孫云川 何新穎 胡秀茹 梁 偉 畢建強(qiáng) 胡婷婷 黃如敬 賈大鵬 趙建勇

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院放化療科，河北 滄州 061001)

放射性腸炎是下腹、盆腔等惡性腫瘤放療后的主要并發(fā)癥，病變可累及直腸、大腸、小腸。研究表明，電離輻射導(dǎo)致腸組織內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(ROS)可調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，包括B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)等，從而誘導(dǎo)腸黏膜細(xì)胞凋亡，是放射性腸炎形成的重要機(jī)制[1-2]。此外，ROS可誘發(fā)促炎因子的表達(dá)和釋放，其中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)被認(rèn)為是核心因子，是黏膜炎產(chǎn)生的“開關(guān)”[3-4]。目前，西醫(yī)治療主要采用手術(shù)、營養(yǎng)支持及對癥處理，遠(yuǎn)期療效尚不滿意[5]。前期研究顯示，安腸組方可明顯改善放射性腸炎患者臨床癥狀[6-7]。本研究通過觀察安腸組方高、中、低劑量藥液對X線直線加速器誘導(dǎo)的急性放射性腸炎大鼠的一般情況、腸組織ROS水平、NF-κB、大腸黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2和Bax的影響，探討安腸組方改善急性放射性腸炎癥狀的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，由天津腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號：SYXK(津)2017-0005]。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，大鼠自由活動(dòng)，自由飲水，喂以普通鼠食。

1.2 藥物制備 安腸組方藥物組成：生地榆30 g，白頭翁15 g，黃連5 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，木香9 g，炒白芍12 g，甘草6 g。中藥飲片均由河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，參照文獻(xiàn)[8]制備分別含生藥3.285、6.569、13.138 g/mL的安腸組方藥液。

1.3 試劑及儀器 試劑：兔單克隆抗體Bcl-2(批號ab59348)、Bax(批號ab77566)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號ab8245)，購自英國Abcam公司；ROS、NF-κB酶聯(lián)免疫分析試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。儀器：Precise直線加速器(瑞典醫(yī)科達(dá)公司)；721可見光分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表公司)；Nikon-176074光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；5417D臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；TP1020自動(dòng)組織脫水處理機(jī)、RM2135石蠟切片機(jī)、HI1220烘片機(jī)、EG1160組織包埋機(jī)(德國Leica公司) 、DYY-7C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為正常對照組8只，模型對照組、安腸組方高劑量組、安腸組方中劑量組、安腸組方低劑量組各10只。

1.4.2 造模 全部大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，禁食12～14 h，除正常對照組外，其余均予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，以仰臥位固定至手術(shù)板上，以直線加速器給予全腹部X線照射(從劍突至恥骨聯(lián)合)，照射面積8.5 cm×7.5 cm，其余部位用5 cm厚鉛板遮擋，源皮距100 cm，總照射劑量為9 Gy，放射劑量率為300 cGy/min，照射時(shí)間約3 min。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：受照射大鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少，出現(xiàn)大便性狀改變(如黏液便、便血)等放射性損傷癥狀[9]。

1.4.3 給藥 照射后第2 d，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算法[10]確定每只大鼠灌胃的原藥劑量。各組灌胃容積均為10 mL/kg，安腸組方低、中、高劑量組分別予32.85、65.69、131.38 g/kg的安腸組方藥液灌胃，其中低劑量為臨床等效劑量；模型對照組、正常對照組均以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃30 d。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量變化 灌胃期間，每日觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食水情況、排便情況；各組大鼠每4 d稱取1次體質(zhì)量。

1.5.2 大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)變化 灌胃結(jié)束后禁水食1 d后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，剪取全結(jié)腸，解剖顯微鏡下觀察結(jié)腸大體形態(tài)，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冰0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后平展于過濾紙上，濾紙吸干水分，稱其濕質(zhì)量。將結(jié)腸組織分為2部分，第1部分，用0.9%氯化鈉注射液迅速?zèng)_凈后，經(jīng)10%的中性甲醛溶液[以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制]固定后，常規(guī)脫水、浸蠟、透明、包埋，4 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察其病理學(xué)變化。第2部分，將剩余的結(jié)腸組織再分為3部分裝入錫箔紙后，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)腸組織ROS、NF-κB含量 取部分腸組織，經(jīng)PBS清洗后，剪碎并稱取破碎結(jié)腸100 mg，加入液氮碾磨成粉末狀，置于玻璃勻漿管中，加入1 mL PBS混勻，玻璃勻漿器冰點(diǎn)勻漿。將勻漿液移入2 mL離心管中，-20 ℃過夜后，反復(fù)凍融2次使其充分裂解，4 ℃，5 000 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測ROS含量及NF-κB蛋白表達(dá)水平。

1.5.4 Western Blot法檢測大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)水平 按照BCA蛋白濃度試劑盒說明提取結(jié)腸組織總蛋白質(zhì)，每孔配制含30 μg總蛋白做SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后予5% BSA封閉液封閉2 h，依次孵育一抗、二抗，Bax、Bcl-2和GAPDH的一抗稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶4 000，二抗稀釋比例為1∶3 000，化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)曝光、顯色后用Quantity-one圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值，對以GADPH作內(nèi)參照對比得到的相對灰度進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠造模結(jié)果、一般情況及體質(zhì)量變化 模型對照組造模過程中因麻醉過量死亡1只，安腸組方中劑量組因灌胃不當(dāng)死亡1只。在X線照射后第2 d，各組大鼠開始出現(xiàn)不同程度腹瀉；第4～7 d，各組大鼠大部分表現(xiàn)為黏液便或稀爛便，飲食、活動(dòng)量減少，精神較差；第8～10 d，各組大鼠的飲食、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)逐漸恢復(fù)。各組大鼠體質(zhì)量比較見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

由表1可見，照射后第8 d模型對照組大鼠體質(zhì)量低于正常對照組(P<0.05)，安腸組方中劑量組大鼠體質(zhì)量高于模型對照組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)改變 光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，與正常對照組相比，模型對照組可見結(jié)腸黏膜下水腫，腺體萎縮或結(jié)構(gòu)消失，并可見黏膜下血管擴(kuò)張充血及炎癥細(xì)胞浸潤等。與模型對照組相比，安腸組方高、中、低劑量組隱窩、腺體結(jié)構(gòu)基本完整，僅可見黏膜組織輕微水腫或少量炎癥細(xì)胞浸潤。見封3，圖1。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織ROS含量比較 見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織ROS含量比較

由表2可見，與正常組對照比較，模型對照組大鼠腸組織ROS含量升高(P<0.05)；與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組大鼠腸組織ROS含量均降低(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠腸組織ROS兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 見圖2、表3。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

由表3可見，與正常對照組比較，模型對照組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax蛋白相對表達(dá)水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax蛋白相對表達(dá)水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平均升高(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

由表4可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型對照組比較，安腸組方高、中劑量組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

放射性腸炎是腹腔局部放療、盆腔放療的常見副作用之一，其臨床表現(xiàn)為腹瀉，里急后重，甚至便血，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至部分患者會(huì)因此中斷治療，極大地影響了放療的效果。放射性腸炎的主要發(fā)生機(jī)制是放射線與組織細(xì)胞內(nèi)水分子相互作用產(chǎn)生ROS。而ROS可以破壞DNA的螺旋結(jié)構(gòu),阻斷DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]，其中與放射性腸炎密切相關(guān)的凋亡基因有Bax、Bcl-2等。除了直接損傷細(xì)胞外，ROS還可以激活多種信號通路，其中NF-κB信號通路最為核心[12]。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步激活下游炎癥信號通路，釋放促炎因子、促血管生長因子、生長因子、免疫球蛋白等，進(jìn)一步放大炎性反應(yīng)[13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，放射線屬于“火熱毒邪”，熱毒蘊(yùn)結(jié)、腸道受損是放射性腸炎的主要病機(jī)。由于癌瘤內(nèi)伏，消耗人體之氣、血、陰、陽，臟腑功能失司，五臟不能藏精，六腑不能傳化，氣機(jī)阻滯，痰濕內(nèi)生，痹阻經(jīng)絡(luò)，氣虛血瘀，加之射線照射，外感熱毒，引動(dòng)內(nèi)生癌毒，邪熱入于血分，虛實(shí)夾雜，痰濕瘀毒阻于腸腑絡(luò)脈，故致本病，日久損及腎陰腎陽而纏綿難愈。病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，可兼夾濕熱下注、氣滯血瘀等，治療原則為祛濕解毒涼血，兼以健脾益氣[14]。本研究中安腸組方中生地榆清熱涼血止血，活血生肌，治便血療效頗佳；白頭翁清熱解毒，涼血消腫，二者共為君藥。白術(shù)、茯苓健脾除濕止瀉；黃連善除脾胃大腸濕熱；木香健脾理氣消滯，共為臣藥。炒白芍緩急止痛，兼有養(yǎng)血之功；仙鶴草收斂澀血，共為佐藥。甘草緩急和中，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、健脾除濕、活血化瘀、收斂止血、消腫生肌之功效。

本實(shí)驗(yàn)中我們建立放射性腸炎大鼠模型，進(jìn)一步研究安腸組方防治放射性腸炎的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，X線照射后第8 d，安腸組方中劑量組大鼠體質(zhì)量明顯高于模型對照組(P<0.05)?？梢姡材c組方可有效改善放射性腸炎模型大鼠相關(guān)癥狀。

有研究認(rèn)為，氧自由基與腸道組織局部炎性反應(yīng)密切相關(guān)[15]。高能X射線的照射下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，ROS產(chǎn)生增多，氧化作用增強(qiáng)，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，腸黏膜的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成炎癥、穿孔等應(yīng)激性損傷[1-2]。本研究結(jié)果表明，與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組腸組織ROS含量明顯降低(P<0.05)，且隨著安腸組方劑量的增加，大鼠腸組織ROS含量降低更明顯，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明安腸組方能改善放射性腸炎模型大鼠腸組織氧化損傷。

在正常情況下，NF-κB并不表達(dá)，但電離輻射產(chǎn)生的ROS可激活NF-κB信號通路，使其表達(dá)增強(qiáng)，促使大量炎性介質(zhì)釋放，引起黏膜炎[3-4]。前期臨床研究已證實(shí)，安腸組方可有效調(diào)節(jié)放射性腸炎患者血清中相關(guān)炎癥因子水平[7]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)安腸組方干預(yù)后，NF-κB蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，與前期研究相一致。因此，推測安腸組方可通過降低大鼠結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)水平，從而減少血清促炎因子的釋放，最終達(dá)到減輕炎性反應(yīng)的目的。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受到放射線照射后的主要死亡方式。放射線會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起腸道屏障的破壞，導(dǎo)致放射性腸炎，其中與放射性腸炎密切相關(guān)的凋亡基因主要有Bax、Bcl-2[16]。本研究結(jié)果表明，安腸組方可下調(diào)促凋亡基因Bax蛋白、上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且隨著安腸組方用藥劑量的增加，Bax蛋白表達(dá)呈遞減趨勢，Bcl-2蛋白表達(dá)呈遞增趨勢，呈現(xiàn)了一定的量效關(guān)系，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明安腸組方可抑制結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞間緊密完整性，穩(wěn)定腸黏膜機(jī)械屏障。

綜上所述，我們推測安腸組方治療放射性腸炎的機(jī)制可能為通過抑制腸黏膜炎前體物質(zhì)ROS的產(chǎn)生，一方面抑制促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞間緊密完整性，穩(wěn)定腸黏膜機(jī)械屏障；另一方面抑制核因子NF-κB表達(dá)，減輕炎癥，從而減輕腸道的輻射毒性。