄去樣品液，洗滌。加入1∶4 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，棄去二抗溶液，洗滌。加入100 μL OPD顯色液，37 ℃避光孵育20 min。加入100 μL終止液，隨后在酶標儀上檢測492 nm反應產(chǎn)物的吸光度。

2 結果與分析

2.1 pET-28a(+)-hbc重組質粒

以公司合成的包含基因完整序列的質粒為模板，用相應的引物進行點突變并擴增基因序列，重疊延伸PCR反應結束后擴增出兩條明亮、單一的條帶，電泳結果如圖3所示，在500 bp附近處出現(xiàn)單一、明亮的條帶，這與理論大小469 bp (含酶切位點與保護堿基) 相符，擴增序列正確。經(jīng)過酶切、連接、轉化等步驟后，菌液PCR驗證目標序列的載入，測序顯示載入序列與理論序列完全一致，序列中238–240位已從GCA突變?yōu)門GT，說明重組質粒pET-28a(+)-構建成功。

圖3 hbc片段擴增的電泳圖

在重組載體設計之初，我們就將表達HBc蛋白C末端150–183位氨基酸的基因序列除去，僅保留了1–149位氨基酸的基因序列。研究表明150–183位氨基酸對顆粒的形成和衣殼的大小與形態(tài)的維持是非必需的，除去HBc蛋白C末端含有病毒衣殼RNA/DNA結合位點的150–183殘基序列，能夠防止RNA/DNA與病毒衣殼結合[21]，且大多數(shù)149殘基衣殼肽鏈經(jīng)大腸桿菌表達都會組裝形成T=4型微粒[22]。這樣的設計保證了顆粒的均一性，并且T=4型微粒的結構與天然的HBV衣殼一致。在HBc肽鏈的1–149位氨基酸中含有3個半胱氯酸殘基，位置分別位于48、61、107位。48位Cys與61位Cys通常參與鏈間二硫鍵的形成，107位Cys被埋藏于核心顆粒的內部[23]，3個位點都不是抗原肽結合的最佳位置。而78–82位氨基酸位于病毒微粒表面突起的頂部，是HBc的主要免疫顯性區(qū)域[17]，是抗原肽交聯(lián)的最佳區(qū)域，因此，選取此區(qū)域引入半胱氨酸殘基。78位到82位的氨基酸分別為78天冬氨酸(Asp)、79脯氨酸(Pro)、80丙氨酸(Ala)、81絲氨酸(Ser)、82精氨酸(Arg)，通過分析5個氨基酸的理化性質，以及氨基酸改變后對蛋白結構的影響，將80位丙氨酸變?yōu)榘腚装彼釒淼慕Y構改變最小，是最佳的選擇(圖4)。

圖4 交聯(lián)位點氨基酸的分析

2.2 HBc(A80C) 蛋白表達、純化與鑒定

重組菌在30 ℃經(jīng)過IPTG誘導10 h后，SDS-PAGE結果顯示，在14.1 kDa與20.1 kDa之間出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，對應的分子量與預測的結果16.8 kDa (ExPasy, http://www. expasy.org/)相符，表明目標蛋白得到了高效表達(圖5A)。將重組菌裂解后，目標蛋白在菌體裂解液的上清液和沉淀中都能檢測到，但絕大部分存在于上清液中。由于HBc蛋白主要存在于上清液中，因此，我們選擇了可溶性蛋白的純化方法，使用不同咪唑濃度梯度的PB緩沖液對HBc蛋白進行純化。盡管獲得了含量較高的HBc(A80C) 蛋白，但洗脫液中仍含有其他雜蛋白，且流穿液中也存在著較高含量的HBc(A80C) 蛋白，調整洗脫液咪唑濃度亦不能改善這種情況(圖5B)。我們推測在純化過程中，HBc(A80C) 蛋白單體在PB緩沖液中進行了自組裝，His親和標簽被包裹在內部，難以結合到Ni親和填料上，因此，我們將6 mol/L的尿素加入到緩沖體系中進行蛋白純化，希望通過尿素對蛋白可逆的變性作用，使蛋白的聚合結構解開，純化標簽得以暴露。通過這樣的操作，獲得了較好的純化效果，目標蛋白得到了很好的保留，其他雜蛋白被有效地去除，電泳結果顯示HBc(A80C) 蛋白經(jīng)過純化后，條帶單一(圖5C)。Western blotting結果顯示，兩組平行樣品都出現(xiàn)了目標條帶，且條帶清晰，而空白無樣品對照組無特異性條帶(圖5D)。結果表明純化后的HBc(A80C) 單體蛋白能夠與Anti-HBcAg抗體發(fā)生特異性結合，進一步證明了純化后的蛋白是HBc(A80C) 目標蛋白，且純度較高。

2.3 HBc-VLPs的形貌

純化后，HBc(A80C) 蛋白單體在無尿素的緩沖液中能夠自組裝，形成HBc類病毒樣顆粒，通過Sepharose凝膠柱層析，可以除去未組裝的HBc(A80C) 單體或者未完全組裝的多聚體蛋白，獲取較高純度的HBc納米微粒。馬爾文激光粒度儀的測定數(shù)據(jù)顯示，HBc納米微粒的平均粒徑為29.8 nm，粒度分布均勻(圖6)，與HBc-VLPs粒徑的理論數(shù)值相符。

透射電子顯微鏡結果顯示，經(jīng)過凝膠層析進一步純化后的HBc-VLPs的直徑約為30 nm，呈現(xiàn)較為均一的球形(圖7)，這一結果也與粒度儀測定的數(shù)據(jù)相符。

圖5 HBc(A80C) 蛋白表達、純化的電泳分析

圖6 HBc-VLPs的粒徑及粒度分布

圖7 HBc-VLPs透射電子顯微鏡照片

2.4 M2e-HBc-VLPs的活細胞檢驗

為了驗證M2e抗原肽是否連接到HBc-VLPs上，采用細胞熒光示蹤的方法，使用交聯(lián)后的HBc微粒(40 μg/mL) 對A549和HCT-116兩種癌細胞進行了處理。由于在M2e與HBc-VLPs的雙向交聯(lián)反應后采取了透析的方式進行處理，僅截留HBc-VLPs大分子，只有定點連接到HBc-VLPs上的抗原肽才會保留下來。M2e抗原肽在合成之時，就對序列中的賴氨酸Lys進行了FITC標記，F(xiàn)ITC在520 nm激發(fā)光下能夠發(fā)出黃綠色熒光。經(jīng)過10 h的作用，在兩種細胞中都能清楚地觀察到綠色熒光(圖8)，熒光分布較為均勻。這一結果不但證明了M2e抗原肽交聯(lián)到了HBc-VLPs抗原表位的指定位點，成功制備了模式疫苗M2e-HBc-VLPs，而且驗證了HBc-VLPs結構的完整性，HBc-VLPs被細胞攝取，能夠進入細胞內部。天然的乙肝病毒微粒能夠通過細胞表面因子的相互作用進入細胞[24]，而納米級別的病毒微粒通?？梢酝ㄟ^細胞內吞作用被細胞攝取[25]，基于上述原因，HBc-VLPs能夠被細胞攝取。A549是肺泡基底上皮樣細胞，而HCT-116結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，將兩種細胞作為上皮細胞模型，研究其對HBc-VLPs的攝取具有一定的代表性。M2e-HBc-VLPs的制備在先前的研究中，往往采取融合表達的方式，雖然原核、真核表達體系都能夠獲得目標蛋白單體，但真核表達體系的成本較高，得率較低[26]，采用原核表達體系生產(chǎn)HBc融合蛋白仍是目前的主要選擇。融合表達能夠確保HBc-VLPs微粒的每一亞單元都包含目標抗原，但也受限于載入的抗原序列，過大或難以表達的氨基酸序列會降低單體蛋白的產(chǎn)率，也會影響病毒樣顆粒的形成[27]。相較于融合表達，定點偶聯(lián)的方法具有獨特的優(yōu)勢，不受限于偶聯(lián)序列因素的影響，能夠確保病毒樣微粒結構的完整。

圖8 細胞對M2e與HBc-VLPs交聯(lián)產(chǎn)物的攝取情況

2.5 免疫小鼠的IgG抗體應答

在3次免疫后，單獨的M2e抗原肽并沒有使小鼠體內的IgG抗體含量明顯增加，這是由于多肽類抗原分子量較小，免疫原性通常較弱，難以激發(fā)較強的免疫反應[28]。但是將M2e定點偶聯(lián)到HBc-VLPs上就有顯著的不同，在血清中，M2e-HBc-VLPs疫苗能夠有效的誘導機體產(chǎn)生抗M2e特異性的IgG抗體，抗原特異性IgG抗體變化較為明顯，差異顯著(<0.01)。在提高一倍免疫劑量后(100 μg)，血清中的特異性抗體含量進一步提高，差異顯著(<0.01)，結果如圖9所示。上述結果表明，模式抗原肽M2e通過Cys定點偶聯(lián)到HBc主要免疫顯性區(qū)域而制備成的M2e-HBc-VLPs疫苗能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生抗原特異性的IgG抗體，激活了小鼠的系統(tǒng)免疫。

3 結論

HBc-VLPs在形態(tài)、結構上與天然的病毒結構相似，具有很強的免疫原性以及生物學活性，是安全、有效的疫苗納米載體，具有重要的科學研究和臨床應用價值。本研究借鑒抗體與藥物的偶聯(lián)模式，設計了一種能夠實現(xiàn)與抗原定點偶聯(lián)的HBc-VLPs載體。利用基因工程技術，在HBc-VLPs的主要免疫顯性區(qū)域引入一個Cys定點交聯(lián)位點，通過Sulfo-SMCC這種氨基-巰基雙功能交聯(lián)劑，將含有NH2的抗原或藥物錨定于HBc-VLPs表面設計的Cys位點，實現(xiàn)抗原或藥物的定點連接，再利用HBc-VLPs將它們運輸?shù)郊毎麅取Ｏ噍^于融合表達，定點偶聯(lián)的HBc-VLPs載體具有獨特的優(yōu)勢：一方面不會因為因融合序列而影響病毒微粒自組裝時空間結構的形成，能夠確保HBc-VLPs結構的完整；另一方面能夠連接一些分子量較大的多肽和蛋白，以及一些含有難以表達氨基酸序列的多肽。通過物理性質的表征、細胞熒光示蹤以及動物免疫等方式，驗證了疫苗載體HBc-VLPs的有效性。該方法能夠應用于類似VLPs微粒的設計與制備，為基于HBc-VLPs作為疫苗載體的研究奠定了基礎，能夠促進基于HBc-VLPs載體疫苗的研發(fā)以及HBc-VLPs在其他領域的應用。

圖9 免疫后血清中抗M2e特異性IgG抗體的含量

[1] Chroboczek J, Szurgot I, Szolajska E. Virus-like particles as vaccine. Acta Biochim Pol, 2014, 61(3): 531–539.

[2] Buonaguro L, Tornesello ML, Buonaguro FM. Virus-like particles as particulate vaccines. Curr HIV Res, 2010, 8(4): 299–309.

[3] Rosenthal JA, Chen LX, Baker JL, et al. Pathogen-like particles: biomimetic vaccine carriers engineered at the nanoscale. Curr Opin Biotechnol, 2014, 28: 51–58.

[4] Jennings GT, Bachmann MF. The coming of age of virus-like particle vaccines. Biol Chem, 2008, 389(5): 521–536.

[5] Mohsen MO, Gomes AC, Cabral-Miranda G, et al. Delivering adjuvants and antigens in separate nanoparticles eliminates the need of physical linkage for effective vaccination. J Control Release, 2017, 251: 92–100.

[6] Rold?o A, Mellado MCM, Castilho LR, et al. Virus-like particles in vaccine development. Expert Rev Vaccines, 2010, 9(10): 1149–1176.

[7] Brune KD, Leneghan DB, Brian IJ, et al. Plug-and-display: decoration of virus-like particles via isopeptide bonds for modular immunization. Sci Rep, 2016, 6: 19234.

[8] Gomes AC, Mohsen M, Bachmann MF. Harnessing nanoparticles for immunomodulation and vaccines. Vaccines (Basel), 2017, 5(1): E6.

[9] Moser C, Amacker M, Kammer AR, et al. Influenza virosomes as a combined vaccine carrier and adjuvant system for prophylactic and therapeutic immunizations. Expert Rev Vacc, 2007, 6(5): 711–721.

[10] Liu FX, Ge SQ, Li L, et al. Virus-like particles: potential veterinary vaccine immunogens. Res Vet Sci, 2012, 93(2): 553–559.

[11] Herzog C, Hartmann K, Künzi V, et al. Eleven years of Inflexal?V-a virosomal adjuvanted influenza vaccine. Vaccine, 2009, 27(33): 4381–4387.

[12] Bovier PA. Epaxal?: a virosomal vaccine to prevent hepatitis A infection. Expert Rev Vacc, 2008, 7(8): 1141–1150.

[13] Atmar RL, Baehner F, Cramer JP, et al. Rapid responses to 2 virus-like particle norovirus vaccine candidate formulations in healthy adults: a randomized controlled trial. J Infect Dis, 2016, 214(6): 845–853.

[14] Lindesmith LC, Mallory ML, Jones TA, et al. Impact of pre-exposure history and host genetics on antibody avidity following norovirus vaccination. J Infect Dis, 2017, 215(6): 984–991.

[15] Goo L, Dowd KA, Lin TY, et al. A virus-like particle vaccine elicits broad neutralizing antibody responses in humans to all chikungunya virus genotypes. J Infect Dis, 2016, 214(10): 1487–1491.

[16] Ong HK, Tan WS, Ho KL. Virus like particles as a platform for cancer vaccine development. PeerJ, 2017, 5(S1): e4053.

[17] Venkatakrishnan B, Zlotnick A. The structural biology of Hepatitis B virus: form and function. Annu Rev Virol, 2016, 3: 429–451.

[18] Fuenmayor J, Gòdia F, Cervera L. Production of virus-like particles for vaccines. New Biotechnol, 2017, 39: 174–180.

[19] Zlotnick A, Palmer I, Kaufman JD, et al. Separation and crystallization of=3 and=4 icosahedral complexes of the hepatitis B virus core protein. Acta Crystallogr D Struct Biol, 1999, 55(3): 717–720.

[20] Mohsen MO, Zha LS, Cabral-Miranda G, et al. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Semin Immunol, 2017, 34: 123–132.

[21] Jegerlehner A, Tissot A, Lechner F, et al. A molecular assembly system that renders antigens of choice highly repetitive for induction of protective B cell responses. Vaccine, 2002, 20(25/26): 3104–3112.

[22] Zlotnick A, Cheng N, Conway JF, et al. Dimorphism of hepatitis B virus capsids is strongly influenced by the C-terminus of the capsid protein. Biochemistry, 1996, 35(23): 7412–7421.

[23] Nassal M, Rieger A, Steinau O. Topological analysis of the hepatitis B virus core particle by cysteine-cysteine cross-linking. J Mol Biol, 1992, 225(4): 1013–1025.

[24] Watashi K, Wakita T. Hepatitis B Virus and Hepatitis D virus entry, species specificity, and tissue tropism. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015, 5(8): a021378.

[25] Zhang SL, Gao HJ, Bao G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano, 2015, 9(9): 8655–8671.

[26] Liu R, Li ZK. Eukaryotic expression of M2e-HBC fusion protein. Shaanxi Med J, 2011, 40(9): 1127–1130 (in Chinese).劉蕊, 李志奎. M2e-HBC融合蛋白的真核表達. 陜西醫(yī)學雜志, 2011, 40(9): 1127–1130.

[27] Zhang XF, Hu FB, Ma XY, et al. Design, construction, characterization and preliminary activity research of universal influenza virus vaccine (Flu@ uV) delivered by Hepatitis B virus core protein (HBc-VLP). China Biotechnol, 2016, 36(2): 7–15 (in Chinese).張旭凡, 胡發(fā)彪, 馬興元, 等. 由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)遞載的流感通用疫苗Flu@ uV設計構建、表征及初步活性研究. 中國生物工程雜志, 2016, 36(2): 7–15.

[28] Skwarczynski M, Toth I. Peptide-based synthetic vaccines. Chem Sci, 2016, 7(2): 842–854.

Preparation and characterization of HBc virus like particles with site-directed coupling function

Di Liu1, Bo Li1, Cheng Bi2, Hongping Qiao1, and Xiaoying Wu1

1,,030619,,2,,2006,

Hepatitis B virus core protein can self-assemble into icosahedral symmetrical viral-like particles (VLPs), and display exogenous sequences repeatedly and densely on the surface. VLPs also have strong immunogenicity and biological activity. When the nanoparticles enter the body, they quickly induce specific humoral and cellular immune responses to exogenous antigens. In this study, we designed an HBc-VLPs that can be coupled with antigens at specific sites, and developed a set of efficient methods to prepare HBc-VLPs. Through site-specific mutation technology, the 80th amino acid of peptide was changed from Ala to Cys, a specific cross-linking site was inserted into the main immunodominant region of HBc-VLPs, and the prokaryotic expression vector pET28a(+)-was constructed. After expression and purification, high purity HBc(A80C) monomer protein was assembled into HBc-VLPs nanoparticles in Phosphate Buffer. The results of particle size analysis show that the average particle size of nanoparticles was 29.8 nm. Transmission electron microscopy (TEM) showed that HBc-VLPs formed spherical particles with a particle size of about 30 nm, and its morphology was similar to that of natural HBV particles. The influenza virus antigen M2e peptide as model antigen was connected to Cys residue of HBc-VLPs by Sulfo-SMCC, an amino sulfhydryl bifunctional cross-linking agent, and M2e-HBc-VLPs model vaccine was prepared. The integrity of HBc-VLPs structure and the correct cross-linking of M2e were verified by cell fluorescence tracing. Animal immune experiments showed that the vaccine can effectively stimulate the production of antigen-specific IgG antibody in mice, which verified the effectiveness of the vaccine carrier HBc-VLPs.This study lays a foundation for the research of HBc-VLPs as vaccine vector, and help to promote the development of HBc-VLPs vaccine and the application of HBc-VLPs in other fields.

virus-like particles, hepatitis B virus core protein, site directed coupling, vaccine vector

10.13345/j.cjb.190534

November28, 2019;

February 17, 2020

Supported by:Scientific and Technologial Innovation Programs of Higher Education Institutions in Shanxi Province (No.2019L0821), Key Program of the Shanxi Province Research and Development Program (No.201603D21109-1-2).

Di Liu. E-mail: diliu@tynu.edu.cn

Xiaoying Wu. E-mail: wuxy@tynu.edu.cn

山西省高等學校科技創(chuàng)新項目 (No. 2019L0821)，山西省重點研發(fā)計劃重點項目 (No. 201603D21109-1-2) 資助。

2020-03-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200310.1115.001.html

劉地, 李博, 畢成, 等. 具備定點偶聯(lián)功能的HBc-VLPs的制備與性質鑒定. 生物工程學報, 2020, 36(7): 1440–1449.

Liu D, Li B, Bi C, et al. Preparation and characterization of HBc virus like particles with site-directed coupling function. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1440–1449.

(本文責編 郝麗芳)