劉鑫，李民，高興春#

1西安醫(yī)學(xué)院，西安 710000

2陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，西安 710068

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是神經(jīng)外科最常見(jiàn)原發(fā)性顱腦腫瘤，好發(fā)于幕上大腦半球各處，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，在所有膠質(zhì)瘤中惡性程度最高，?？赏瑫r(shí)侵犯多個(gè)腦葉及深部結(jié)構(gòu)，臨床療效較差，預(yù)后不良，70%～80%患者的病程僅3～6個(gè)月，病程超過(guò)1年的患者不超過(guò)10%[1-2]。目前，僅發(fā)現(xiàn)遺傳因素、環(huán)境因素及腦部炎癥等因素可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展，且這些因素對(duì)幫助臨床診療意義不大，而基于分子水平的相關(guān)研究較少[3]。數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病率明顯升高，探討其發(fā)病機(jī)制，提高其早期診斷率及治療有效率尤為重要[4]。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物5（immunoglobulin-like transcript 5，ILT5）基因是ILT家族的重要成員之一，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，與機(jī)體免疫密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ILT4在非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌中均呈低表達(dá)，通過(guò)與其配體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)免疫絡(luò)氨酸抑制基序的負(fù)性調(diào)節(jié)，從而抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖與活化[6-7]。目前，關(guān)于ILT5與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究較少，具有一定研究?jī)r(jià)值。本研究探討ILT5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，分析其與患者臨床特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2015年11月在陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)檢查及術(shù)后病理診斷結(jié)果確診為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；②術(shù)前未接受任何其他治療，生存期＞3個(gè)月；③卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評(píng)分≥50分；④臨床資料及隨訪資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；②膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)；③合并其他惡性腫瘤；④失訪或因其他原因死亡。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入92例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，其中男50例，女42例；年齡：＞40歲60例，≤40歲32例；KPS評(píng)分為（72.47±4.35）分。同期選取行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者，排除合并腦部及其他部位良惡性腫瘤的患者，本研究共納入40例行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者，其中男24例，女16例；年齡：＞40歲26例，≤40歲14例；KPS評(píng)分為（73.39±4.86）分。兩組患者性別、年齡及KPS評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備 取膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的膠質(zhì)瘤組織和行正常腦組織切除減壓術(shù)的患者的正常腦組織，生理鹽水洗凈血跡及脂肪組織等，分為兩部分：一部分保存于RNA保存液中，-80℃冰箱保存；另一部分用石蠟包埋，室溫常規(guī)保存待檢。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)ILT5mRNA 的相對(duì)表達(dá)量將組織從-80℃冰箱取出解凍后棄保存液，緩沖液洗凈：研磨組織3 min，按比例加入Trizol液，充分均漿，離心棄沉淀，加氯仿震蕩混勻，室溫靜置10 min，離心留上清，按比例加異戊醇，離心留上清，再加入75%乙醇，真空干燥8 min，提取總RNA。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)制備cDNA，反應(yīng)體系：4 μl緩沖液、4 μl混合酶、2 μl引物、4 μl總RNA液和6 μl DEPC水；反應(yīng)條件：30 ℃ 8 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min；cDNA制備完成，于-20℃冰箱保存。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液20 μl，包括1 μl上下游引物、1 μl cDNA、0.5 μl Taq DNA 聚合酶、0.5 μl dNTP、5 μl PCR混合液和7.5 μl DEPC水；擴(kuò)增條件：95℃先2 min后15 s、60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct計(jì)算ILT5mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct=CtILT5-CtGAPDH。ILT5上游引物為5'-GGCTGAGTCTGGGCCCCAGGACCCGCAT-3'，下游引物為5'-ATGCTAGGTAACGTAGCTTACGGTTACC-3'；GAPDH上游引物為5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'，下游引物為5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè)ILT5蛋白的相對(duì)表達(dá)量石蠟標(biāo)本切片，0.5 mm左右，60℃烤片待檢。二甲苯聯(lián)合不同濃度乙醇進(jìn)行脫蠟，微波爐高溫修復(fù)，將組織置于3%的H2O2中3 min，緩沖液清洗3遍，從而阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。加入一抗（稀釋濃度為1∶300），4℃冰箱過(guò)夜，緩沖液清洗3遍；加入二抗（基本沒(méi)過(guò)組織即可），室溫避光孵育30 min，緩沖液清洗3遍。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色10 s左右（具體根據(jù)實(shí)驗(yàn)期情況而定）、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、封片。選擇視野清晰，染色良好的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)1000個(gè)。

結(jié)果判定[8]：ILT5蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，本研究用染色指數(shù)法進(jìn)行判定，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：未見(jiàn)計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為10%～49%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為50%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)顯色計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，黃色染色計(jì)2分，棕黃色染色3分；將陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘：＞4分為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)。

1.3 隨訪方法

所有膠質(zhì)瘤組患者均須隨訪，隨訪方式主要包括門(mén)診復(fù)診、電話及微信平臺(tái)等，隨訪截止2018年11月，共3年，中位隨訪時(shí)間為26個(gè)月。詳細(xì)記錄患者復(fù)發(fā)及生存狀況，計(jì)算總生存期（overall survival，OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Logrank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILT5mRNA相對(duì)表達(dá)量和ILT5蛋白表達(dá)情況的比較

膠質(zhì)瘤組織中ILT5mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。膠質(zhì)瘤組織ILT5蛋白表達(dá)率低于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中ILT5 mRNA相對(duì)表達(dá)量和ILT5蛋白表達(dá)情況的比較

2.2 不同臨床特征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

不同性別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑和腫瘤部位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（n=92）

2.3 不同臨床特征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、腫瘤部位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5蛋白表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤直徑膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5蛋白表達(dá)情況的比較（n=92）

2.4 ILT5蛋白與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系

ILT5蛋白低表達(dá)患者中位生存時(shí)間為20.1個(gè)月（95%CI：17.4～22.8個(gè)月），短于ILT5蛋白高表達(dá)患者的28.1個(gè)月（95%CI：25.3～31.0個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ILT5蛋白高表達(dá)患者3年生存率44.1%（15/34），高于ILT5蛋白低表達(dá)患者的22.4%（13/58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.767，P=0.003）。（圖 1）

圖1 ILT5蛋白高表達(dá)（n=34）與ILT5蛋白低表達(dá)（n=58）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存曲線

3 討論

ILT是近年發(fā)現(xiàn)的HLA-1受體家族，通過(guò)與相關(guān)配體結(jié)合可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)[9-10]。目前，研究較多的抑制性ILT主要包括ILT2、ILT3和ILT4，均含有免疫絡(luò)氨酸抑制基序和IgSF區(qū)，與免疫相關(guān)性疾病密切相關(guān)；近年發(fā)現(xiàn)其還可在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但具體作用機(jī)制尚不清楚[11-13]。ILT3和ILT4均在肺癌中異常表達(dá)，高愛(ài)琴[14]通過(guò)對(duì)57例非小細(xì)胞肺癌患者和A549/H1975/H460/A427四類(lèi)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，ILT3在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，可明顯降低TIL數(shù)量，但與患者性別、年齡、腫瘤類(lèi)型、分化程度及臨床分期等臨床特征無(wú)關(guān)。張義[15]則通過(guò)50例胃癌組織、癌旁正常組織和6株胃癌細(xì)胞株中ILT2、ILT3及ILT4表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILT2與胃癌相關(guān)性最強(qiáng)，有望成為胃癌診療的有效指標(biāo)，與淋巴細(xì)胞HLA-G分子陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)，上述研究提示，ILT在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，但近年缺少I(mǎi)LT與腫瘤相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中ILT5mRNA的相對(duì)表達(dá)量和ILT5蛋白的表達(dá)率均低于正常腦組織，表明ILT5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，可能作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。隨后，本研究分析ILT5與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同年齡、WHO分級(jí)及腫瘤直徑膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者ILT5mRNA的相對(duì)表達(dá)量和ILT5蛋白表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示年齡越小、組織學(xué)分級(jí)高（Ⅲ～Ⅳ級(jí)）、腫瘤直徑越大的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，ILT5mRNA的相對(duì)表達(dá)量越低。隨訪及Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖發(fā)現(xiàn)，ILT5蛋白低表達(dá)患者中位生存期較短，3年總生存率較低，可認(rèn)為年齡越小、組織學(xué)分級(jí)越高、腫瘤直徑越大的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后越差。本研究分析了ILT5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用價(jià)值，但具體作用機(jī)制及診療價(jià)值尚不清楚，有待后續(xù)探討。

綜上所述，ILT5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，可能與年齡、WHO分級(jí)、腫瘤直徑及預(yù)后等密切相關(guān)，有望成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診療的新靶點(diǎn)。