王偉，秦貽，王亞茹，鄒節(jié)節(jié)，陳靜，陳金武，張雁，耿明，徐忠東，戴敏，潘禮龍

·生物技術(shù)與方法·

L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠原代巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性對(duì)比

王偉1，秦貽1，王亞茹1，鄒節(jié)節(jié)1，陳靜1，陳金武1，張雁1，耿明1，徐忠東1，戴敏2，潘禮龍3

1合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601 2安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012 3江南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

本研究旨在對(duì)比分析小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDM) 和腹腔巨噬細(xì)胞(PM) 原代培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性差異，為合理選擇原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)方法提供參考依據(jù)。原代培養(yǎng)小鼠BMDM和PM，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，倒置顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖，中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞吞噬功能，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析巨噬細(xì)胞表型變化。結(jié)果顯示，BMDM原代培養(yǎng)獲取的細(xì)胞數(shù)量顯著高于PM (<0.01)，PM貼壁及伸展時(shí)間早于BMDM。BMDM中F4/80+CD11b+百分比(98.30%±0.53%) 高于PM (94.83%±1.42%)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)。在L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中，BMDM增殖能力顯著高于PM (<0.001)。吞噬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下BMDM吞噬能力顯著高于PM (<0.01)，經(jīng)LPS刺激24 h后，除低劑量LPS (0.1 μg/mL) 外，BMDM吞噬能力均顯著高于PM (<0.01或<0.001)，提示BMDM吞噬能力在基礎(chǔ)和激活狀態(tài)下均強(qiáng)于PM。巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下在BMDM中表達(dá)顯著高于PM (<0.001)，和在BMDM中表達(dá)顯著低于PM (<0.001)，這一差異在極化誘導(dǎo)劑(LPS+IFN-γ或IL-4) 處理后依然存在。上述結(jié)果表明，原代培養(yǎng)BMDM較PM可獲取更多細(xì)胞，且兩種細(xì)胞在吞噬功能和極化狀態(tài)上存在一定生物學(xué)差異，應(yīng)謹(jǐn)慎合理選擇巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

巨噬細(xì)胞，原代培養(yǎng)，增殖，吞噬功能，極化

巨噬細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫中都起著至關(guān)重要的作用[1]。巨噬細(xì)胞在機(jī)體的各種組織中均有分布，其在發(fā)育早期階段就能通過(guò)執(zhí)行特定免疫反應(yīng)對(duì)抗不同類型病原微生物感染，因此是宿主防御系統(tǒng)必不可少的部分。巨噬細(xì)胞具有顯著的異質(zhì)性和可塑性，在維持組織穩(wěn)態(tài)、重塑組織、清除細(xì)胞碎片、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要生理作用[2]。目前已證實(shí)，巨噬細(xì)胞參與多種炎癥性疾病病理過(guò)程，包括動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、纖維化和癌癥 等[3-8]。鑒于巨噬細(xì)胞在生理及病理過(guò)程中的重要作用，基于靶向巨噬細(xì)胞功能研究日益增多，而巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)在其中扮演不可或缺的角色。

體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞主要來(lái)自于永生化細(xì)胞系和原代細(xì)胞，常用的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系包括人單核細(xì)胞株(THP-1) 和小鼠巨噬細(xì)胞株(RAW 264.7) 等，前者需要在佛波酯(PMA) 誘導(dǎo)下分化為巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究[9]。相對(duì)于經(jīng)過(guò)基因修飾永生化的細(xì)胞系，原代細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)和特點(diǎn)上更接近于真實(shí)的生理及病理環(huán)境。目前，原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)多來(lái)源于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PM) 和骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDM)，然而上述兩種原代細(xì)胞培養(yǎng)難度、培養(yǎng)時(shí)間以及生物學(xué)功能是否存在差異目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比分析兩種不同來(lái)源的小鼠巨噬細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞純度、吞噬和極化功能上的差異，為巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的選擇提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

雄性C57BL/6小鼠(體重(22±3) g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK (京) 2012-0001。L929細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基(高糖型)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，經(jīng)56 ℃30 min熱滅活) 購(gòu)自以色列BI公司；胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液、中性紅試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌脂多糖(LPS，大腸桿菌055:B5) 和巰基乙酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；IFN-γ、IL-4購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；大鼠抗小鼠CD11b抗體(FITC)、大鼠抗小鼠CD11b同型對(duì)照抗體(大鼠IgG2b，kappa單克隆抗體-FITC) 購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；大鼠抗小鼠F4/80抗體(APC)、大鼠抗小鼠F4/80同型對(duì)照抗體(大鼠IgG2a，kappa單克隆抗體-APC) 購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；Trizol、RNA酶抑制劑和SBYR Green購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega；引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，#3111)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Inno-Alliance Biotech公司，#IC 1000)；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司，#SpectraMax M2)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，#IX71)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，#C6)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司，# Allegra X-30R)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司，#Stepone)。

1.2 方法

1.2.1 L929細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇L929細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液1次，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化傳代，傳代過(guò)程中離心(1 000 r/min 5 min) 收集細(xì)胞上清液(L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基)，0.22 μm濾膜過(guò)濾后放置?80 ℃冰箱保存。

1.2.2 小鼠PM原代培養(yǎng)

小鼠腹腔注射4.0%巰基乙酸鈉3.0 mL，刺激72 h后頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡3 min，超凈臺(tái)內(nèi)剪開皮膚后充分暴露腹膜，腹腔注射4 ℃預(yù)冷RPMI-1640培養(yǎng)基4.0 mL，輕揉小鼠腹部2 min，用注射器回抽腹腔灌洗液，收集于 15 mL離心管中，重復(fù)抽吸過(guò)程2–3次。上述操作均需避免刺破腹腔臟器及血管。將獲得的細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min 5 min) 后棄上清。用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2) 培養(yǎng)2 h后，更換培養(yǎng)液去除未貼壁細(xì)胞以純化巨噬細(xì)胞[10]，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)未貼壁懸浮細(xì)胞。PM細(xì)胞數(shù)=總細(xì)胞數(shù)?未貼壁懸浮細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 小鼠BMDM原代培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死小鼠后放入75%的酒精中完全浸沒(méi)3–5 min，分離雙側(cè)股骨和脛骨，仔細(xì)去除骨骼外肌組織及結(jié)締組織，完全暴露出骨質(zhì)，放于75%酒精內(nèi)浸泡5 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，眼科剪沿骨垢線剪斷長(zhǎng)骨兩端，用DMEM培養(yǎng)液(10% FBS+15% L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基) 沖洗骨髓腔內(nèi)細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過(guò)濾沖洗液以去除細(xì)胞團(tuán)塊和骨骼碎片，濾液離心(1 000 r/min 5 min) 后棄上清，用紅細(xì)胞裂解液(1.0 mL) 重懸細(xì)胞，室溫裂解2 min后加入10 mL DMEM培養(yǎng)液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾以去除裂解的紅細(xì)胞，濾液離心(1 000 r/min 5 min) 后用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 巨噬細(xì)胞純度測(cè)定

原代細(xì)胞以相同密度(5×105個(gè)/mL) 接種6孔板，毎孔加入2.0 mL細(xì)胞懸液。原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。培養(yǎng)7 d后，吸出各孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗后胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心棄上清液后每管加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，分別加入CD11b抗體、CD11b同型對(duì)照抗體、F4/80抗體和F4/80同型對(duì)照抗體，室溫下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)(FL1-H和FL4-H通道)。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)

胰蛋白酶消化收集原代培養(yǎng)7 d后巨噬細(xì)胞，以相同密度(1×104個(gè)/mL) 接種于96孔板，毎孔200 μL細(xì)胞懸液。兩種來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液均為DMEM培養(yǎng)液(10% FBS+15% L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基)。鋪板后第1、3、5和7天分別使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性及增殖情況。毎孔內(nèi)加入20 μL的CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，全波長(zhǎng)多功能檢測(cè)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的值。

1.2.6 巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)

原代細(xì)胞以相同密度(1×104個(gè)/mL) 接種于96孔板。培養(yǎng)7 d后，采用不同濃度LPS (0.1、1、10 μg/mL) 作用細(xì)胞24 h，每孔加入20 μL中性紅染色液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，吸出含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，各孔加入200 μL中性紅檢測(cè)裂解液，室溫?fù)u床上裂解10 min，全波長(zhǎng)多功能檢測(cè)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下的值。

1.2.7 巨噬細(xì)胞極化功能檢測(cè)

原代細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，采用LPS (100 ng/mL)+ IFN-γ (20 ng/mL) 作為巨噬細(xì)胞M1型誘導(dǎo)劑，采用IL-4 (20 ng/mL) 作為巨噬細(xì)胞M2型誘導(dǎo)劑，分別刺激兩種來(lái)源巨噬細(xì)胞24 h，刺激結(jié)束后毎孔加入1 mL Trizol提取總RNA，統(tǒng)一RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為DEPC水(10.125 μL)、5×Buffer (5 μL)、dNTPs (1.25 μL)、RNA酶抑制劑(0.625 μL) 和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(1 μL)，反應(yīng)結(jié)束后，取出cDNA樣品，加入75 μL DEPC水，吹打混勻后備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR) 反應(yīng)體系為2 μL模板cDNA、7 μL DEPC水、10 μL SBYR Green Master Mix、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞數(shù)量分析

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，從單只小鼠腹腔中獲取的巨噬細(xì)胞數(shù)為 (18.33±3.63)×104個(gè)/mL，而經(jīng)骨髓腔沖洗獲得的細(xì)胞數(shù)為 (416.70±72.65)×104個(gè)/mL。經(jīng)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)(雙尾)，=0.009 8，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明從骨髓中獲取的細(xì)胞數(shù)顯著高于腹腔(圖1)。

圖1 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞數(shù)量

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PM貼壁速度快，細(xì)胞在懸浮狀態(tài)時(shí)或者剛開始貼壁時(shí)呈圓形，原代培養(yǎng)1 d后呈現(xiàn)出具有突起的不規(guī)則形態(tài)。骨髓源細(xì)胞貼壁速度較PM慢，原代培養(yǎng)3 d后部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，原代培養(yǎng)7 d后，多數(shù)細(xì)胞開始伸展呈細(xì)長(zhǎng)梭形，有鈍圓形的突起，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出星形，有偽足和突起，呈現(xiàn)出典型的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)(圖2)。

2.3 巨噬細(xì)胞純度鑒定

原代培養(yǎng)7 d后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PM中F4/80+CD11b+細(xì)胞比例為94.83%±1.42%，BMDM中F4/80+CD11b+細(xì)胞比例為98.30%±0.53%，經(jīng)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)(雙尾)，=0.083 7，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩種原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)均可獲得高純度的巨噬細(xì)胞(圖3)。

圖2 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖3 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞純度

2.4 巨噬細(xì)胞增殖情況

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，兩種來(lái)源的巨噬細(xì) 胞生長(zhǎng)曲線具有相似特征，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期均出現(xiàn)在5–7 d。培養(yǎng)7 d后，BMDM數(shù)量顯著高于PM (<0.001)，說(shuō)明在L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中，BMDM體外增殖能力顯著高于PM (圖4)。

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)

中性紅檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下PM吞噬能力顯著低于BMDM (<0.01)，經(jīng)LPS刺激24 h后，除低劑量LPS (0.1 μg/mL) 外，PM吞噬能力均顯著低于BMDM (<0.01或<0.001)，說(shuō)明不同來(lái)源巨噬細(xì)胞吞噬能力上存在差異，BMDM吞噬功能在基礎(chǔ)和細(xì)菌內(nèi)毒素LPS刺激狀態(tài)下均強(qiáng)于PM (圖5)。

2.6 巨噬細(xì)胞極化功能檢測(cè)

qPCR結(jié)果顯示，基礎(chǔ)狀態(tài)下巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志基因腫瘤壞死因子-α () 在PM中表達(dá)顯著低于BMDM (<0.001)，M2型標(biāo)志基因精氨酸酶-1 () 和類幾丁質(zhì)酶3樣分子1 () 在PM中表達(dá)顯著高于BMDM (<0.001)，說(shuō)明基礎(chǔ)狀態(tài)下，不同來(lái)源巨噬細(xì)胞M1/M2型標(biāo)志基因表達(dá)存在差異(圖6A)。

與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)LPS和IFN-γ的共同誘導(dǎo)后，M1型標(biāo)志基因一氧化氮合成酶2 ()和在PM和BMDM中表達(dá)均顯著升高(<0.001)。與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后，M2型標(biāo)志基因(和) 在PM和BMDM中表達(dá)均顯著升高(<0.001)，說(shuō)明兩種不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞極化功能均可滿足極化實(shí)驗(yàn)要求(圖6B和C)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)LPS和IFN-γ的共同誘導(dǎo)后，在PM中表達(dá)顯著低于BMDM (<0.001) (圖6D)。細(xì)胞經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后，M2型標(biāo)志基因(和) 在PM中表達(dá)顯著高于BMDM (<0.001) (圖6E)，說(shuō)明PM向M2型極化能力可能高于BMDM，而在M1型極化能力上BMDM更占優(yōu)勢(shì)。

圖4 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞增殖能力

圖5 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞吞噬功能

圖6 對(duì)比分析不同來(lái)源巨噬細(xì)胞極化特征

3 討論

目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞并非終分化細(xì)胞且廣泛分布于多種組織中[11-12]，然而體外實(shí)驗(yàn)中獲取大量巨噬細(xì)胞仍十分困難。腹腔是小鼠原代巨噬細(xì)胞常見(jiàn)來(lái)源，腹腔中除了巨噬細(xì)胞外，還含有大量的淋巴細(xì)胞，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK) 細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞只占其中35%[13]。我們發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)巰基乙酸鈉腹腔刺激后，單只鼠可獲取PM數(shù)量為 (18.33±3.63)×104個(gè)/mL。與之前報(bào)道一致[14]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單只小鼠經(jīng)骨髓可獲取細(xì)胞數(shù)為 (416.70±72.65)×104個(gè)/mL，顯著高于腹腔(<0.01)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基體系中，不同來(lái)源巨噬細(xì)胞具有類似的生長(zhǎng)曲線，但BMDM增殖能力顯著高于PM。L929細(xì)胞上清液中含有其分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，而M-CSF可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖[15]。與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一致，在M-CSF誘導(dǎo)下，體外培養(yǎng)的BMDM增殖能力顯著高于PM[16]。在阿霉素誘導(dǎo)的小鼠腎病模型發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于脾臟源巨噬細(xì)胞，靜脈輸注的M2型BMDM在腎臟中顯示出更加顯著的增殖能力，但增加的M2型BMDM卻未表現(xiàn)出腎損傷保護(hù)作用[17]，提示巨噬細(xì)胞增殖能力可能與其功能和表型穩(wěn)定呈負(fù)相關(guān)。

巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性，能通過(guò)相關(guān)受體激活或所處微環(huán)境變化進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換[18-19]。巨噬細(xì)胞可極化為具有促炎作用的經(jīng)典激活表型(M1型巨噬細(xì)胞) 或具有抗炎、抗纖維化和傷口愈合作用的替代激活表型(M2型巨噬細(xì)胞)。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)Fc受體并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(MCP-1、IL-6、TNF、IL-12) 和一氧化氮。相反，M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)、、和等基因[20]。我們發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)7 d后，基礎(chǔ)狀態(tài)下M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因在PM中表達(dá)顯著低于BMDM，M2型標(biāo)志基因和在PM中表達(dá)顯著高于BMDM，說(shuō)明基礎(chǔ)狀態(tài)下，與PM相比，BMDM更偏向M1型狀態(tài)，原因可能是骨髓祖細(xì)胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞多為M1型[21]。M1型誘導(dǎo)劑(LPS和IFN-γ) 刺激后，M1型標(biāo)志基因在PM中表達(dá)依然顯著低于BMDM，而M2型誘導(dǎo)劑(IL-4) 誘導(dǎo)細(xì)胞后，M2型標(biāo)志基因(和) 在PM中表達(dá)顯著高于BMDM，提示基礎(chǔ)狀態(tài)下兩種不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞表型差異在特定表型誘導(dǎo)劑刺激后依然存在。

巨噬細(xì)胞表型對(duì)其吞噬功能有著直接的影響。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M1表型巨噬細(xì)胞(人或鼠源)吞噬能力均顯著強(qiáng)于M2表型[22-24]。原代培養(yǎng)7 d后，BMDM吞噬能力顯著高于PM。在經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS進(jìn)一步刺激后，上述差異依然存在，提示體外培養(yǎng)的BMDM在基礎(chǔ)狀態(tài)和激活狀態(tài)，其吞噬功能均強(qiáng)于PM。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步佐證了巨噬細(xì)胞極化功能檢測(cè)結(jié)果，BMDM表型偏向于M1極化狀態(tài)。然而，表型差異如何影響吞噬功能還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，盡管原代培養(yǎng)的腹腔源和骨髓源巨噬細(xì)胞在純度和誘導(dǎo)后極化狀態(tài)均可滿足實(shí)驗(yàn)要求，然而PM和BMDM無(wú)論在體外培養(yǎng)過(guò)程或生物學(xué)特性均存在一定差異。BMDM在可獲取數(shù)量上明顯多于PM，但其基礎(chǔ)狀態(tài)較PM卻呈現(xiàn)出M1表型特征及較強(qiáng)的吞噬能力，這一差異在特定誘導(dǎo)劑處理后依然存在。因此，在巨噬細(xì)胞相關(guān)病理或藥理研究過(guò)程中應(yīng)謹(jǐn)慎合理選擇巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，以避免原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

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Characteristic comparison of mouse primary macrophages cultured in L929 cell conditioned medium

Wei Wang1, Yi Qin1, Yaru Wang1, Jiejie Zou1, Jing Chen1, Jinwu Chen1, Yan Zhang1, Ming Geng1, Zhongdong Xu1, Min Dai2, and Lilong Pan3

1 School of Life Sciences, Hefei Normal University, Hefei 230601, Anhui, China 2 School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, Anhui, China 3 School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

The purpose of this study is to provide a culture for mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) and peritoneal macrophages (PM) and to characterize their molecular and cellular biology. The cell number and purity from the primary culture were assessed by cell counter and flow cytometry, respectively. Morphological features were evaluated by inverted microscope. Phagocytosis by macrophages was detected by the neutral red dye uptake assay. Phenotypic markers were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. Our results show that the cell number was much higher from culture of BMDM than PM, while there was no significant difference regarding the percentage of F4/80+CD11b+cells (98.30%±0.53% vs. 94.83%±1.42%;>0.05). The proliferation rate of BMDM was significantly higher than PMin the presence of L929 cell conditioned medium, by using CCK-8 assay. However, PM appeared to adhere to the flask wall and extend earlier than BMDM. The phagocytosis capability of un-stimulated BMDM was significantly higher than PM, as well as lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BMDM, except the BMDM stimulated by low dose LPS (0.1 μg/mL). Furthermore,expression was significantly higher in un-stimulated BMDM than PM, whileandmRNA expression were significantly lower than PM. The expression difference was persistent if stimulated by LPS+IFN-γ or IL-4. Our data indicate that bone marrow can get larger amounts of macrophages than peritoneal cavity. However, it should be aware that the molecular and cellular characteristics were different between these two culture systems.

macrophages, primary culture, proliferation, phagocytosis, polarization

10.13345/j.cjb.190517

November 19, 2019;

March 3, 2020

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81973322, 81573420, 81773937), Natural Science Foundation of Anhui Province, China (Nos. 2008085MH270, 1908085MH263), Key Projects of Anhui Province University Outstanding Youth Talent Support Program (Nos. gxyqZD2016235, gxgnfx2019025), National Training Program of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates (No. 201814098058).

Wei Wang. Tel: +86-551-63674150; E-mail: weiw@hfnu.edu.cn

Min Dai. Tel: +86-510-65121176; E-mail: daiminliao@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 81973322，81573420，81773937)，安徽省自然科學(xué)基金 (Nos. 2008085MH270，1908085MH263)，安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金 (Nos. gxyqZD2016235，gxgnfx2019025)，國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 201814098058) 資助。

2020-04-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200403.2241.002.html

王偉, 秦貽, 王亞茹, 等. L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠原代巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性對(duì)比. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(7): 1431–1439.

Wang W, Qin Y, Wang YR, et al. Characteristic comparison of mouse primary macrophages cultured in L929 cell conditioned medium. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1431–1439.

(本文責(zé)編 陳宏宇)