鄧慧芬, 張建瑩*, 卞學(xué)海, 羅 耀, 趙祥龍

(1. 深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 深圳 518045; 2. AB SCIEX亞太應(yīng)用中心, 上海 201206)

芬太尼,是一種強(qiáng)效的麻醉性阿片類鎮(zhèn)痛藥,于1960年由比利時藥理學(xué)家和藥劑師保羅·楊森研制出[1],并作為靜脈麻醉劑廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉中,其主要機(jī)制與嗎啡相似。由于芬太尼的特殊藥理性質(zhì),以及靈活的通過靜脈、皮膚和黏膜給藥方式,芬太尼已成為治療疼痛最重要的阿片類藥物之一。隨著對芬太尼藥物研究的不斷深入,以其為先導(dǎo)化合物,通過結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系的評價,設(shè)計、合成、篩選到了一系列藥效更強(qiáng)的芬太尼類衍生物,它們大多通過以下一個或多個方式得到(見圖1): 1.使用其他?；娣姨岬谋；?如乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、奧芬太尼); 2.使用其他任意基團(tuán)(氫原子除外)替代苯乙基部分(如β-羥基硫代芬太尼); 3.哌啶環(huán)上存在烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羥基、鹵素、鹵代烷基、氨基及硝基等取代基;4.使用任何取代或未取代的單環(huán)芳香基團(tuán)替代與氮原子直接相連的苯基。

圖 1 芬太尼及芬太尼類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of fentanyl and fentanyl and its analogues

作為藥品研制出來的芬太尼卻在一些國家被一些人作為毒品使用。芬太尼類物質(zhì)藥效較強(qiáng),如芬太尼衍生物卡芬太尼,其藥效和毒性是海洛因的5 000倍,約2 mg劑量就足以使一個成年人死亡[1]。美國疾病預(yù)防控制中心稱,2016年美國超過2萬起死亡由芬太尼類物質(zhì)吸食過量導(dǎo)致。對此,2019年5月1日起,我國將芬太尼類物質(zhì)全面列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》,開發(fā)該類藥物的檢測方法已成為監(jiān)管部門迫切需要。

目前,國內(nèi)芬太尼類物質(zhì)的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、高效液相色譜(HPLC)法[2-4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[5-12],主要針對芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等單一藥物進(jìn)行分析,方法涉及的基質(zhì)包括血液、乳汁、尿液、唾液等生物基質(zhì)。我國司法鑒定技術(shù)規(guī)范(SF/Z JD0107005-2016)[10]采用LC-MS/MS法測定血液、尿液中芬太尼和舒芬太尼的含量。聯(lián)合國毒品與犯罪問題辦公室推薦方法[1]中,GC-MS方法只涉及4種芬太尼類物質(zhì)的檢測,液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)高分辨方法中也只涉及10多種芬太尼類物質(zhì)的篩查檢測。Craig等[13]采用LC-MS/MS法測定干血中11種芬太尼類物質(zhì),定量限均為0.10 ng/mL。Melissa等[14]采用LC-MS/MS法測定了血液中18種芬太尼類物質(zhì)。但較少有針對廣泛的藥物和毒品疑似物中芬太尼類物質(zhì)的高通量篩查檢測和確證方法報道,這也導(dǎo)致了處方芬太尼類藥物的過量流行和非法芬太尼類藥物的出現(xiàn)。單級質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜的低分辨率、分析速度和掃描模式?jīng)Q定了它們無法滿足痕量藥物的高通量篩查檢測的要求。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,近年來Q-TOF/MS和Orbitrap MS憑借其在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性和數(shù)據(jù)庫檢索等方面的優(yōu)勢,以及質(zhì)譜內(nèi)部件的極大改進(jìn)(如飛行時間質(zhì)譜的飛行管由原來的V型設(shè)計成N型),能很好地彌補(bǔ)先前定量不足的缺陷,已廣泛應(yīng)用于藥物篩查檢測領(lǐng)域[6-13]。本方法通過75%(v/v,下同)乙腈水溶液提取固體和液體藥物中的芬太尼類物質(zhì),采用HLB固相萃取柱凈化,QTOF的信息依賴性采集(Information dependent acquisition, IDA)掃描模式獲取所有化合物的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜信息,建立一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級質(zhì)譜圖庫,結(jié)合色譜保留時間信息,建立了液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)篩查檢測藥物中27種芬太尼類物質(zhì)(包括芬太尼及26種類似物或代謝物)的方法。本方法的建立將有助于在監(jiān)管范圍、檢測技術(shù)和時效性等多方面提升芬太尼類藥物的安全監(jiān)管水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀(SCIEX X500R QTOF,美國AB SCIEX公司);均質(zhì)儀(美國Omni公司);渦旋振蕩儀(Rax top,德國Heidolph公司);高速冷凍離心機(jī)(3K18,德國Sigma公司);高純水發(fā)生器(Milli-Q Integral 10+,美國Millipore公司); HLB固相萃取柱(60 mg, 3 mL, Waters公司); 0.22 μm有機(jī)濾膜(上海安譜公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純(德國Merck公司),其他試劑均為分析純,水為Milli-Q超純水。27種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(各化合物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L,美國Cerilliant公司)。使用乙腈稀釋為1.00 mg/L和100 μg/L兩種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(-18 ℃避光存放)。采用空白樣品(根據(jù)待測樣品的性質(zhì)選擇維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑樣品為空白樣品)基質(zhì)液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制成質(zhì)量濃度為5.00、10.0、25.0、50.0和100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品前處理

固體、粉末樣品取適量研細(xì)成粉末,攪拌均勻。液體樣品稱取前要搖晃均勻。透皮貼劑樣品揭去防粘層,剪碎。

稱取試樣1.00 g,加入5 mL 75%乙腈水溶液,渦旋溶解,再加入5 mL乙腈,渦旋30 s,超聲提取15 min,渦旋混合1 min, 9 500 r/min離心5 min,吸取全部上清液于40 ℃水浴中氮吹至低于3 mL。吸取濃縮液于HLB固相萃取小柱(使用前用5 mL乙腈活化)中,待上清液全部流出小柱,再加入4 mL乙腈洗脫。收集所有流出液,于40 ℃水浴中氮吹至低于0.5 mL,加入0.5 mL水,再用乙腈定容為1.00 mL,渦旋振蕩30 s, 9 500 r/min離心5 min。取上清液,過0.22 μm有機(jī)濾膜,LC-QTOF-MS測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm, 美國Agilent公司)。流動相A: 0.1%(v/v,下同)甲酸水;流動相B: 乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸,v/v,下同)。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 5%B; 2.0～5.0 min, 5%B～50%B; 5.0～16.0 min, 50%B; 16.0～16.1 min, 50%B～5%B; 16.1～20.0 min, 5%B。流速:0.3 mL/min。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源和氣體參數(shù):加熱電噴霧離子(HESI)源;噴霧電壓5 500 V;毛細(xì)管溫度325 ℃;加熱器溫度550 ℃;霧化氣3.79 Pa;輔助氣4.14 Pa;氣簾氣35 u;碰撞氣7 u;掃描模式:IDA;正離子采集模式。TOF-MS參數(shù):采集范圍為m/z200～450,去簇電壓(DP) 80 V,碰撞能(CE) 10 V,累積時間0.16 s。TOF-MS/MS參數(shù):采集范圍為m/z80～450,累積時間0.06 s,電荷數(shù)1;質(zhì)譜掃描參數(shù)見表1。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

1.5.1分辨率

高分辨質(zhì)譜在合適的分辨率下可以將目標(biāo)化合物與基質(zhì)中的同質(zhì)異位素干擾物實現(xiàn)基線分離,從而得到更為準(zhǔn)確的定性結(jié)果。基于X500R QTOF-MS可采集到未知物的高分辨率質(zhì)譜一級(≥35 000)和二級數(shù)據(jù),且質(zhì)譜精確度≤5×10-6(5 ppm),具有實現(xiàn)目標(biāo)物與干擾物質(zhì)完全基線分離、有效地去除基質(zhì)干擾、提取離子色譜圖清晰完整、可準(zhǔn)確定性和定量等優(yōu)點(diǎn),本實驗一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜均采用≥35 000的分辨率,得到的譜圖既有母離子的精確質(zhì)量數(shù),又有二級質(zhì)譜全掃描信息,完全滿足定性和定量要求。圖2為采用IDA掃描方式得到的芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液的全掃描色譜圖和TOF-MS、TOF-MS/MS質(zhì)譜圖。

1.5.2一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫

在優(yōu)化的LC-MS條件下進(jìn)樣,對27種化合物先進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描,獲得目標(biāo)物的高分辨質(zhì)譜信息?；衔锏拿Q、保留時間、分子式、一級質(zhì)譜理論質(zhì)量數(shù)、一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量數(shù)偏差、2個二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)等信息見表1。

表 1 27種化合物的質(zhì)譜信息和保留時間

1.5.3MS/MS二級譜庫

聊了一陣子，話頭轉(zhuǎn)到西瓜上來了，她說：“你種的西瓜真好，甜得很?！逼柿斯?，自己拿一瓣，還拿一瓣給我。我咬了兩口，見上面有瓜籽，就用小指把它摳出來，瓜籽摳出來了，沾在我的指尖，我的臉也像瓜瓤子，通紅通紅的。

根據(jù)歐盟《食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認(rèn)的指導(dǎo)文件》(SANTE/11813/2017)[15]中規(guī)定的高分辨質(zhì)譜定性最低要求,必須一個高分辨母離子加一個高分辨子離子,且質(zhì)量偏差<5 ppm。將目標(biāo)物精確質(zhì)量母離子在不同碰撞能量下(20、35和50 eV)進(jìn)行測定,采集并疊加二級譜圖庫所有的子離子信息,建立化合物的二級信息譜庫。

圖 2 芬太尼的(a)全掃描色譜圖、(b)一級質(zhì)譜圖和(c)二級質(zhì)譜圖Fig. 2 (a) Total ion chromatogram, (b) TOF-MS spectra and (c) TOF-MS/MS spectra of fentanyl

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱

由于芬太尼類物質(zhì)具有苯基、烷基和酰胺等基團(tuán),化學(xué)性質(zhì)差異較大,同時有部分同分異構(gòu)體,因此本方法優(yōu)先考慮使用苯基-己基(Phenyl-Hexyl)色譜柱;當(dāng)使用含甲醇流動相時,其對極性/胺類化合物和芳香族化合物有顯著的選擇性。結(jié)果表明,在使用0.1%甲酸水-乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸)為流動相時,27種芬太尼類物質(zhì)在苯基-己基色譜柱中均得到較好的分離和保留,其中包括兩類4種同分異構(gòu)體(4-氟異丁酰芬太尼和4-氟丁酰芬太尼,丁酰芬太尼和對氟芬太尼)。

2.1.2流動相

考察了乙腈-水、甲醇-水和乙腈/甲醇(1∶1)-水(水相和有機(jī)相中均分別添加0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨(含0.01%甲酸,pH約為4.5)和5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸,pH約為3.2))流動相條件下的色譜分離效果。在不同流動相條件下目標(biāo)化合物的分離度存在差異,且質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)弱不同。在甲醇-水流動相體系中,大多數(shù)化合物響應(yīng)較強(qiáng),分離度相對較好,但個別化合物峰形稍差。在乙腈-水流動相條件下,較多化合物峰形較好,但4種同分異構(gòu)體的色譜峰分離度較差。乙腈/甲醇(1∶1)混合溶液-水流動相的優(yōu)點(diǎn)是同分異構(gòu)體分離更好,能同時兼顧峰形和分離度,這可能是由乙腈和甲醇的洗脫能力以及黏度差異導(dǎo)致的。在流動相中加入少量甲酸(0.1%)有利于提高分析物的離子化效率并改善色譜峰峰形,提高質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果表明,以0.1%甲酸水-乙腈/甲醇(1∶1,含0.1%甲酸)為流動相比添加乙酸銨的流動相體系獲得更優(yōu)的色譜峰形及質(zhì)譜響應(yīng)。在優(yōu)化的色譜條件下,27種芬太尼類物質(zhì)的保留時間見表1,提取離子色譜圖見圖3。

圖 3 27種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatogram of the 27 compound standard solution (10.0 μg/L)

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑

根據(jù)溶劑性質(zhì)、目標(biāo)化合物性質(zhì)、樣品基質(zhì)特點(diǎn)和檢測靈敏度的要求及有機(jī)溶劑含量高更有利于樣液濃縮的需要,選取乙腈-水溶液作為提取溶劑。同時考察了50%乙腈水溶液、75%乙腈水溶液、100%乙腈對固體、液體藥物樣品中27種目標(biāo)化合物的提取效果。結(jié)果表明,加入適量水,可增加固體藥物的溶解,提高目標(biāo)化合物的提取效率;但加入過多的水分又不利于樣液的濃縮。綜合考慮,選取5 mL的75%乙腈水溶液+5 mL乙腈為提取溶劑。

2.2.2凈化柱

2.2.3洗脫液用量

分別比較了HLB固相萃取柱洗脫液使用2、3、4、5 mL乙腈對27種目標(biāo)化合物的回收率的影響。結(jié)果表明,乙腈洗脫量為4 mL時,27種目標(biāo)化合物的總體回收率較好,其回收率為73.3%～83.3%(見圖4)。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

實驗考察了止咳水、維生素C壓片、透皮貼劑和頭痛粉樣品的基質(zhì)效應(yīng),用純?nèi)軇┖突|(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液,得到目標(biāo)物的溶劑和樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程,根據(jù)ME=Ka/Kb(其中Ka是指樣品基質(zhì)的校準(zhǔn)曲線斜率,而Kb是指溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)計算,并繪制基質(zhì)效應(yīng)圖。由圖5可知,這4種樣品的ME值在98.0%～130%之間,說明基質(zhì)效應(yīng)較低。這4種基質(zhì)干擾較小,樣品可直接采用50%乙腈水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,但因其他復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)未考察,因此在方法考察中統(tǒng)一使用基質(zhì)匹配曲線。

圖 4 洗脫液體積對化合物回收率的影響Fig. 4 Effects of eluent volume on recoveries

圖 5 27種芬太尼類物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 5 Matrix effects (ME) of 27 fentanyl analogs and metabolites

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1定性方法的準(zhǔn)確度和精密度

在維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑空白樣品中添加27種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液(50.0 μg/kg)作為樣品進(jìn)行測定。由表1可知,27種化合物的精確質(zhì)量數(shù)的偏差在3.0×10-7～2.1×10-6之間,二級全掃描質(zhì)譜圖的匹配度在90%以上。

2.4.2方法的線性方程和定量限

本方法在快速篩查的基礎(chǔ)上通過提取一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定量從而實現(xiàn)同步定量分析,每個化合物采集點(diǎn)數(shù)均可在20個以上,保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測組分的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。27種芬太尼類物質(zhì)在5.00～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。

方法的定量限是基于回收率和精密度滿足歐盟SANTE/11813/2017要求而進(jìn)行驗證的最低濃度水平。試驗結(jié)果顯示,27種物質(zhì)的定量限均為10.0 μg/kg。芬太尼類物質(zhì)為列管物質(zhì),違禁試樣主要為郵寄、運(yùn)輸、旅客攜帶的未知物、非法及處方藥物,這些違禁物中芬太尼類物質(zhì)的含量一般都較高,10.0 μg/kg的定量限已足夠檢測和監(jiān)管需要。

2.4.3加標(biāo)回收率和精密度

分別采用空白維生素C壓片、頭痛粉、止咳水、透皮貼劑樣品作為驗證基體。各化合物的添加水平為10.0、20.0及50.0 μg/kg,每個水平做6個平行樣。按本方法中測定步驟操作,外標(biāo)法定量,計算每種驗證基體的回收率范圍和精密度。在維生素C壓片中3個添加水平下的平均回收率分別為84.8%～106%、 83.7%～96.3%和82.9%～96.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.38%～7.15%之間(n=6,見表2);在頭痛粉中3個添加水平下的平均回收率分別為84.8%～106%、 87.6%～100%和85.5%～100%,RSD在0.86%～8.49%之間(n=6);在止咳水中3個添加水平下的平均回收率分別為93.0%～109%、 88.7%～97.3%和86.9%～96.9%,RSD在1.12%～7.81%之間(n=6);在透皮貼劑中3個添加水平下的平均回收率分別為83.1%～106%、 89.0%～101%和87.5%～98.1%,RSD在0.69%～8.71%之間(n=6)。

3 結(jié)論

本實驗利用高效液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜對固體壓片、粉末、液體、透皮貼劑中27種芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行篩查測定,20 min內(nèi)可完成27種芬太尼類物質(zhì)的高通量篩選和確認(rèn)。高分辨質(zhì)譜在樣品分析中消除了基質(zhì)干擾,結(jié)合固相萃取前處理方法,極大提高了方法的定性準(zhǔn)確性和定量靈敏度。以精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜圖和相對保留時間為基礎(chǔ),構(gòu)建了27種芬太尼類物質(zhì)篩查數(shù)據(jù)庫,建立了27種芬太尼類物質(zhì)的快速篩查和確證方法。該方法作為一種國內(nèi)外高度關(guān)注的新型毒品芬太尼類物質(zhì)的快速篩選和確證檢測技術(shù),必將在公安緝毒、刑偵及相關(guān)檢測部門對芬太尼類物質(zhì)監(jiān)控篩查和確認(rèn)中得到廣泛應(yīng)用,具有應(yīng)用價值。