邊若菲，徐笑，劉玉芬，劉鵬，趙文閣

·動物及獸醫(yī)生物技術(shù)·

嗜水氣單胞菌脅迫下東北林蛙基因在不同組織的表達(dá)

邊若菲，徐笑，劉玉芬，劉鵬，趙文閣

哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025

本研究旨在探討嗜水氣單胞菌 (，Ah) 脅迫下基因在東北林蛙不同組織的表達(dá)特征，為揭示兩棲類抗感染免疫應(yīng)答機(jī)制提供依據(jù)。文中首先構(gòu)建嗜水氣單胞菌感染下的試驗(yàn)動物模型，通過蘇木精-伊紅染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 觀察病理學(xué)變化；利用RT-PCR克隆東北林蛙基因α1+α2肽結(jié)合區(qū)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測Ah脅迫下在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：在Ah感染后，皮膚、肝臟和肌肉等組織均出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失和紋理紊亂等現(xiàn)象；獲得基因α1+α2肽結(jié)合區(qū)片段494 bp，可編碼164個氨基酸，與兩棲類同源性在77%以上，與哺乳類同源性低至14.96%，表明基因α1+α2區(qū)在不同物種間保守性較低；熒光定量PCR結(jié)果顯示，在Ah脅迫下，實(shí)驗(yàn)組肝臟、脾臟、腎臟、皮膚和肌肉組織基因的轉(zhuǎn)錄水平在72 h前均高于對照組，但是各組織到達(dá)峰值的時間具有差異性 (<0.01)，表明Ah脅迫下基因在不同組織的表達(dá)時間存在差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究MHC分子在抗感染中的免疫功能提供了參考依據(jù)。

東北林蛙，嗜水氣單胞菌，基因，表達(dá)

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC) 是一組與免疫密切相關(guān)、緊密連鎖的基因群，其產(chǎn)物廣泛存在于脊椎動物中并在免疫應(yīng)答中扮演極為重要的角色[1-2]。研究表明[3-5]，MHC主要由3類分子組成，其中Ⅰ類和Ⅱ類分子廣泛參與免疫應(yīng)答的過程，已成為疾病抗性和易感性的候選標(biāo)記基因。MHCⅠ類分子主要識別內(nèi)源性抗原，并呈遞給CD8+ T細(xì)胞，從而完成經(jīng)典的內(nèi)源性抗原呈遞過程，但是在感染的過程中經(jīng)常出現(xiàn)抗原的交叉呈遞現(xiàn)象，即外源性抗原也可以通過MHCⅠ類分子呈遞[3]。近年來，MHCⅠ類分子在疾病發(fā)生中的作用研究主要集中于人和其他哺乳動物以及禽類，在兩棲類中的研究目前大部分局限于MHC分子的遺傳多樣性和進(jìn)化機(jī)制[6-11]。

東北林蛙隸屬蛙科 (Ranidae)、林蛙屬 ()，是一種對嚴(yán)寒氣候有較強(qiáng)適應(yīng)能力的無尾兩棲類，屬于東北地區(qū)優(yōu)勢兩棲物 種[12-13]。其雌蛙的輸卵管是我國傳統(tǒng)中藥材哈什蟆油的主要成分[14-15]。隨著生態(tài)環(huán)境不斷惡化，東北林蛙種群數(shù)量銳減，已被列為易危物種[16-18]。微生物侵襲被認(rèn)為是其減少的元兇之一，其中嗜水氣單胞菌是造成蛙群患敗血病的主要病原體[19-21]。本研究對東北林蛙基因的α1+α2肽結(jié)合區(qū)進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，通過人工感染嗜水氣單胞菌建立感染模型，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測基因在不同組織的轉(zhuǎn)錄情況，為基因的免疫功能研究提供參考，并為兩棲類傳染病的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物和菌株

東北林蛙，雄性，實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖；嗜水氣單胞菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.1.2 主要試劑

克隆載體pMD18-T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DL2000 Marker、ExDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程 (大連) 有限公司；dNTPs、瓊脂糖膠回收試劑盒購自哈爾濱伊事達(dá)生物工程有限公司；Trizol試劑盒購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；HiScript II Q RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper)，ChamQ SYBR qPCR Master Mix，均購于南京諾唯贊 (Vazyme) 生物科技有限公司；10%福爾馬林固定液、伊紅染液和其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng) (Smart Gel III；北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；低溫循環(huán)水浴箱 (HX-1050；北京博醫(yī)康技術(shù)公司)；Olympus BH-2型顯微鏡；組織切片機(jī) (820型；日本Nikon公司)；ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀；高速冷凍離心機(jī) (Allegra-64R；美國BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 東北林蛙的人工感染和樣品采集

將菌株活化后，依據(jù)參考文獻(xiàn)[22]，采用紫外分光光度計(jì)和平板菌落計(jì)數(shù)法測定菌液濃度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定攻毒濃度。將東北林蛙隨機(jī)分為兩組：即對照組 (LB組) 和試驗(yàn)組 (Ah組)，每組15只，試驗(yàn)組每只東北林蛙采用腹腔注射的方式注射 1 mL嗜水氣單胞菌液 (1.12×107CFU/mL)，對照組東北林蛙注射同樣體積的LB液體培養(yǎng)基，分別取6、12、24、48、72 h時兩組東北林蛙心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚和肌肉組織樣品，每個時間點(diǎn)取3只，用液氮速凍后于?80 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的中國林蛙類基因的序列 (GenBank登錄號：FJ385693.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，MHCⅠ-α1+α2擴(kuò)增片段跨度為494 bp左右，MHCⅠ-q擴(kuò)增片段跨度為227 bp左右；內(nèi)參引物β-actin依據(jù)參考文獻(xiàn)[19]設(shè)計(jì)，長度為176 bp左右，引物由哈爾濱博仕生物工程有限公司，合成引物序列如表1所示。

1.2.3 東北林蛙類α1+α2的克隆及生物信息學(xué)分析

依據(jù)Trizol試劑盒說明書，提取對照組和試驗(yàn)組5個時間點(diǎn)7種組織樣品的總RNA，采用1%的水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性并用分光光度計(jì)檢測確定濃度。再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，合成cDNA第一鏈，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)及qRT-PCR。以上述肌肉的cDNA第一鏈為模板，按照plus DNA聚合酶說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的配置，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后，與pMD18-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR檢測，獲得的疑似陽性菌株命名為pMD18-T-MHCⅠ-α1+α2，將該菌株送哈爾濱博仕生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。利用SWISS-MODEL (http://www.expasy.ch/swissmod/ SWISS-MODEL.html)、DNAMAN6.0、MEGA7和SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ sopma.pl) 等軟件對基因α1+α2肽結(jié)合區(qū)的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。選擇的參考物種信息如表2所示。

1.2.4 東北林蛙病理組織切片的制備

取感染后0、6、12、24、48、72 h東北林蛙的肝臟、皮膚和肌肉組織，用10%福爾馬林固定液進(jìn)行固定。采用石蠟包埋法進(jìn)行處理，以約5 μm厚度進(jìn)行切片。脫蠟復(fù)水即二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，1/2二甲苯5 min，無水乙醇3 min，95%乙醇Ⅰ 3 min，95%乙醇Ⅱ 3 min，90%乙醇 3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，雙蒸水Ⅰ5 min后蘇木精染色10 min，流水沖洗去余色，將切片放入1%的鹽酸乙醇中分化10 s，再放入1%的氨水中藍(lán)化10 s，清水清洗數(shù)分鐘，0.5%伊紅溶液染色3 min后進(jìn)行梯度脫水透明并用樹膠進(jìn)行封片。

表1 引物序列

表2 參考物種信息

1.2.5 東北林蛙類基因的熒光定量PCR分析

以β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參，采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法檢測基因在東北林蛙心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚和肌肉等7種組織中的轉(zhuǎn)錄情況。反應(yīng)體系如下 (20 μL)：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer1 (10 μmol/L) 0.4 μL，Primer 2 (10 μmol/L) 0.4 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，cDNA模板 1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。每個處理設(shè)置３次重復(fù)。相對表達(dá)量采用2–ΔΔCt法計(jì)算，利用SPSS25軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北林蛙MHCⅠ基因α1+α2區(qū)的克隆與鑒定

采用Trizol法提取東北林蛙肌肉RNA后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，有清晰的28S和18S的條帶，再利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，260/280值在1.8–2.0之間，可以進(jìn)行后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。以肌肉的cDNA為模板，擴(kuò)增MHCⅠ-α1+α2區(qū)，電泳檢測結(jié)果如圖1A所示，目的帶大小約為 500 bp左右，與預(yù)期相符，使用回收試劑盒進(jìn)行回收，結(jié)果如圖1B所示。將目的片段α1+α2和pMD18-T連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后，通過菌落PCR鑒定，電泳檢驗(yàn)結(jié)果如圖1C所示，可見PCR結(jié)果條帶單一，與預(yù)計(jì)大小相符。

圖1 東北林蛙MHCⅠ基因α1+α2區(qū)的克隆

2.2 東北林蛙MHCⅠ基因α1+α2區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果表明，獲得的東北林蛙MHCⅠ類α1+α2序列長為494 bp，與GenBank公布的中國林蛙MHCⅠ α1+α2核苷酸序列的同源性達(dá)94%；該核苷酸序列編碼164個氨基酸殘基 (圖2)。SOPMA軟件分析表明，基因α1+α2蛋白二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋占36.59% (60AA)，無規(guī)卷曲占28.66% (47AA)，延伸鏈占20.12% (33AA) 和β折疊占14.63% (24AA) 等幾種結(jié)構(gòu)形成。利用SWISS-MODEL軟件對三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬預(yù)測，其結(jié)構(gòu) (圖3A) 與模式生物非洲爪蟾的三級結(jié)構(gòu)類似 (圖3B)。通過與表2中13個物種進(jìn)行核苷酸序列比較，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域與兩棲類同源性在77%以上，其中與中國林蛙同源性最高，與哺乳類相比低至14.96%，禽類為24.44%。核苷酸(圖4A) 和氨基酸 (圖4B) 系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與兩棲類親緣關(guān)系最近，在一個分支內(nèi)，而與人、牛、豬和禽類等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 嗜水氣單胞菌脅迫下東北林蛙組織的病理鑒定

取感染后0、6、12、24、48、72 h的東北林蛙肝臟、皮膚和肌肉組織，進(jìn)行HE染色。結(jié)果表明，感染后肝臟組織病理學(xué)觀察所見 (圖5A1–A6)，隨著時間延長 (6–72 h) 細(xì)胞呈空泡樣變，細(xì)胞間隙增大，肝細(xì)胞核固縮，炎性細(xì)胞浸潤逐漸明顯。在皮膚組織中 (圖5B1–B6)，可見數(shù)量較多染色呈藍(lán)紫色的堿性細(xì)胞，呈淺粉色的膠原纖維和呈紫色的纖維細(xì)胞，此外可見有大量的黑色素細(xì)胞在表皮下與真皮層之間，隨著感染時間的延長，細(xì)胞間的界限不清，整體結(jié)構(gòu)變得松散。在肌肉組織中(圖5C1–C6)，隨著感染時間的逐漸延長，肌纖維紋理變得紊亂。在解剖過程中也發(fā)現(xiàn)隨著感染嗜水氣單胞菌的時間延長，東北林蛙頭部和背部出現(xiàn)潰爛，背部和腿部出現(xiàn)出血點(diǎn)，解剖過程也可見腹水、肝臟腫大出現(xiàn)充血、腿部肌肉有出血點(diǎn)等現(xiàn)象，表明人工感染成功。

圖2 東北林蛙MHCⅠ基因α1+α2區(qū)核苷酸和氨基酸序列

圖3 MHCⅠ α1+α2區(qū)的三級結(jié)構(gòu)模型

圖4 MHCⅠ α1+α2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖5 東北林蛙病理組織切片

2.4 東北林蛙MHCⅠ基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

在嗜水氣單胞菌脅迫下，東北林蛙心臟MHCⅠ mRNA的表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，為對照組的 4.7倍 (<0.01)，在12 h下調(diào)至略高于本底水平，在24–72 h表達(dá)量始終略低于本底水平 (圖6A)。東北林蛙肝臟MHCⅠ mRNA的表達(dá)量在各時間點(diǎn)均高于對照，在6 h到達(dá)峰值后表達(dá)有所下調(diào)，在24 h時為對照的1.8倍 (<0.05)，48–72 h又出現(xiàn)上調(diào)表達(dá) (圖6B)。東北林蛙脾臟MHCⅠ mRNA的表達(dá)量除6 h為對照組的4.9倍 (<0.01)，其余時間表達(dá)量均為對照組的2倍左右 (圖6C)。東北林蛙肺臟MHCⅠ mRNA的表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值為對照組的13倍后逐漸下降，在72 h時低于本底水平 (圖6D)。東北林蛙腎臟MHCⅠ mRNA的表達(dá)量呈上調(diào)表達(dá)，在24 h時達(dá)到峰值 (<0.01)，48–72 h表達(dá)量雖有下調(diào)，但仍高于本底水平(圖6E)。東北林蛙皮膚MHCⅠ mRNA的表達(dá)量始終維持高表達(dá)水平，在6 h達(dá)到峰值為對照組的11倍 (<0.01) (圖6F)。東北林蛙肌肉MHCⅠ mRNA的表達(dá)量在6 h時略低于本底水平，在12 h達(dá)到峰值 (<0.01)，為對照的3.3倍后逐漸下降，但始終高于本底水平 (圖6G)。東北林蛙在Ah脅迫下，試驗(yàn)組肝臟、脾臟、腎臟、皮膚和肌肉組織基因的轉(zhuǎn)錄水平在72 h前均高于對照組，但是這些組織到達(dá)峰值的時間具有差異性 (<0.01)，心臟基因的轉(zhuǎn)錄水平與其他組織相比差異較大 (<0.01)，6 h即達(dá)到高峰，隨后迅速下降。表明Ah脅迫下基因在不同組織的應(yīng)答時間和水平存在差異。

3 討論

作為最早開始陸生的脊椎動物，兩棲動物的生活環(huán)境使它們接觸病原體的機(jī)會更多[23]。在感染過程中，免疫系統(tǒng)如何發(fā)揮調(diào)控作用，對物種生存至關(guān)重要。作為脊椎動物免疫系統(tǒng)重要成分的主要組織相容性復(fù)合體，可以首先識別和呈遞抗原啟動免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗感染作用?；蚰壳耙呀?jīng)成為研究兩棲類適應(yīng)性進(jìn)化和物種保護(hù)的最佳候選基因之一[24-26]?；虻摩?+α2區(qū)為肽結(jié)合區(qū)，該區(qū)域可以識別不同的抗原肽，呈遞給T細(xì)胞完成細(xì)胞免疫應(yīng)答過程。以往研究顯示[27]，該區(qū)域具有一定的多態(tài)性。陶久臣等[28]曾對東北林蛙的基因多態(tài)性進(jìn)行分析，其研究表明東北林蛙類基因有豐富的多態(tài)性變化，在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了基因突變、正選擇等作用。本研究證明東北林蛙與中國林蛙親緣關(guān)系較相近，與哺乳動物和禽類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以劃分成兩個大的分支，這也表明類基因作為一種古老的基因，在物種進(jìn)化中經(jīng)歷了一系列分化，形成各自物種的特點(diǎn)[29]。

圖6 嗜水氣單胞菌脅迫下東北林蛙各組織MHCⅠ轉(zhuǎn)錄水平變化檢測

東北林蛙在感染嗜水氣單胞菌后，MHCⅠ的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了明顯的變化，且在不同組織中有顯著的差異，其中MHCⅠ分子在皮膚響應(yīng)更積極，推測這與東北林蛙的水中生活習(xí)性呈現(xiàn)相關(guān)性。在斜帶石斑魚研究[30]中，也發(fā)現(xiàn)類基因在皮膚中表達(dá)量最高，這表明皮膚或許是兩棲動物及水生動物受到脅迫后抗原呈遞的主要位點(diǎn)。李偉等[31]在研究嗜水氣單胞菌感染黃鱔時，對肝臟、脾臟和腎臟的MHCⅠ分子的表達(dá)量進(jìn)行了分析，變化趨勢與本試驗(yàn)一致。當(dāng)用嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴[32]和無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚[33]時，腎臟和脾臟中MHCⅠ分子也具有較高水平的表達(dá)。在牙鲆[34]和淡水鯉魚[35]類基因抵御病原體的研究中，微生物感染后腎的MHCⅠ分子的表達(dá)量變化趨勢均與本文一致，從而說明MHCⅠ分子在抵抗病原微生物的過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上，在東北林蛙感染嗜水氣單胞菌的過程中，不同組織中MHCⅠ分子的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)上升趨勢，從而推測基因在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是東北林蛙重要的免疫應(yīng)答基因，這為進(jìn)一步研究東北林蛙基因免疫功能及其作用機(jī)制提供了參考。

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Expression ofgenes in different tissues ofunder the stress of

Ruofei Bian, Xiao Xu, Yufen Liu, Peng Liu, and Wenge Zhao

,,150025,,

The aim of this study was to investigate the expression ofgene in different tissues ofunder the stress of(Ah), and to provide evidence for revealing the anti-infective immune response mechanism of amphibians. The experimental animal model ofinfection was first constructed, and the pathological changes were observed by HE staining. Thegene α1+α2 peptide binding region ofwas cloned by RT-PCR and analyzed by bioinformatics. Real-time PCR was used to detect the transcription level ofin different tissues under Ah stress. After Ah infection, the skin, liver and muscle tissues showed signs of cell structure disappearance and texture disorder. Thegene α1+α2 peptide binding region fragment was 494 bp, encoding 164 amino acids, and homology with amphibians. Above 77%, the homology with mammals was as low as 14.96%, indicating that the α1+α2 region ofgene was less conserved among different species. The results of real-time PCR show that the liver, spleen and kidney of the experimental group were under Ah stress. The transcript levels ofgene in skin and muscle tissues were higher than those in the control group at 72 h, but the time to peak of each tissue was different (<0.01), indicating that the response time ofgene in different tissues was different under Ah stress. This study provides a reference for further exploring the immune function of MHC molecules in anti-infection.

,,gene, expression

10.13345/j.cjb.190508

November 13, 2019;

March 11, 2020

Supported by:Harbin Science and Technology Innovation Talent Research Project (No. 2014FQXJ169).

Yufen Liu. Tel: +86-451-88060784；E-mail:liuyufen0825@126.com

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金 (No. 2014FQXJ169) 資助。

2020-03-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200325.0846.002.html

邊若菲, 徐笑, 劉玉芬, 等. 嗜水氣單胞菌脅迫下東北林蛙基因在不同組織的表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2020, 36(7): 1323–1333.

Bian RF, Xu X, Liu YF, et al. Expression ofgenes in different tissues ofunder the stress of. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1323–1333.

(本文責(zé)編 郝麗芳)