盧恩敏，盧恩娟，高麗京，裴立靜，王慶艷

1唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院兒科，河北 唐山 063000

2唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院兒科，河北 唐山 063000

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[1]。目前的治療手段主要是以手術(shù)和放化療結(jié)合為主，術(shù)后患者生存率低，且多數(shù)患者常伴隨長期的放化療不良反應(yīng)[2-3]。目前尚無針對(duì)性的治療藥物，研究MB發(fā)病的分子機(jī)制，探索可用于MB治療的分子生物學(xué)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)MB的靶向治療，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號(hào)通路在胃癌、淋巴癌等多種腫瘤組織中異常激活，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]，GANT61是SHH信號(hào)通路特異性的抑制劑[5]。本研究通過向人MB Daoy細(xì)胞中加入不同濃度的GANT61，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物胱天蛋白酶3（caspase 3）、細(xì)胞周期標(biāo)志物p21和細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）及SHH信號(hào)通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子GLI家族鋅指蛋白 1（GLI family zinc finger 1，GLI1）和 GLI家族鋅指蛋白 2（GLI family zinc finger 2，GLI2）的影響，旨在為臨床治療MB提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人MB Daoy細(xì)胞株購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。GANT61購自美國Abcam公司。相差顯微鏡購自德國Leica公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，凝膠成像裝置、電泳儀電源、轉(zhuǎn)膜裝置均購自上海天能科技有限公司。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均購自上海恒斐生物科技有限公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，cyclin D1抗體購自美國CST公司，p21、caspase 3抗體均購自美國Abcam公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。MiniBEST Universal RNA Extraction Kit購自日本TaKaRa公司，TaqMan Small RNA Assays試劑盒購自美國Life公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出人MB Daoy細(xì)胞后，置于37℃水浴鍋中復(fù)蘇細(xì)胞。離心去除凍存液（胎牛血清∶DMSO=9∶1）后接種至含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔1天換1次液。每隔2～3天傳代1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞在正常狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組，共分為4組。A組：培養(yǎng)液中加入0.1%DMSO；B組：培養(yǎng)液中加入10 μmol/L GANT61 和0.1%DMSO；C組：培養(yǎng)液中加入20 μmol/L GANT61和0.1%DMSO；D組：培養(yǎng)液中加入40 μmol/L GANT61和0.1%DMSO。

1.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖

分別于4組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48 h后，吸出培養(yǎng)基，加入含5 mg/ml MTT的新鮮DMEM培養(yǎng)基100 μl，37℃恒溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對(duì)表達(dá)量

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取細(xì)胞中的RNA，然后按照TaqMan Small RNA Assays說明書合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)條件：95℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。GLI1mRNA上游引物為5'-CAGGGAGGAAAGCAGACTGAC-3'，下游引物為5'-GGCTTGGCTGTGGCTTCA-3'；GLI2mRNA上游引物為5'-CAACCAGAACAAGCAGAGCA-3'，下游引物為5'-ACCTCAGCCTCCTGCTTACA-3'。以β-actin為 內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測cyclin D1、p21、caspase3蛋白的表達(dá)情況

加入適量RIPA裂解液裂解細(xì)胞，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳至溴酚藍(lán)跑出膠面，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行半定量分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

4組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，70%乙醇固定6 h，加入l ml PI后于4℃冰箱中染色30 min，上機(jī)檢測每組樣本的DNA含量。應(yīng)用MuticycleAV分析軟件對(duì)每組樣本的細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況的比較

培養(yǎng)24 h后，C組和D組細(xì)胞的OD值均低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)48 h后，C組和D組細(xì)胞的OD值均低于A組，D組細(xì)胞的OD值低于B組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 培養(yǎng)0、24、48 h后4組細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

表1 培養(yǎng)0、24、48 h后4組細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05；c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組0.103±0.014 0.112±0.025 0.103±0.035 0.553±0.039 0.443±0.014 0.352±0.130a 0.761±0.121 0.552±0.121 0.364±0.014a D組OD值0 h 0.113±0.014 24 h 0.235±0.043a 48 h 0.140±0.013a b c

2.2 GLI1mRNA、GLI2mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

4組細(xì)胞中GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。C組和D組細(xì)胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于A組，D組細(xì)胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 4組細(xì)胞中GLI1 mRNA、GLI2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 cyclin D1、p21、caspase3蛋白表達(dá)情況的比較

4組細(xì)胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。C組和D組細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)水平均低于A組和B組，p21、caspase 3蛋白表達(dá)水平均高于A組和B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 4組細(xì)胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表3 4組細(xì)胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F值P值cyclin D1 0.734±0.232 0.721±0.183 0.442±0.171a b 0.284±0.009a b 16.622 0.000 p21 1.153±0.122 1.022±0.315 1.866±0.231a b 1.865±0.212a b 38.530 0.000 caspase 3 0.975±0.144 0.862±0.233 1.366±0.148a b 1.385±0.234a b 18.941 0.000

2.4 細(xì)胞周期分布情況的比較

B組、C組和D組中G0/G1期細(xì)胞比例均高于A組，G2/M期細(xì)胞比例均低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組和D組中G0/G1期細(xì)胞比例均高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

表4 4組細(xì)胞中細(xì)胞周期分布情況的比較（%，±s）

表4 4組細(xì)胞中細(xì)胞周期分布情況的比較（%，±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F值P值43.816±5.873 56.653±6.810a 58.355±8.922a b 60.383±7.134a b 10.592 0.000 35.453±2.534 33.342±3.210 30.564±5.376 31.223±6.341 2.291 0.095 20.423±4.223 10.726±4.645a 10.544±1.637a 8.326±2.134a 24.924 0.000 G0/G1期S期G2/M期

3 討論

MB嚴(yán)重影響著世界兒童的健康，每年死亡人數(shù)約達(dá)10萬，但是具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[6]。研究發(fā)現(xiàn)，SHH信號(hào)通路的上下游出現(xiàn)異常激活均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SHH信號(hào)通路在胃癌中過度激活與胃癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，SHH信號(hào)通路抑制劑可降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力[7]。GLI1和GLI2是SHH信號(hào)通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活作用，在腫瘤中表達(dá)升高并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。研究表明，GLI的特異性抑制劑GANT61可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的SHH信號(hào)通路，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖具有重要影響[9]。細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分，細(xì)胞周期調(diào)控失?？蓪?dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。cyclin D1基因位于人染色體11q13，是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一。cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在許多組織的癌變過程中，可檢測到cyclin D1的表達(dá)上調(diào)，它是評(píng)價(jià)腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。目前認(rèn)為，cyclin D1是調(diào)控G期至S期最關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白，細(xì)胞周期抑制蛋白p21可抑制cyclin D1的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[10-11]。細(xì)胞凋亡是多基因多階段嚴(yán)格調(diào)控的過程。caspase 3是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白，能夠反映細(xì)胞的凋亡水平。有研究表明，caspase 3可以被cyclin D1、p21、GLI1激活，caspase 3被激活后，可使細(xì)胞核及細(xì)胞骨架中的重要蛋白酶失活，誘導(dǎo)凋亡小體形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-15]。

本研究結(jié)果顯示，GANT61可顯著抑制人MB Daoy細(xì)胞的生長，具有抑制MB細(xì)胞增殖的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GANT61能夠抑制SHH信號(hào)通路下游的關(guān)鍵靶點(diǎn)GLI1和GLI2mRNA水平。Western blot結(jié)果顯示，GANT61對(duì)細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白cyclin D1有下調(diào)作用，對(duì)于p21及caspase 3有上調(diào)作用，說明GANT61具有阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步研究GANT61對(duì)MB細(xì)胞周期的阻滯作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)應(yīng)用DMSO相比，GANT61可阻滯更多腫瘤細(xì)胞于G0/G1期。本研究推測GANT61調(diào)控細(xì)胞周期和抗腫瘤的機(jī)制可能主要是通過抑制GLI1mRNA和GLI2mRNA水平進(jìn)而影響cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，GLI1抑制劑GANT61對(duì)MB細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，主要是通過調(diào)節(jié)GLI1和GLI2的mRNA水平進(jìn)而影響cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。目前的研究結(jié)果提示，GANT61有望成為臨床治療MB的新藥物。