盧培利，王學文，丁阿強，李微薇，熊敏，張代鈞

（1 煤礦災(zāi)害動力學與控制國家重點實驗室，重慶400044；2 重慶大學環(huán)境科學系，重慶400044）

硝態(tài)氮/亞硝態(tài)型厭氧甲烷氧化（NO-3/NO-2-dependent anaerobic methane oxidation，NOx-DAMO）是在厭氧條件下，微生物以硝酸鹽（nitrate-dependent anaerobic methane oxidation，NO-3-DAMO）或亞硝酸鹽（nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，-DAMO）為電子受體，甲烷為電子供體的生物反應(yīng)過程。驅(qū)動NOx-DAMO 的微生物包括細菌和古菌。NOx-DAMO 古菌通過反向產(chǎn)甲烷過程將甲烷轉(zhuǎn)化為二氧化碳，同時將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，其模式種屬為Candidatus Methanoperedens nitroreducens；NOx-DAMO 細菌通過內(nèi)產(chǎn)氧途徑將甲烷轉(zhuǎn)化為二氧化碳，同時將亞硝酸鹽還原為氮氣，其模式種屬為Candidatus Methylomirabilis oxyfera。NOx-DAMO 微生物在自然和人工生境中的廣泛分布暗示了NOx-DAMO 過程在全球碳氮循環(huán)中的重要作用。

NOx-DAMO 過程可以利用甲烷作為電子受體替代傳統(tǒng)廢水處理投加的有機物，降低處理成本，同時，經(jīng)NO歧化為N2，躍過了N2O產(chǎn)生過程，減少溫室氣體排放。因此，利用硝態(tài)氮型厭氧甲烷氧化過程脫氮協(xié)同去除廢水中氮素與散逸的甲烷或?qū)⒋鎮(zhèn)鹘y(tǒng)廢水處理成為一種新工藝。盡管微生物富集困難、環(huán)境敏感和反應(yīng)速度慢等對其應(yīng)用潛力有限制，但基于NOx-DAMO原理，面向低C/N比廢水，開發(fā)以甲烷替代外碳源的廢水脫氮技術(shù)以及面向消化液中甲烷厭氧氧化的溫室氣體減排技術(shù)等嘗試一直在進行。隨著對NOx-DAMO 微生物生理生化特性認識的加深以及對NOx-DAMO 工藝影響因子的優(yōu)化，研究者逐步開發(fā)了可有效提升氮轉(zhuǎn)化和甲烷氧化速率的膜生物膜反應(yīng)器（MBfR）、膜生物反應(yīng)器（MBR）和顆?；钚蕴康确磻?yīng)器與強化技術(shù)。目前NOx-DAMO 與厭氧氨氧化耦合工藝的脫氮負荷已達到了1kg/(m3·d)[1]，展示了工程應(yīng)用潛力。

本文聚焦于NOx-DAMO 的工程應(yīng)用這一技術(shù)視角，在概述NOx-DAMO 過程微生物及其代謝機制、環(huán)境分布和影響因素的基礎(chǔ)上，重點對NOx-DAMO 應(yīng)用的研究進展進行總結(jié)，包括反應(yīng)器類型、處理對象、運行參數(shù)和反應(yīng)速率等；最后，從溫室氣體減排角度出發(fā)，提出了將NOx-DAMO 作為生活垃圾填埋與煤層氣開采所產(chǎn)生的不具有應(yīng)用價值的甲烷的處理技術(shù)，以期拓寬NOx-DAMO 應(yīng)用范圍，推動基于NOx-DAMO的應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)。

1 NOx-DAMO過程的微生物學進展

1.1 NOx-DAMO過程的微生物及其機制

NOx-DAMO 過程是微生物將硝酸鹽/亞硝酸鹽與甲烷轉(zhuǎn)化為氮氣與二氧化碳的過程。2004 年Lslas-Lima 等[2]發(fā)現(xiàn)了NOx-DAMO 現(xiàn)象，但其功能微生物并不清楚。2006年Raghoebarsing 等[3]成功富集了NOx-DAMO 微生物，并推測古菌與細菌的協(xié)同作用。 2010 年NOx-DAMO 細菌被命名為Candidatus Methylomirabilis oxyfera[4]。隨后Haroon等[5]確定了NOx-DAMO 古菌歸屬于ANME-2d，并命名為Candidatus Methanoperedens nitroreducens。目前發(fā)現(xiàn)的NOx-DAMO 細菌有Candidatus Methylomirabilis 屬的Candidatus Methylomirabilis oxyfera、 Candidatus Methylomirabilis sinica[6]和Candidatus Methylomirabilis limnetica[7]3 種，古菌只有Candidatus Methanoperedens nitroreducens。NOx-DAMO過程的發(fā)現(xiàn)發(fā)展過程如圖1所示。

古菌M.nitroreducen 以甲烷為電子供體將硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮，細菌M.oxyfera以甲烷為電子供體將亞硝態(tài)氮還原為氮氣，分別如式(1)和式(2)所示。

細菌M.oxyfera 具有特殊的內(nèi)產(chǎn)氧途徑，首先NO-2在亞硝酸鹽還原酶作用下被還原為NO，之后NO在一種假定的NO歧化酶（nitric oxide dismutase，NOD）作用下被歧化為N2和O2，但截至目前NOD仍未被證實。Ettwig 等[8]提出可能有兩種與對苯二酚基一氧化氮還原酶同源的酶能將NO歧化為N2和O2，且此歧化過程是高放能過程。細菌M.oxyfera擁有完整的好氧甲烷氧化途徑編碼基因。利用內(nèi)產(chǎn)氧過程產(chǎn)生的氧氣，M.oxyfera首先通過顆粒狀甲烷單加氧酶（particulate methane monooxygenase，pMMO）催化甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇，然后在3種PQQ型甲醇脫氫酶（PQQ-dependent methanol dehydrogenases，MDH）的作用下將甲醇氧化為甲醛；繼而，甲醛可經(jīng)高表達的H4MPT途徑或者低表達的H4F途徑羧化生成甲酸[9]；最后，3種酶[一種高表達的formyl-MFR脫氫酶和兩種低表達的NAD(P)+依賴型甲酸脫氫酶]將甲酸氧化為CO2。

1.2 NOx-DAMO微生物的生境分布

NOx-DAMO微生物分布生境如表1所示。大多NOx-DAMO微生物存在于淡水環(huán)境中，如水稻土[16-17]、淡水河道底泥[16]、濕地[18]和泥炭地[19]等。各類含鹽環(huán)境中也檢測到NOx-DAMO 微生物的存在，如河口底泥[20]、海濱濕地[21]和海底沉積物[22]等，也有研究發(fā)現(xiàn)污水處理廠污泥中也存在NOx-DAMO微生物[23-24]。

1.3 NOx-DAMO微生物生長代謝影響因素

目前已經(jīng)研究的影響NOx-DAMO 微生物生長代謝的因素包括環(huán)境溫度、pH、溶解氧、營養(yǎng)條件、反應(yīng)器構(gòu)型、水力停留時間（HRT）、污泥停留時間（SRT）等。普遍認為pH為7.5、溫度為35℃是NOx-DAMO 微生物的最適條件[34-35]。NOx-DAMO 微生物嚴格厭氧，外加體積分數(shù)5%的氧氣會使NOx-DAMO 古菌M.nitroreducens 中參與甲烷氧化與硝酸鹽還原的關(guān)鍵酶功能基因受到抑制[36]。甲烷的低溶解度可能是NOx-DAMO 過程重要的限制因素。實驗發(fā)現(xiàn)隨著甲烷分壓從0 增長到49kPa 繼而到98kPa，NOx-DAMO 反應(yīng)器的反硝化速率先快速增加后增速減緩[34]；氣體提升方式可在豎直方向上增強混合，提高反應(yīng)器甲烷的傳質(zhì)效果進而強化NOx-DAMO 過程[37]。礦物元素也對NO-2-DAMO 的反應(yīng)速率有影響，亞硝氮與甲烷轉(zhuǎn)化速率隨Fe2+、Cu2+濃度增加而提高，在20μmol/LFe2+和10μmol/L Cu2+時達到最大，Cu2+濃度過大會抑制微生物活動，而Zn、Mo、Co、Mn、Ni（濃度均低于2μmol/L時）等對微生物生長活動幾乎沒有影響；在長期培養(yǎng)條件下，F(xiàn)e2+較Cu2+能更明顯提高轉(zhuǎn)化速率，且Fe2+、Cu2+共同作用效果優(yōu)于兩者單獨作用[38]。

2 基于NOx-DAMO處理廢水的工藝

已經(jīng)有研究將NOx-DAMO 單獨或與其他工藝聯(lián)合應(yīng)用于城市污水、污水厭氧消化液和地下水的處理。為了克服序批式活性污泥法（SBR）反應(yīng)器生物流失問題，具有更好的生物持留能力的MBR、MBfR 和封閉式下向流海綿反應(yīng)器得到了應(yīng)用，NOx-DAMO 的脫氮速率得到顯著提升。相關(guān)工藝研究總結(jié)如表2所示。

表1 各類生境硝態(tài)氮型厭氧甲烷氧化微生物分布

圖2 短程硝化-厭氧氨氧化耦合DAMO反應(yīng)器生物膜中AOB、厭氧氨氧化菌、DAMO古菌和DAMO細菌生化反應(yīng)概念圖［43］

由于NOx-DAMO 可以耦合硝酸鹽/亞硝酸鹽還原與甲烷的氧化，故與其他工藝之間的耦合在環(huán)境領(lǐng)域也是研究熱點。2010年，Zhu等[48]提出了NOx-DAMO與厭氧氨氧化（ANAMMOX）工藝耦合，獲得很好的處理效果。Chen等[45]的研究表明，將短程硝化-厭氧氨氧化（nitritation-Anammox）與NOx-DAMO 過程在MBfR 工藝中耦合能去除厭氧消化液中的甲烷，在HRT 為4～8 天、氧氣表面負荷為1～2g/(m2d)范圍調(diào)整時，最大可獲得分別為96%和98%的總氮和溶解甲烷去除率。反應(yīng)器中生物膜的分析表明，氨氧化菌生長于膜上靠近膜一側(cè)，而厭氧氨氧化與NOx-DAMO 微生物共同生長在靠近液相一側(cè)（見圖2）。Cai等[46]長期運試ANAMMOXDAMO耦合反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)在運行453天后硝酸鹽去除速率可達(684±10)mg/(L·d)（以氮計，下同），已與工程所要求的脫氮速率基本相當。Xie 等[47]利用MBfR耦合ANAMMOX 與NOx-DAMO過程，將HRT從12h 縮短到4h 時，總氮去除速率由90mg/(m3·d)增加到280mg/(m3·d)。物料平衡分析得出厭氧氨氧化產(chǎn)生的硝酸鹽有30%～60%被NOx-DAMO 微生物轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，厭氧氨氧化和NOx-DAMO 過程對亞硝酸鹽的去除各占90%與10%。在HRT為2天的情況下，耦合工藝脫氮速率高達1kg/(L·d)，不過此過程受亞硝酸鹽和氨氮的比例影響較大[39]。日本學者Hatamoto等[42]利用封閉式下流懸掛海綿反應(yīng)器，在1.25L的柱狀反應(yīng)器內(nèi)懸掛海綿立方體，得到84.4g/(m3·d)的脫氮速率，甲烷去除效果能達到(3.3±0.9)mmol/(L·d)。

不斷有學者為將NOx-DAMO 過程應(yīng)用于實際廢水處理而開展探索。Wang 等[49]提出兩種工藝：一種是將NOx-DAMO-ANAMMOX 耦合過程作為側(cè)流工藝，利用厭氧消化產(chǎn)生的甲烷去除厭氧消化液中高濃度（1000～1500mg/L）氨氮，從而提高污水處理廠脫氮效率；另外一種是將NOx-DAMO-ANAMMOX耦合過程用作后處理單元或核心處理單元，利用厭氧消化產(chǎn)生的甲烷去除活性污泥過程出水中的硝酸鹽和氨氮，而無需外加電子供體，提高出水質(zhì)量的同時節(jié)省成本。Liu 等[50]提出將活性污泥、部分亞硝化（partial nitritation）、厭氧氨氧化和NOx-DAMO耦合與污泥厭氧消化等連接成整套工藝用于城市廢水處理，活性污泥段去除有機物，部分亞硝化與ANAMMOX-DAMO 耦合段用于完全脫氮，從而達到有機物去除、深度脫氮的目的，并估算得到此工藝流程凈產(chǎn)生能量274TJ/a（圖3）。

UASB 出水含有氨氮和甲烷，厭氧消化液中含有甲烷，Kampman等[43]據(jù)此建立了如圖4所示的工藝系統(tǒng)，利用亞硝化反應(yīng)池將廢水中的氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮回流到NOx-DAMO 反應(yīng)器中作為甲烷厭氧氧化的電子受體，通過NO-2-DAMO 與亞硝化耦合對UASB 后的低溫（10～20℃）出水和厭氧消化液中氨氮與甲烷進行深度處理，最大脫氮速率可以達到33.5～37.8mgNO-3-N/(L·d)。Silva-Teira 等[44]同樣利用NOx-DAMO 過程處理UASB 的低溫（17～23℃）出水，通過調(diào)節(jié)回流比得到最大脫氮速率為150mg/(L·d)，甲烷去除速率為180mg/(L·d)，甲烷去除效率高達95%。Luo 等[51]利用MBfR 接種NOx-DAMO微生物處理地下水，獲得了45mg/(L·d)的脫氮速率，NOx-DAMO細菌是其主要功能微生物。

表2 當前主要的NOx-DAMO工藝研究匯總

圖3 新型城市污水處理系統(tǒng)概念圖［50］（處理量5×105m3/d）

圖4 UASB協(xié)同NOx-DAMO處理低溫廢水工藝流程圖［43］

3 基于NOx-DAMO 處理填埋氣和煤層氣的探討

3.1 必要性

溫室效應(yīng)是當前全球面臨的重要環(huán)境問題，甲烷是重要的溫室氣體，其溫室效應(yīng)是等摩爾CO2的20～30倍[52]。研究表明，近十年來，甲烷導(dǎo)致溫室效應(yīng)不斷增加，特別是從2006 年到2012 年，晴空輻射（clear sky radiation）每年達到(0.026±0.006)(99.7%CI)W/m2[53]。甲烷是能源氣體，但許多情況下由于其含量少、難分離等原因并未得到應(yīng)用，而排放到大氣中。例如在垃圾填埋場中，有機物腐化產(chǎn)生的甲烷無組織排放到大氣中。中國現(xiàn)有垃圾填埋場1955 個，預(yù)計到2030 年會新增495 個，若不采取控制措施，估計到2030年將釋放180萬噸的甲烷[54]。美國的2450 個垃圾填埋場中1070 個的填埋氣平均甲烷含量47.1%[55]。同樣，在煤炭開采過程中，出于安全需要對煤層氣進行抽采，民用煤層氣是CH4體積分數(shù)為35%～40%的高濃度煤層氣，我國煤層氣利用率不足20%，甲烷含量小于30%的煤層氣幾乎得不到利用，根據(jù)利用量估計，每年排空量幾百億立方米[56]，甲烷散逸問題亟待解決。

與此同時，傳統(tǒng)廢水處理產(chǎn)生大量N2O。N2O也是一種重要的強溫室氣體，其全球增溫潛勢為CO2的200～300 倍[57]。王亞宜等[58]根據(jù)當前污水處理工藝N2O 排放情況，估算2011 年我國城市污水處理系統(tǒng)N2O釋放總量約1.26×109g。根據(jù)目前的認識，NOx-DAMO 過程中NO通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為N2和O2，躍過了N2O產(chǎn)生過程，利用此過程進行廢水脫氮，能減少溫室氣體的排放。

3.2 NOx-DAMO過程應(yīng)用于填埋氣處理

城市生活垃圾具有含水率高、有機物含量高等特點，其中的可降解有機物在填埋場下部的厭氧環(huán)境中可轉(zhuǎn)化為甲烷，甲烷不斷從底部向上轉(zhuǎn)移，最終釋放到空氣中。將NOx-DAMO 微生物以生物覆土層的形式引入到垃圾填埋場中，再將滲濾液中氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮回灌到填埋場的方式，可以實現(xiàn)NOx-DAMO 過程的發(fā)生，利于填埋場甲烷減排與脫氮。

礦化垃圾中微生物種類豐富，有進行厭氧甲烷氧化的潛力。劉妍妍等[59]的研究結(jié)果表明，填埋礦化垃圾中能發(fā)生兼/厭氧甲烷氧化反硝化的耦合作用，兼/厭氧條件下，在礦化垃圾中添加能促進CH4的去除；CH4體積分數(shù)為40%時，其去除量達到最大值。王旭[60]研究了填埋體中3種類型的甲烷厭氧氧化過程，發(fā)現(xiàn)在添加電子受體的填埋體中硝態(tài)氮型厭氧甲烷氧化過程（-DAMO）甲烷的降解率比硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化過程（S-DAMO）和鐵還原型甲烷厭氧氧化過程（Fe-DAMO）甲烷的降解率高。垃圾滲濾液中有機物和氨氮濃度高，研究表明滲濾液的好氧處理（例如利用MBR工藝）可以去除90%的有機物[61]，可先經(jīng)好氧過程去除有機物同時將氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，可避免有機物和高濃度氨氮的影響，將礦化垃圾作為填埋覆土層，預(yù)處理后的滲濾液回灌到覆土層，NOx-DAMO微生物以此為載體，同時去除填埋體釋放的甲烷與滲濾液中氮素。

3.3 NOx-DAMO過程應(yīng)用于煤層氣處理

煤層氣開采過程中，由于煤層透氣性差、抽采率、抽采濃度低及煤層氣利用技術(shù)和途徑單一等，部分煤層氣并沒有得到有效利用，透氣性差的煤層地面開采相對困難，利用井下瓦斯抽放系統(tǒng)進行開采，一般在含瓦斯不多的煤礦，煤礦礦井中涌出的瓦斯會被通風系統(tǒng)直接排放到大氣中，以實現(xiàn)防止爆炸、窒息事故實現(xiàn)安全采煤的目標。毛飛[62]通過注液工藝將32.1t 的好氧甲烷氧化菌培養(yǎng)液泵入煤層中，結(jié)果表明甲烷氧化菌能夠不同程度地降低兩個實驗地點的瓦斯動力現(xiàn)象、回風瓦斯?jié)舛?、噸煤瓦斯含量、煤層瓦斯壓力和鉆屑瓦斯解析指標K1值（煤樣從煤體中剝落后1min 內(nèi)的瓦斯解吸量）；其地面試驗和井下現(xiàn)場試驗表明注入微生物培養(yǎng)液能降低瓦斯壓力，證明利用微生物方法處理煤層瓦斯具有可行性。但是，氧氣導(dǎo)致的甲烷爆炸風險限制了該技術(shù)的應(yīng)用。當前煤層氣開采用增產(chǎn)技術(shù)中有水力壓裂技術(shù)和高壓水射流技術(shù)等，可在高壓水射流技術(shù)中引入NOx-DAMO 微生物與基質(zhì)，通過簡單的手段、低廉的成本安全地處理甲烷提高礦井安全系數(shù)。根據(jù)亨利定律，在標準大氣壓、27℃條件下甲烷含量為30%的煤層氣，通入液相其溶解甲烷濃度約為6mg/L，根據(jù)NOx-DAMO微生物反應(yīng)動力學，NOx-DAMO 微生物的甲烷親和力常數(shù)為1.33～1.92mg/L[63-65]，故在硝酸鹽存在條件下，NOx-DAMO微生物可厭氧氧化甲烷將其去除。

4 結(jié)語

硝態(tài)氮型厭氧甲烷氧化耦合了甲烷氧化和硝態(tài)氮還原，且該微生物在各類生境中分布廣泛，其應(yīng)用于環(huán)境中甲烷和氮素污染控制具有潛在價值。目前，在MBR、MBfR等反應(yīng)器中應(yīng)用NOx-DAMO單獨或與其他工藝聯(lián)合處理模擬廢水和實際厭氧消化液的實驗取得了明顯進展，污染物去除速率和效率顯示出了工程應(yīng)用潛力，為廢水生物脫氮碳源不足問題提供了可行的技術(shù)途徑，同時也一定程度緩解了溫室氣體排放問題。無規(guī)模利用價值的生活垃圾填埋氣和煤層氣的排放急需低成本和環(huán)境友好的解決方案，基于NOx-DAMO 原理開發(fā)垃圾滲濾液和填埋氣協(xié)同處理工藝、煤層氣厭氧生物氧化工藝值得探索，如將NOx-DAMO 微生物負載到垃圾填埋覆土中，以減少無法收集利用的甲烷釋放；或利用注液技術(shù)注入NOx-DAMO 微生物菌液處理煤層瓦斯。NOx-DAMO 微生物較慢的生長速率與反應(yīng)速率是限制NOx-DAMO 工藝實際應(yīng)用的關(guān)鍵，如何快速富集NOx-DAMO 微生物仍是今后的一個關(guān)鍵問題。從微生物角度而言，NOx-DAMO 微生物的關(guān)鍵酶NOD 目前尚未獲得分離，NOD 的生理生化特性尚不明確。完全解析NOx-DAMO 微生物的生化反應(yīng)過程，進而為NOx-DAMO 微生物的富集與NOx-DAMO 工藝的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)，最終指導(dǎo)NOx-DAMO 過程的實際工程應(yīng)用是今后的整體思路與方向。