武君，梁艷，張森森，王娟，尚念梅，杜忠海

濰坊市中醫(yī)院腫瘤中心腫瘤科，山東 濰坊 261041

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種具有高度異質(zhì)性和高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），是發(fā)病率最高的NHL亞型，約占30%～40%，而在亞洲國家所占比例高達50%[1-2]。Alizadeh等[3]根據(jù)基因表達譜（gene expression profiling，GEP）技術將DLBCL分為生發(fā)中心B細胞樣（germinal center B cell-like，GCB）和活化B細胞樣（activated B cell-like，ABC）亞型。研究顯示，ABCDLBCL患者的預后比GCB-DLBCL差，仍有30%～40%的ABC-DLBCL患者接受現(xiàn)有的方案治療，無法得到持續(xù)緩解[4-5]。因此，研究DLBCL發(fā)生發(fā)展的生物學異質(zhì)性，尋找新的生物治療靶點對DLBCL的臨床診斷和治療有積極意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）在人類腫瘤、胚胎發(fā)育及代謝疾病等多種疾病中都發(fā)揮重要作用[6-7]。其中miRNA-34a作為抑癌基因p53的下游基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[8-11]。miRNA-34a轉錄受p53蛋白的正調(diào)控，引起細胞周期變化或細胞凋亡等，在p53作用通路中發(fā)揮重要作用[12-14]。研究表明，miRNA-34a在包括DLBCL在內(nèi)的多種惡性腫瘤中低表達[15]，提示miRNA-34a可能是潛在的抑癌因子。已有研究表明，miRNA-34a可以促進DLBCL細胞凋亡從而抑制DLBCL的發(fā)展[16]。叉頭框蛋白 P1（forkhead box protein 1，F(xiàn)OXP1）是FOXP亞家族轉錄因子成員，廣泛表達于各個組織并發(fā)揮多種生理功能，在不同的腫瘤組織中發(fā)揮不同的生物學作用[17]。FOXP1是B細胞發(fā)育過程中的關鍵轉錄調(diào)節(jié)因子，表達異常時容易產(chǎn)生B細胞淋巴瘤[18]。FOXP1蛋白在ABC-DLBCL中高表達，提示FOXP1可能作為癌基因參與了DLBCL的發(fā)生發(fā)展[19]。Cerna等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性淋巴細胞性白血病中，F(xiàn)OXP1可能作為miRNA-34a的靶點，通過負調(diào)控FOXP1蛋白的表達來限制B細胞受體信號通路。但miRNA-34a引起DLBCL細胞凋亡的具體機制目前尚不明確。因此，本研究探討miRNA-34a和FOXP1的表達變化對ABC-DLBCL細胞增殖和凋亡的影響，探討相關分子作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料及方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人胚腎細胞株293T、ABC-DLBCL細胞株SUDHL-2均購自上海澤葉生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、流式檢測試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)OXP13'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）野生型、突變型報告基因載體及其空載體均購自上海吉滿生物科技有限公司，miRNA-34a mimics購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)OXP1siRNA購自美國Sigma-Aldrich公司，逆轉錄試劑、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自德國Qiagen公司，Bradford蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，抗FOXP1抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗均購自美國CST公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Pharrnacai公司，雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司，熒光定量PCR檢測引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染及分組 人胚腎細胞株293T、ABC-DLBCL細胞株SU-DHL-2分別在5%CO2、37℃條件下，于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細胞以1×105/孔接種于24孔板，當細胞的生長密度為60%左右時開始進行轉染。按照LipofectamineTM2000試劑說明書中步驟及試劑使用量進行常規(guī)轉染：將6 μl脂質(zhì)體及20 pmol的復合物分別稀釋于250 μl的無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min后輕柔混勻，室溫靜置15 min后分別均勻加入各組培養(yǎng)板中，使復合物的終濃度為10 nmol/L，37℃溫箱中培養(yǎng)6 h后換為完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)SU-DHL-2細胞不同處理因素進行分組，其中未經(jīng)轉染處理的細胞作為Blank組，轉染miRNA-34a mimics的細胞作為miRNA-34a過表達組，轉染FOXP1siRNA的細胞作為FOXP1基因沉默組，轉染一段無義序列的細胞作為陰性對照NC組，轉染后常規(guī)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因實驗 通過Targetscan、miRanda和miRDB生物信息數(shù)據(jù)庫分析和既往相關研究報道提示FOXP1的3'-UTR區(qū)是miRNA-34a結合靶位點之一。因此，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA-34a對FOXP1野生型3'-UTR特異性結合的作用，將人胚腎細胞株293T根據(jù)實驗設計進行轉染分組，組1，轉染FOXP13'-UTR無義序列+miRNA無義序列；組2，轉染FOXP13'-UTR無義序列+miRNA-34a mimics；組3，轉染FOXP13'-UTR野生報告質(zhì)粒+miRNA無義序列；組4，轉染FOXP13'-UTR野生報告質(zhì)粒+miRNA-34a mimics；組5，轉染FOXP13'-UTR突變報告質(zhì)粒+miRNA無義序列；組6，轉染FOXP13'-UTR突變報告質(zhì)粒+miRNA-34a mimics。轉染后分別常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）說明書步驟處理細胞，在多功能微孔板檢測儀上測定并分析結果。

1.2.3 RT-PCR檢測miRNA-34a和FOXP1mRNA的相對表達量 分別取Blank組、NC組、50 nmol/L miRNA-34a過表達組、100 nmol/L miRNA-34a過表達組、50 nmol/LFOXP1基因沉默組、100 nmol/LFOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞。采用Trizol法分別提取各組細胞總RNA，并檢測其濃度及純度；按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，并以此為模板于ABI PRISM 7900HT型熒光定量PCR儀上行實時PCR反應，以U6和GAPDH為內(nèi)參。PCR反應體系4 μl，反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，50個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，40 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法檢測各組細胞miRNA-34a和FOXP1mRNA的相對表達量，實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測FOXP1蛋白的相對表達量 分別取Blank組、NC組、50 nmol/L miRNA-34a過表達組、100 nmol/L miRNA-34a過表達組、50 nmol/LFOXP1基因沉默組、100 nmol/LFOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞。加入適量的放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，提取總蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。取50 ng蛋白置于離心管中加入適量十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜，TBST洗膜3次，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（稀釋濃度為1∶1000）4℃過夜；TBST洗滌3次，加入二抗，室溫孵育2 h；化學發(fā)光顯色法顯影，以GAPDH為內(nèi)參，檢測各組細胞FOXP1蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.2.5 CCK8法檢測細胞增殖能力 選取Blank組、NC組及相對表達量較高的100 nmol/L miRNA-34a過表達組和FOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞進行檢測。以3×103/孔接種于96孔板，分別在0、24、48、72、96 h時加入10 μl的CCK8溶液，每組設置6個重復孔；37℃培養(yǎng)2 h后，使用多功能微孔板檢測儀檢測450 nm處各孔吸光度（optical density，OD）值，記錄結果并繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 同增殖實驗選取Blank組、NC組及相對表達量較高的100 nmol/L miRNA-34a過表達組和FOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞進行檢測。采用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入結合緩沖液制成細胞懸液；按試劑盒說明書中建議的試劑體系用量依次加入膜聯(lián)蛋白V（AnnexinⅤ）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）后輕輕混勻，室溫避光處孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，Cell Quest軟件進行結果分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-34a的相對表達量的比較

NC組和Blank組細胞中miRNA-34a相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。50 nmol/L miRNA-34a過表達組和100 nmol/L miRNA-34a過表達組SU-DHL-2細胞中miRNA-34a的相對表達量均明顯高于Blank組和NC組細胞，其中100 nmol/L miRNA-34a過表達組SU-DHL-2細胞中miRNA-34a的相對表達量明顯高于50 nmol/L miRNA-34a過表達組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 各組SU-DHL-2細胞miRNA-34a相對表達量的比較（±s）

表2 各組SU-DHL-2細胞miRNA-34a相對表達量的比較（±s）

注：a與Blank組比較，P＜0.01；b與NC組比較，P＜0.01；c與50 nmol/L miRNA-34a過表達組比較，P＜0.01

組別Blank組NC組50 nmol/L miRNA-34a過表達組100 nmol/L miRNA-34a過表達組1.00±0.09 1.13±0.10 4.81±0.15a b 10.67±0.17a b c miRNA-34a相對表達量

2.2 miRNA-34a過表達對SU-DHL-2細胞增殖和凋亡的影響

研究發(fā)現(xiàn)隨著轉染時間的延長，miRNA-34a過表達組、NC組和Blank組SU-DHL-2細胞OD均逐漸升高，但轉染同一時間點3組SU-DHL-2細胞OD值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。miRNA-34a過表達組SU-DHL-2細胞凋亡率（32.76±0.19）%，明顯高于NC組細胞的（20.87±0.14）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=81.597，P=0.000）（圖1）。

表3 不同轉染時間各組SU-DHL-2細胞的OD值（±s）

表3 不同轉染時間各組SU-DHL-2細胞的OD值（±s）

轉染時間0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 0.185±0.03 0.384±0.06 0.585±0.06 0.705±0.06 0.868±0.07 0.195±0.04 0.379±0.05 0.576±0.05 0.695±0.06 0.858±0.07 0.187±0.02 0.403±0.07 0.689±0.08 0.787±0.08 0.997±0.09 Blank組NC組miRNA-34a過表達組

圖1 流式細胞儀檢測miRNA-34a過表達對SU-DHL-2細胞凋亡的影響

2.3 miRNA-34a過表達對FOXP1mRNA和FOXP1蛋白表達的影響

Blank組和NC組SU-DHL-2細胞中FOXP1mRNA和FOXP1蛋白相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。miRNA-34a過表達組細胞FOXP1mRNA和FOXP1蛋白的相對表達量均明顯低于Blank組和NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表4）

表4 miRNA-34a過表達對FOXP1 mRNA和FOXP1蛋白表達的影響（±s）

表4 miRNA-34a過表達對FOXP1 mRNA和FOXP1蛋白表達的影響（±s）

注：a與Blank組比較，P＜0.01；b與NC組比較，P＜0.01

組別Blank組NC組miRNA-34a過表達組1.00±0.08 0.98±0.08 0.25±0.06a b 1.02±0.10 0.94±0.09 0.18±0.04a b FOXP1 mRNA FOXP1蛋白

2.4 雙熒光素酶報告基因檢測結果

雙熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA-34a對FOXP1野生型3'-UTR特異性結合的作用，結果顯示，組1的熒光素酶活性值為（1.00±0.03）與組2的（0.98±0.02）比較，差異無統(tǒng)計學差異（t=0.961，P=0.196）；組3的熒光素酶活性值為（0.95±0.09），高于組 4的（0.28±0.02），差異有統(tǒng)計學意義（t=12.587，P=0.000）；組5的熒光素酶活性值為（0.93±0.04）與組6的（0.99±0.04）比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.837，P=0.070）。（圖2）

圖2 FOXP13'-UTR 野生型熒光素酶質(zhì)粒轉染293T細胞圖（×200）

2.5 FOXP1siRNA對FOXP1mRNA和FOXP1蛋白表達水平的影響

Blank組與NC組細胞FOXP1mRNA及FOXP1蛋白的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。50 nmol/LFOXP1基因沉默組和100 nmol/LFOXP1基因沉默組細胞FOXP1mRNA及FOXP1蛋白的相對表達量均明顯低于Blank組和NC組細胞，其中100 nmol/LFOXP1基因沉默組FOXP1mRNA及FOXP1蛋白的相對表達量，均明顯低于50 nmol/LFOXP1基因沉默組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表5）

2.6 FOXP1基因沉默對SU-DHL-2細胞增殖和凋亡的影響

隨著轉染時間的延長，Blank組、NC組及FOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞OD值均逐漸升高，但相同轉染時間點3組細胞OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表6）；FOXP1基因沉默組SU-DHL-2細胞凋亡率（35.18±0.22）%，明顯高于NC組細胞的（21.98±0.16）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=84.046，P=0.000）（圖3）。

表5 FOXP1 siRNA對FOXP1 mRNA和FOXP1蛋白表達水平的影響（±s）

表5 FOXP1 siRNA對FOXP1 mRNA和FOXP1蛋白表達水平的影響（±s）

注：a與Blank組比較，P＜0.01；b與NC組比較，P＜0.01；c與50 nmol/L FOXP1基因沉默組比較，P＜0.01

組別Blank組NC組50 nmol/L FOXP1基因沉默組100 nmol/L FOXP1基因沉默組1.00±0.03 1.01±0.05 0.40±0.03a b 0.09±0.01a b c 0.98±0.03 0.87±0.05 0.31±0.06a b 0.13±0.04a b c FOXP1 mRNA FOXP1蛋白

表6 CCK8法檢測轉染FOXP1 siRNA后SU-DHL-2細胞增殖情況（±s）

表6 CCK8法檢測轉染FOXP1 siRNA后SU-DHL-2細胞增殖情況（±s）

Blank組0.185±0.03 0.395±0.04 0.605±0.03 0.753±0.03 0.918±0.02 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 0.195±0.03 0.390±0.03 0.598±0.02 0.747±0.04 0.911±0.04 0.184±0.04 0.377±0.02 0.567±0.08 0.739±0.05 0.898±0.02轉染時間NC組FOXP1基因沉默組

圖3 流式細胞儀檢測FOXP1siRNA對SU-DHL-2細胞凋亡的影響

3 討論

研究表明，細胞發(fā)生了非正常的增殖和凋亡是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[21]。由于DLBCL是一類在分子病理學、細胞遺傳學、臨床表現(xiàn)及預后等多個方面都具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，多種因素、多種基因交互參與其中，因此，DLBCL發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的分子機制仍不完全明確，有待于進行更深入的研究[22]。因此，進一步探索與DLBCL發(fā)生發(fā)展、臨床療效或預后相關的新的分子標志物、開發(fā)特異性治療靶點、優(yōu)化臨床治療策略，對患者進行預后分層及個體化治療，對改善臨床療效，提高患者的生存率有重要意義。

既往研究表明，miRNA常通過與染色體脆性位點或與腫瘤相關的基因組區(qū)結合，起到調(diào)節(jié)靶基因轉錄后表達水平的作用[23]。Yu和Li[24]研究發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤患者存在明顯的miRNA表達失調(diào)，表明miRNA對淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展可能有重要作用。多項研究結果表明，miRNA-17-92、miRNA-21、miRNA-155等在DLBCL中高表達，直接參與了DLBCL的發(fā)生和發(fā)展過程[25-27]。miRNA可能作為分子標志物及個體化治療的潛在靶點，將對DLBCL的治療和預后評估產(chǎn)生重要影響。經(jīng)典抑癌基因p53的直接下游靶標miRNA-34a在ABC-DLBCL細胞中相對表達量很低，人為上調(diào)miRNA-34a的表達后可以誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，但具體的分子機制仍不明確[28-29]。本研究將miRNA-34a mimics轉染至SU-DHL-2細胞，觀察miRNA-34a過表達對SU-DHL-2細胞增殖和凋亡的影響，結果顯示，miRNA-34a過表達組細胞的凋亡率高于NC組，人為上調(diào)miRNA-34a的表達后對SU-DHL-2細胞的增殖能力沒有影響，與以上結論相符。

本研究結合既往研究結果及Targetscan、mi-Randa和miRDB三個生物學數(shù)據(jù)庫篩選出FOXP1作為進一步研究對象。Gascoyne和Banham[30]研究結果顯示，F(xiàn)OXP1基因表達失調(diào)在DLBCL的發(fā)病機制中可能發(fā)揮重要作用。但目前關于FOXP1在DLBCL中作用機制的研究報道較少。本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，組3（轉染FOXP13'-UTR野生報告質(zhì)粒+miRNA無義序列）熒光素酶活性值高于組4（轉染FOXP1 3'-UTR野生報告質(zhì)粒+miRNA-34a mimics），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明miRNA-34a過表達與FOXP13'-UTR（野生型）能夠特異性結合從而降低熒光素酶活性值，F(xiàn)OXP1是miRNA-34a直接調(diào)控的靶基因。通過進一步的RT-PCR和Western blot實驗結果顯示，與Blank組和NC組比較，miRNA-34a過表達組中FOXP1mRNA及FOXP1蛋白相對表達量均受到明顯抑制，表明miRNA-34a對FOXP1起到負調(diào)控作用，miRNA-34a過表達明顯抑制了SUDHL-2細胞FOXP1轉錄后的表達水平；這與其他多項研究結果相一致[20,31-33]。在進一步FOXP1基因沉默對SU-DHL-2細胞增殖和凋亡影響的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1基因沉默對SU-DHL-2細胞凋亡有明顯的促進作用，認為miRNA-34a可能通過負調(diào)控FOXP1的表達來促進SU-DHL-2細胞的凋亡，因此，敲除FOXP1可促進SU-DHL-2細胞的凋亡；而FOXP1基因沉默對SU-DHL-2細胞增殖無明顯影響。

綜上所述，miRNA-34a抑制ABC-DLBCL細胞的發(fā)生發(fā)展可能與miRNA-34a通過結合FOXP13'-UTR有效抑制FOXP1蛋白表達進而促進細胞凋亡有關。本研究為DLBCL的基因個體化治療策略提供新的思路和方法，miRNA-34a或FOXP1相互作用可能成為治療DLBCL的新靶點。