殷夢竹，顏玉娟，顏立紅

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省森林植物園，湖南 長沙 410116）

土壤鹽堿化是影響植物自然分布、生長發(fā)育、降低作物產(chǎn)量和影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的生態(tài)問題之一[1-3]，嚴(yán)重制約了我國農(nóng)林業(yè)的發(fā)展[4]，其中，NaCl，Na2CO3，NaHCO3和Na2SO4是鹽堿土中最常見的鹽形態(tài)[5]。堿性鹽脅迫往往在鹽度升高的同時伴隨著pH升高，因此土壤中含有HCO3-和CO32-等陰離子的情況下，植物在受到鹽脅迫的同時還會受到高pH脅迫，通常情況下這種脅迫比單一的鹽脅迫對植物體的傷害更加嚴(yán)重[6-7]。探究植物耐鹽堿脅迫的生理機(jī)制并篩選耐鹽堿樹種對經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)顯得格外重要。

山柿Diospyros japonica在我國東南沿海鹽土區(qū)有一定分布，主要分布于浙江、江蘇、福建、江西、安徽等省，對土壤適應(yīng)性強(qiáng)，作為經(jīng)濟(jì)林樹種在我國西北地區(qū)也有一定范圍的栽培[8]。山柿在林業(yè)生產(chǎn)上具有很大的應(yīng)用價值，常用作柿樹砧木[9]，或用作提煉柿漆的藥用植物[10]，或用作優(yōu)良的速生用材樹種。山柿樹形優(yōu)美，秋季葉色紅艷，果實橙紅，擁有很高的觀賞價值，是一種尚未大規(guī)模投入應(yīng)用的園林綠化潛力樹種。研究山柿的耐鹽堿性具有重要的生產(chǎn)意義和經(jīng)濟(jì)價值，本實驗采用Na2CO3模擬鹽堿脅迫環(huán)境，測定其各項生理生化指標(biāo)并定量分析山柿的耐鹽堿性，為山柿的推廣應(yīng)用做好前期準(zhǔn)備。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料來源于湖南省森林植物園苗圃2年生山柿地栽實生幼苗。于2019年4月27日，挑選大小相近、外表無損傷、健康的帶土球山柿實生幼苗60株，定植于同一規(guī)格（上口徑25 cm，高25 cm）的塑料花盆中，配備漏水盤。每盆基質(zhì)質(zhì)量3 kg，緩苗2個星期。培養(yǎng)基質(zhì)采用混合基質(zhì)，泥炭土∶珍珠巖∶蛭石∶園土體積比為3∶1∶1∶1。供試幼苗置于湖南省植物園溫室內(nèi)。

于苗圃中取樣并觀測實驗過程中的山柿的形態(tài)指標(biāo)，在湖南省森林植物園實驗室進(jìn)行生理生化指標(biāo)測定。

1.2 試驗方法

Na2CO3脅迫試驗開始時間為2019年5月14日，為確保試驗的準(zhǔn)確性，于2019年5月11日開始控水。將60株山柿幼苗隨機(jī)分成6組，每組10株。1組為蒸餾水處理，作為對照組（CK），其余5組分別用1 g·L-1（A1），2 g·L-1（A2），4 g·L-1（A3），6 g·L-1（A4）和8 g·L-1（A5）Na2CO3溶液以相同的方式澆灌處理，共5個濃度梯度。CK和5個脅迫處理組各10株幼苗。每盆幼苗各澆灌2 L相應(yīng)濃度的鹽溶液。在脅迫處理第8天、第16天、第24天和第32天時再次補充各處理組植株的鹽分，每株幼苗各澆灌2 L相應(yīng)濃度的Na2CO3溶液，在每次相應(yīng)濃度Na2CO3溶液處理當(dāng)日澆灌前采樣。共4個周期，每次采樣時間為8:30，隨機(jī)選取各處理組中5株幼苗進(jìn)行采樣，即每個梯度各5組重復(fù)。在樹冠外圍各個朝向均勻取樣，取其同一層面二級分枝上長勢基本一致的成熟葉片3～ 4片，迅速帶回實驗室，用封口保鮮袋置于不透光的4℃低溫箱中保存?zhèn)溆茫赃M(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

試驗期間為消除生長的邊際效應(yīng)，每15 d輪換一次盆缽擺放位置。觀測和記錄整個試驗期間溫室內(nèi)的溫度和濕度，溫室內(nèi)溫度最低17℃，最高33℃，濕度保持在60%～ 80%。

1.3 測定的指標(biāo)及方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定 因各處理周期內(nèi)山柿幼苗生長量的變化不大，因此，于脅迫0 d和脅迫32 d時，記錄所有植株的地徑和株高，用卷尺測量株高，單位為cm；用電子游標(biāo)卡尺測量植株地徑（距植株地面以上20 cm處），單位為mm。分別以脅迫32 d時的株高、地徑減去脅迫0 d時的株高、地徑，得到的差值即為整個試驗期間的株高增長量和地徑增長量。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測定 本實驗選擇了葉片相對含水量（relative water content，RWC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量、可溶性糖（soluble sugar，SS）含量、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性作為研究的生理指標(biāo)。測定RWC采用烘干稱量法[11]；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[12]；SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[13]；SS含量采用蒽酮比色法[14]；POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法[15]，以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01的酶量定義為1個活力單位(U）；SOD酶活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法[15]，以抑制氮藍(lán)四唑光化學(xué)反應(yīng)的50%為一個酶活性單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計算和整理，并用SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析以及Duncan多重比較，分析時以P＜0.05作為顯著性差異，利用Origin 8進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2CO3 脅迫對山柿株高和地徑增長量的影響

由表1表明，Na2CO3脅迫處理32 d時，以A2的株高增長量最高，顯著高于CK（P＜0.05），而A5的株高增長量則最低，顯著低于CK（P＜0.05），且A2與A5處理間也呈顯著差異（P＜0.05）。處理32 d時，A3的地徑增長量顯著高于CK處理（P＜0.05），A4的地徑增長量顯著低于CK（P＜0.05），并且A3與A4處理間也呈顯著差異（P＜0.05）。Na2CO3脅迫32 d時，株高和地徑增長量隨著脅迫濃度的上升均呈先上升后下降的趨勢。

表1 Na2CO3脅迫32 d時山柿幼苗的株高和地徑增長量Table 1 Height and ground diameter growth of D.japonica seedlings 32 days after Na2CO3 stress

2.2 Na2CO3 脅迫對山柿葉片RWC 的影響

由圖1可知，Na2CO3脅迫處理8 d時，僅A3的RWC有所下降，顯著低于CK和其他處理（P＜0.05）；脅迫16 d時，A2，A3和A4的RWC顯著高于CK（P＜0.05）；脅迫24 d時，A1和A2的RWC顯著高于CK（P＜0.05），A3，A4和A5的RWC均低于CK處理，但與CK之間均未達(dá)顯著差異水平，各處理的RWC均隨著脅迫濃度的上升呈下降趨勢。脅迫32 d時，各處理的RWC均顯著低于CK（P＜0.05），其中A1同時顯著低于其他4個濃度的脅迫處理。各處理的RWC隨著脅迫時間的增加整體呈下降趨勢。

2.3 Na2CO3 脅迫對山柿葉片MDA含量的影響

由圖2可知，Na2CO3脅迫處理8 d時，A2，A3，A4和A5的MDA含量均低于CK，其中A4和A5顯著低于CK（P＜0.05）。脅迫16 d時，各處理的MDA含量均顯著低于CK（P＜0.05）。脅迫24 d時，A1的MDA含量顯著低于CK（P＜0.05），而A2，A3，A4和A5的MDA含量則顯著高于CK（P＜0.05），各實驗組的MDA含量隨著脅迫濃度的上升均呈上升趨勢，且所有處理間均差異顯著（P＜0.05）。脅迫32 d時，所有處理的MDA含量均顯著高于CK（P＜0.05），且所有處理間的差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。隨著處理時間的增加，各處理的MDA含量整體呈上升的趨勢。

圖1 Na2CO3 脅迫不同時間對山柿葉片 RWC 的影響Figure 1 Effect of Na2CO3 stress on relative water content in D.japonica leavesD.japonica leaves

2.4 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SP含量的影響

由圖3可知，Na2CO3脅迫8 d時各處理的SP含量與CK之間均無顯著差異，但A3的SP含量高于其他各處理。脅迫16 d時，各處理的SP含量均顯著高于CK（P＜0.05），各處理間除A3與A4間差異不顯著，其他處理之間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05），且各處理的SP含量隨著脅迫濃度的上升均呈上升趨勢。脅迫24 d時，A2，A3，A4和A5的SP含量顯著高于CK（P＜0.05）；A1與CK間則無顯著性差異。脅迫32 d時，各處理的SP含量均顯著高于CK（P＜0.05），其中A4和A5的SP含量顯著高于A1，A2和A3。各處理的SP含量隨處理時間的增加總體呈上升趨勢，其中脅迫16 d時CK的SP含量明顯低于脅迫8，24和32 d時CK處理的SP含量。根據(jù)天氣記錄以及溫度記錄發(fā)現(xiàn)，脅迫16 d時棚內(nèi)氣溫為22℃左右，最低氣溫可達(dá)17℃，而脅迫8，24和32 d時氣溫均達(dá)到32～ 33℃，因此推測脅迫16 d時CK的SP含量降低可能與溫度低有關(guān)，各脅迫處理由于受到脅迫影響因而沒有CK明顯。推測這一現(xiàn)象是由于山柿葉片SP含量對溫度變化較敏感所致。

圖2 Na2CO3 脅迫對山柿葉片MDA含量的影響Figure 2 Effect of Na2CO3 stress on the content of MDA in D.japonica leaves

圖3 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SP含量的影響Figure 3 Effect of Na2CO3 stress on the content of SP in D.japonica leaves

2.5 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SS含量的影響

由圖4可知，Na2CO3脅迫8 d時，A3和A4的SS含量顯著高于CK（P＜0.05），A5則顯著低于CK（P＜0.05）。脅迫16 d時，各處理的SS含量均顯著高于CK（P＜0.05），其中A4的SS含量上升幅度最大。脅迫24 d時，A1的SS含量顯著低于CK（P＜0.05）；A2，A3，A4和A5的SS含量均顯著高于CK（P＜0.05）。脅迫32 d時，各處理的SS含量均顯著高于CK（P＜0.05）。各處理的SS含量隨著處理時間的增加大致呈先上升后下降的趨勢。

2.6 Na2CO3 脅迫對山柿葉片POD酶活性的影響

由圖5可知，Na2CO3脅迫8 d時，A1的POD酶活性顯著高于CK和其他脅迫處理（P＜0.05），除A1外，其他處理間差異均不顯著。脅迫16 d時，A2，A3，A4和A5的POD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），其中以A3的上升幅度最大，各脅迫處理的POD酶活性隨著脅迫濃度的上升呈先上升后下降的趨勢。脅迫24 d時，A4和A5的POD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），但兩者間沒有顯著差異；A1，A2和A3則與CK間沒有顯著性差異。脅迫32 d時，A4的POD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），其他處理則與CK間沒有顯著性差異。各處理的POD酶活性隨處理時間的增加大致呈先上升后下降的趨勢。

2.7 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SOD酶活性的影響

由圖6可知，Na2CO3脅迫8 d時，A1和A2的SOD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），而A3，A4和A5的SOD酶活性則顯著低于CK（P＜0.05）。Na2CO3脅迫16 d時，A1和A2的SOD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），A3，A4和A5的SOD酶活性顯著低于CK。脅迫24 d時，A2，A4和A5的SOD酶活性顯著高于CK（P＜0.05），其中A4和A5的SOD酶活性顯著高于A2（P＜0.05）。脅迫32 d時，A3和A4的SOD酶活性顯著高于CK，A1，A2和A5的SOD酶活性則與CK間無顯著性差異。

圖4 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SS含量的影響Figure 4 Effect of Na2CO3 stress on the content of SS in D.japonica leaves

圖5 Na2CO3 脅迫對山柿葉片POD酶活性的影響Figure 5 Effect of Na2CO3 stress on the activity of POD in D.japonica leaves

圖6 Na2CO3 脅迫對山柿葉片SOD酶活性的影響Figure 6 Effect of Na2CO3 stress on the activity of SOD in D.japonica leaves

2.8 Na2CO3 脅迫對山柿生長表型的影響

實驗觀測發(fā)現(xiàn)，山柿在為期32 d的1～ 8 g·L-1Na2CO3脅迫下，在表型上沒有受到明顯的影響。脅迫32 d時，A4處理10株幼苗中有1株葉片脫落情況較明顯，幾乎全部脫落；A510株幼苗中有2株葉片幾乎全部脫落，但均不能認(rèn)定為徹底死亡。A1，A2和A3的葉片有一定程度的卷曲、發(fā)黃和脫落現(xiàn)象，但沒有很嚴(yán)重的大面積枯黃萎蔫，亦沒有很嚴(yán)重的脫落。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

鹽堿脅迫對植物的正常生長發(fā)育最明顯也是最直觀的效應(yīng)就是抑制生長，其正常生長速率會受到一定影響，通常情況下表現(xiàn)為植株矮小、生長緩慢、產(chǎn)量降低等[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有Na2CO3脅迫處理的山柿株高、地徑均有所增長，但隨著Na2CO3濃度的上升其增長量也受到一定抑制。2 g·L-1Na2CO3脅迫對山柿的株高增長量有一定的促進(jìn)作用，而8 g·L-1Na2CO3脅迫則對山柿植株造成了較大的傷害，抑制其株高生長速率。4 g·L-1Na2CO3脅迫對山柿地徑的生長速率有一定的促進(jìn)作用，但6 g·L-1Na2CO3脅迫對其地徑生長速率則有抑制作用。本實驗結(jié)果與梁芳[17]等對玉蕊Barringtonia racemosa鹽脅迫下株高和地徑的變化測定結(jié)果基本一致。綜合分析可發(fā)現(xiàn)，在為期32 d的Na2CO3脅迫下，各濃度處理下的山柿植株在生長指標(biāo)上表現(xiàn)為具有一定的抗鹽性，但較高濃度下（6～ 8 g·L-1）其生長速率仍會受到一定的抑制。

相對含水量是植物組織實際含水量占其飽和含水量的百分比，是表示植物組織水分狀況的一個常用指標(biāo)[18]。一般來說，植物相對含水量變化越大，其耐鹽堿性相對越弱[19]。Na2CO3脅迫24 d時，1～ 2 g·L-1脅迫處理的山柿葉片吸水能力有所上升；但4～ 8 g·L-1Na2CO3脅迫導(dǎo)致山柿細(xì)胞失水嚴(yán)重，其相對含水量顯著下降。脅迫32 d時，各脅迫處理葉片均失水嚴(yán)重。較低濃度脅迫下植物體受到的傷害較小，相對含水量變化不大；而隨著脅迫時間的延長和脅迫濃度的上升，各脅迫處理的葉片吸水保水能力整體有所下降，遭受較嚴(yán)重的生理干旱，這與楊慶山[20]等對堿脅迫下檉柳Tamarix chinensis葉片相對含水量變化的分析結(jié)果基本吻合。

植物體內(nèi)的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等，它們主要通過清除體內(nèi)的活性氧來保護(hù)植物體，其活性往往能夠反應(yīng)植物體的代謝和抗逆性的變化。通常情況下，保護(hù)酶的活性越高，植物對逆境脅迫的適應(yīng)能力越強(qiáng)。本實驗結(jié)果顯示，Na2CO3脅迫16 d時山柿能夠一定程度上提升POD酶活性；脅迫24 d時，6 g·L-1和8 g·L-1處理組POD酶活性有顯著提升，脅迫32 d時則只有6 g·L-1處理組的POD酶活性顯著升高以減輕氧化損傷，這與李瑩瑩[21]等對猴樟Cinnamomum bodinieri幼苗在鹽堿脅迫下POD酶活性的研究結(jié)果基本一致。這說明在長期脅迫處理下，山柿能夠在一定程度上提升POD酶活性以減輕脅迫對植物細(xì)胞帶來的傷害。Na2CO3脅迫24 d時山柿能夠提升SOD酶活性抵抗細(xì)胞毒害；脅迫32 d時2～ 6 g·L-1脅迫組仍具有較高的抗氧化能力，但8 g·L-1處理組受到的傷害較大因而這種調(diào)節(jié)能力不明顯，該實驗結(jié)果與董靜[22]等對鹽堿脅迫下馬齒莧Portula caoleracea幼苗的SOD酶活性研究結(jié)果有相似之處。山柿POD酶和SOD酶活性能夠共同上升以對抗氧化損傷。

MDA是一種膜脂過氧化產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒害性，能夠破壞植物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、核酸等有機(jī)分子，對細(xì)胞膜產(chǎn)生很大的損傷。其含量高低一定程度上能夠反映細(xì)胞膜脂受傷害的程度[23-24]。本實驗結(jié)果顯示，Na2CO3脅迫8～ 16 d時山柿葉片細(xì)胞受到的膜脂過氧化傷害較輕，甚至存在含量有所下降的現(xiàn)象，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能與抗氧化酶活性有關(guān)。結(jié)合抗氧化酶的活性進(jìn)行分析，在脅迫16 d時各脅迫處理的POD酶活性顯著上升，其MDA含量的下降可能與該現(xiàn)象有一定的關(guān)聯(lián)；而脅迫24～ 32 d時，葉片中的MDA含量隨著濃度的上升明顯增加，葉片受到的毒害作用也就越嚴(yán)重，該現(xiàn)象與景宇鵬[25]等對玉蜀黍Zea mays在Na2CO3脅迫下MDA含量的變化的測定結(jié)果基本吻合。

有一定耐鹽堿能力的植物，通?？梢酝ㄟ^自我調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境來對抗鹽堿脅迫引起的滲透脅迫與離子毒害[26]，例如通過積累無機(jī)離子、合成有機(jī)小分子物質(zhì)來維持自身細(xì)胞滲透勢，從而保證正常的生命活動[27]。整個Na2CO3脅迫試驗期間山柿的SP含量大致呈上升趨勢。在32 d的Na2CO3脅迫下，山柿能夠大量積累SP以維持自身滲透壓，且隨著脅迫時間的延長和脅迫濃度的上升明顯上升，尤其是脅迫32 d時，各實驗組的SP含量上升幅度非常大，該結(jié)果與王志強(qiáng)[28]等對鹽堿脅迫下酸棗Ziziphus jujuba幼苗葉片中SP含量的測定結(jié)果基本一致。整個實驗期間各處理組的SS含量均有一定程度的上升以維持細(xì)胞膨壓，且在脅迫24 d時總體積累的量最多，6 g·L-1脅迫組上升的幅度總是比較高。這與李雅男[29]等對‘索邦’百合‘Sorbonne’在堿性鹽脅迫下SS含量的研究結(jié)果有相似之處。該實驗結(jié)果表明，在SS這項指標(biāo)的表現(xiàn)上，6 g·L-1的脅迫處理組適應(yīng)能力最強(qiáng)，其SS積累的量總是最高的，能夠較好地維持細(xì)胞滲透壓。在Na2CO3脅迫下山柿能夠大量積累SP和SS以維持自身滲透壓，滲透調(diào)節(jié)是山柿抵抗Na2CO3脅迫的重要方式之一。

3.2 結(jié)論

較高濃度（6 g·L-1和8 g·L-1）Na2CO3脅迫對山柿株高和地徑的生長速率有一定的抑制作用，而較低濃度（2 g·L-1和4 g·L-1）脅迫則有一定的促進(jìn)作用。在短期脅迫（脅迫0～ 24 d時）下，葉片失水情況較輕，在長期脅迫（脅迫32 d時）下，各脅迫處理的葉片失水嚴(yán)重；脅迫24～ 32 d時，山柿葉片細(xì)胞積累大量MDA，細(xì)胞受到較嚴(yán)重的氧化損傷，POD酶和SOD酶活性都有明顯上升以清除過量活性氧，對抗脅迫環(huán)境；各脅迫處理的山柿均能夠大量積累SS和SP以維持自身細(xì)胞滲透勢。本研究結(jié)果表明，山柿對1～ 4 g·L-1的Na2CO3脅迫具有一定的適應(yīng)性并促進(jìn)其生長，在6 g·L-1和8 g·L-1Na2CO3脅迫下，雖依然具備一定的自我調(diào)節(jié)能力，能夠調(diào)整各項生理指標(biāo)以應(yīng)對脅迫環(huán)境，但仍會受到一定程度的破壞與損傷。經(jīng)過脅迫試驗發(fā)現(xiàn)，山柿能夠耐受1～ 8 g·L-1Na2CO3脅迫而未出現(xiàn)死亡，這說明山柿對堿性鹽脅迫忍耐程度較強(qiáng)，較適宜在我國東南沿海鹽堿地面積較大的區(qū)域種植。山柿的自然生長環(huán)境以山地為主，我國東南沿海鹽堿地多為圍墾后形成的地勢平坦區(qū)域，多伴有積水、板結(jié)等問題，故在推廣應(yīng)用中應(yīng)該首選海島地區(qū)。而向溫度、水分條件較差的北方區(qū)域推廣時，需結(jié)合抗旱性和抗寒性等方面的研究結(jié)果綜合考慮。由于目前有關(guān)山柿其他抗性定量研究的缺失，因此有關(guān)其耐旱性、耐寒性、耐高溫、耐水濕和抗重金屬脅迫等方面的定量研究還有待進(jìn)一步進(jìn)行。