張毅，姜迎雪，張昊

（天津工業(yè)大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院，天津300387）

兔毛織物柔軟舒適，與羊毛織物相比不遑多讓，近年在市場(chǎng)逐步推廣。兔毛織物產(chǎn)品加工幾乎沒有前處理，使得兔毛本身攜帶微生物及少量油脂；并且兔毛纖維鱗片層的排列與其本身為蛋白質(zhì)纖維，為微生物的生長(zhǎng)提供了有利條件，微生物生長(zhǎng)繁殖使織物遭到損壞甚至危害人體健康，因此對(duì)兔毛織物進(jìn)行抗菌整理具有重要意義。

殼聚糖是自然界中唯一帶有氨基的生物高分子，殼聚糖溶解后的溶液中的氨基一般容易帶上正電荷，通過與細(xì)菌細(xì)胞膜表面的負(fù)電子結(jié)合，改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性可以起到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。這種天然生物高分子由于所具有的生物官能團(tuán)性和相容性、安全性、微生物降解等優(yōu)良性能，目前已被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，尤其在紡織領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-8]。殼聚糖上裸露的氨基和羥基使殼聚糖具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，如果不對(duì)氨基加以保護(hù)就會(huì)導(dǎo)致氨基被取代。Wan 等[9]用苯甲醛與殼聚糖的活性氨基反應(yīng)，將殼聚糖的氨基進(jìn)行保護(hù)，制備得到N-苯亞甲基殼聚糖，再將其與2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨反應(yīng)得到中間體，然后進(jìn)行水解，最終得到O-取代季銨化殼聚糖，但用醛類交聯(lián)劑往往具有毒性，在使用過程中對(duì)環(huán)境有一定的污染，且脫保護(hù)的過程一般采用酸，可能導(dǎo)致殼聚糖分子量下降，影響抑菌性[10-11]?；诖吮疚牟捎眉讱に厣系牧u基與季銨化的化合物反應(yīng)，再通過脫乙酰將活性氨基暴露，對(duì)反應(yīng)位置有選擇地進(jìn)行改性，既在羥基上引入季銨基團(tuán)，又保留C2上的氨基，最大程度上提高抑菌性能。季銨鹽類抗菌高分子均屬于陽(yáng)離子型抗菌高分子，Kawabata等[12]研究認(rèn)為陽(yáng)離子殺菌劑的機(jī)理為：殺菌劑依靠靜電作用，吸附到細(xì)菌帶負(fù)電性的細(xì)胞膜，并且小分子的陽(yáng)離子殺菌劑甚至通過細(xì)胞膜細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞質(zhì)相結(jié)合使其破裂，造成細(xì)菌釋放出細(xì)胞的內(nèi)容物，從而達(dá)到抑菌的目的。

值得一提的是，在現(xiàn)有的研究中大多采用三甲胺基季銨鹽作為抑菌劑[13-14]，而三乙基季銨鹽應(yīng)用于織物抑菌整理的研究較少，三乙基由于推電子效應(yīng)使N原子上的正電荷更加穩(wěn)定，理論上較三甲胺基季銨鹽有更強(qiáng)的陽(yáng)離子性和抑菌性?；诖艘匀野泛铜h(huán)氧氯丙烷為原料，經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成3-氯-2-羥丙基三乙基氯化銨（CHPTAC-乙基）對(duì)甲殼素進(jìn)行改性，然后經(jīng)脫乙酰得到季銨化O-取代改性殼聚糖。本文研究了季銨型陽(yáng)離子改性殼聚糖（CCTS）的抗菌活性，并將其應(yīng)用于兔毛織物的抗菌整理。測(cè)試了整理前后兔毛織物的抗菌活性，探討CCTS 在兔毛織物抗菌整理中的可行性和前景，為兔毛織物功能開發(fā)提供理論依據(jù)，對(duì)兔毛織物的推廣有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：甲殼素，上海麥克林生化科技有限公司；三乙胺、鹽酸、無(wú)水乙醇，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；環(huán)氧氯丙烷、四氯化碳、氫氧化鈉、次磷酸鈉、檸檬酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。用于研究的所有化學(xué)試劑，均為分析級(jí)。

儀器：IS50 型紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet 儀器公司；Varian Infinityplus 300 MHz 核磁頻譜儀，美國(guó)Varian公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 季銨型陽(yáng)離子改性殼聚糖（CCTS）的合成

醚化劑的合成：在裝有電動(dòng)攪拌、滴液漏斗和溫度計(jì)的三口燒瓶中加入30mL 濃鹽酸（36.5%），稱取等摩爾質(zhì)量的三乙基胺于滴液漏斗中，緩慢滴加。燒瓶置于30℃水浴，待反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)pH=8，水浴溫度設(shè)為35℃，緩慢滴加環(huán)氧氯丙烷（環(huán)氧氯丙烷∶三乙胺=0.9mol∶1mol）反應(yīng)4h。用四氯化碳萃取兩次，加水旋蒸得到黏稠狀液體CHPTAC-乙基。

季銨型甲殼素（CCT）的制備：在三口燒瓶中放入一定量的甲殼素、蒸餾水、NaOH，并不斷攪拌，使pH=13，水浴溫度控制在45℃，緩慢滴加CHPTAC-乙基（甲殼素∶CHPTAC-乙基=1mol∶0.6mol），反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后用25%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=8，將三口燒瓶中的產(chǎn)物倒入燒杯中冷卻至室溫，向燒杯中加入等體積的無(wú)水乙醇并不斷攪拌，靜置沉淀。待產(chǎn)物完全沉淀后進(jìn)行抽濾，用50%乙醇溶液進(jìn)行洗滌，8000r/min 下離心10min,重復(fù)洗滌3次，然后置于真空干燥箱中進(jìn)行干燥得到白色固體CCT。

CCTS 的制備：將一定量的蒸餾水倒入三口燒瓶中，加入適量的固體氫氧化鈉和季銨型甲殼素，堿濃度50%，液固比15∶1，油浴140℃加熱，磁力攪拌，密封，回流，脫乙酰化反應(yīng)8h。停止加熱和攪拌，抽濾。重復(fù)以上步驟，最后水洗至中性，置于50℃真空干燥箱中干燥得到較高脫乙酰度的CCTS。

1.2.2 兔毛織物的整理

將2g 整理劑、3g 檸檬酸和3g 次磷酸鈉溶解于200mL 蒸餾水中，加入3g 兔毛織物，于50℃浸泡15min 后取出，壓出多余液體，壓液率控制在70%，重復(fù)進(jìn)行兩次。于80℃預(yù)烘5min，120℃焙烘2min，50℃水洗后再冷水洗滌，于50℃下烘干，得到經(jīng)抗菌整理的織物。

1.3 季銨型殼聚糖的表征與測(cè)試

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

采用KBr 粉末壓片法分析測(cè)試，使用Nicolet IS50 型紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行FTIR 分析。稱取10mg 試樣與120mg 干燥的KBr 研磨均勻，用壓片機(jī)制成樣品壓片，進(jìn)行測(cè)試[15]。

1.3.2 核磁共振碳譜（13C NMR）

采用美國(guó)Varian 公司的Varian Infinityplus 300 MHz 核磁頻譜儀對(duì)甲殼素、CCT、CCTS 進(jìn)行13C NMR 譜分析。使用2.5mm 探針，掃描寬度250kHz，預(yù)掃描和馳豫延遲時(shí)間分別為10μs 和0.5s，自旋速率8.00kHz，掃描5h。

1.3.3 溶解性能的測(cè)定

以不同濃度檸檬酸溶液作溶劑配制1%的樣品溶液，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm下測(cè)定樣品溶液的透射比[16-18]。

1.3.4 黏均分子量的測(cè)定

用乙酸作溶劑，采用黏度法對(duì)CCTS 分子量、殼聚糖分子量進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.3.5 最低抑菌濃度的測(cè)定

以0.5%醋酸溶液為溶劑配制0.5%的CCTS 溶液，將適量培養(yǎng)基與適量樣品溶液混合制得濃度分別 為0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L 的混合培養(yǎng)基，凝固后取1～2mL大腸桿菌菌懸液滴于平板中。

將接種好的平板放入培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24h。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。完全抑制菌落生長(zhǎng)的試液濃度為本樣品對(duì)被試菌的最低有效抑菌濃度（MIC）值[20]。

稱取0.2g樣品溶解溶于40mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的滅菌醋酸溶液中，同時(shí)將體積分?jǐn)?shù)0.5%的滅菌醋酸溶液作為對(duì)照組。將19.2mL 培養(yǎng)基和0.8mL樣品溶液（濃度為0.2g/L）同時(shí)加入平皿中，立即前后作用均勻搖晃平皿，使得樣品液和培養(yǎng)基在培養(yǎng)基凝固前充分混合均勻，制得平皿，濃度為0.2g/L。凝固后取1～2mL大腸桿菌菌懸液(菌量約為106cfu/mL)滴于平板中。將接種好的平板放入培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.4 兔毛織物抗菌活性測(cè)定

試驗(yàn)采用GB/T 20944.3—2008對(duì)兔毛織物抗菌性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

將0.75g±0.05g 織物與經(jīng)過抗菌整理的織物分別裝入盛有試驗(yàn)菌液的三角瓶中，在150r/min、37℃下接觸震蕩12h。取出，稀釋到合適濃度，涂平板，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，分別觀察空白組、對(duì)照組及試驗(yàn)組菌落生長(zhǎng)情況。根據(jù)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果確定抗菌效果。細(xì)菌抑菌率按式(1)計(jì)算。

式中，R為細(xì)菌抑菌率，%；B、A為搖瓶前后活菌細(xì)胞數(shù)[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR分析

圖1 所示為CCTS 的制備原理，首先三乙胺與環(huán)氧氯丙烷發(fā)生親核取代反應(yīng)生成醚化劑，環(huán)氧基有較高的反應(yīng)活性，與氨基葡萄糖環(huán)上的羥基發(fā)生反應(yīng)生成醚鍵，將季銨基團(tuán)引入到甲殼素分子上，得到CCT，再經(jīng)脫乙酰得到CCTS。

圖2 顯示了醚化劑、甲殼素、CCT 和CCTS 的FTIR光譜。由圖2(a)可知，在3400cm-1附近是與伸縮振動(dòng)吸收峰的重疊，2970cm-1和2940cm-1處出現(xiàn)的是烷基中C H 鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，1470cm-1附近是CH2中C H 剪式振動(dòng)吸收峰,1640cm-1附近出現(xiàn)的強(qiáng)峰是季銨鹽的特征吸收峰，由此證明所得化合物應(yīng)為目標(biāo)產(chǎn)物CHPTAC-乙基。

由圖2(b)可見，在1060cm-1附近的吸收峰對(duì)應(yīng)甲殼素中的伯醇的伸縮振動(dòng)，對(duì)應(yīng)于1030cm-1處二烷基醚的吸收峰的增強(qiáng)[圖2(c)]，可能是由于醚化劑與季銨型甲殼素分子形成醚鍵。圖2(c)中1560cm-1和1630cm-1處的兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)于季銨型甲殼素仲酰胺中NH 面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1670cm-1處的峰對(duì)應(yīng)于仲酰胺羰基的伸縮振動(dòng)，其變?yōu)榧句@型殼聚糖中的伯胺基團(tuán)N H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，對(duì)應(yīng)于圖2(d)中1590cm-1和1620cm-1處的兩個(gè)峰。因此，季銨基團(tuán)通過與C6上的羥基形成醚鍵引入到甲殼素分子中，再經(jīng)脫乙酰將C2上的乙酰胺基變?yōu)椴坊玫紺CTS。

2.2 13C NMR分析

圖1 季銨型殼聚糖的制備

圖3為甲殼素、季銨型甲殼素和季銨型殼聚糖的13C NMR 譜圖。由圖可見，在化學(xué)位移δ=104.5處的信號(hào)歸屬于甲殼素骨架的C1原子的特征峰，在δ=55～85 處的共振峰應(yīng)歸屬為甲殼素C 圓環(huán)上C2～C6共振特征峰[22-24]，δ=174、23分別對(duì)應(yīng)于甲殼素乙?；械膕p2雜化碳原子即羰基碳原子的振動(dòng)峰C7和最高場(chǎng)甲基中的飽和碳原子峰C8。

圖3 甲殼素、季銨型甲殼素、季銨型殼聚糖的13C NMR譜圖

經(jīng)改性后甲殼素發(fā)生了顯著變化，出現(xiàn)引入C鏈上的C9、C10、C11新特征峰，陽(yáng)離子基團(tuán)主鏈上的碳原子峰對(duì)應(yīng)在δ=73.5 處出現(xiàn)的C9特征峰與C5比較接近，發(fā)生一定程度的重合，峰強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)出現(xiàn)了在季銨基團(tuán)中與N原子連接兩個(gè)烷基C原子的信號(hào)，在季銨基中隨著N原子上烷基取代數(shù)量增多會(huì)使α 碳原子向低場(chǎng)移動(dòng)至δ=54.5 處出現(xiàn)C12特征峰，它與C2、C11特征峰有一定程度的重合，信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)使與N原子相連的的β碳原子向高場(chǎng)移動(dòng)至δ=9.5處出現(xiàn)C13特征峰，證實(shí)了甲殼素中引入季銨基團(tuán)得到了CCT。

CCT 脫乙酰后低場(chǎng)sp2雜化C7峰與高場(chǎng)飽和甲基峰C8基本消失，乙?；久摮?，同時(shí)對(duì)季銨基團(tuán)特征峰基本保留，強(qiáng)度未降低，說(shuō)明脫乙酰過程對(duì)陽(yáng)離子基團(tuán)沒有造成影響，證明最終得到CCTS。

2.3 溶解性能分析

由于殼聚糖是非熱塑性材料，在受熱熔化之前已經(jīng)分解，因此殼聚糖產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用首先需要將其溶解制成溶液。然而殼聚糖大分子內(nèi)存在較強(qiáng)的分子內(nèi)和分子間氫鍵作用力，使得其在水和常見的有機(jī)溶劑中很難溶解，限制了殼聚糖的加工應(yīng)用。因此改善殼聚糖的溶解性能，對(duì)于擴(kuò)大和加強(qiáng)殼聚糖的應(yīng)用具有十分重要的意義。

圖4 不同檸檬酸濃度下季銨型殼聚糖與殼聚糖的透射比

試驗(yàn)通過對(duì)殼聚糖溶液的透光率分析來(lái)進(jìn)行其溶解性能測(cè)試，溶解性能越好，透光率越大；反之，透光率越小。圖4 顯示了CCTS 與殼聚糖在隨著檸檬酸溶液濃度的增大透射比也隨之增強(qiáng)，在檸檬酸濃度為0.05mol/L 和0.1mol/L 時(shí)，CCTS 與殼聚糖的透射比基本無(wú)差別；而檸檬酸濃度在0.2mol/L時(shí)，由于大量羧基與氨基的結(jié)合，溶解性能增強(qiáng)，兩者透射比顯著增大，而CCTS 在殼聚糖分子鏈上引入陽(yáng)離子季銨基團(tuán)，離子基團(tuán)同電子間相互排斥，由于空間位阻效應(yīng)大分子間距提高，破壞了不同分子鏈基團(tuán)間氫鍵作用，降低結(jié)晶度促進(jìn)溶解，親水基團(tuán)數(shù)量增加，溶解性能顯著提高；檸檬酸濃度增大到0.40mol/L，兩者的透射比無(wú)顯著提高。由此說(shuō)明CCTS 在弱酸中的的溶解性優(yōu)于殼聚糖，推測(cè)溶解性能的提高可能是CCTS 抑菌性能提高的因素。

2.4 黏度法測(cè)定分子量

圖5為CCTS、殼聚糖黏度η與濃度C關(guān)系線性擬合曲線。使用外推法進(jìn)行分子量計(jì)算，C 0 處即是特性黏度[η]，由[η]= KMα，即可推出樣品的分子量。其中K 取1.81×10-3mL/g，α 取0.93[25]，計(jì)算可得樣品的黏均分子量。

圖5 季銨型殼聚糖、殼聚糖黏度與濃度關(guān)系線性擬合曲線（插圖為黏均分子量）

由此得出CCTS 成功接枝上陽(yáng)離子季銨基團(tuán)，分子量增大。一方面CCTS 相當(dāng)于殼聚糖上引入大分子量季銨基團(tuán)；另一方面，溶解性能提高，有利于大分子充分?jǐn)U散，導(dǎo)致相互糾纏，流動(dòng)受阻，摩擦力增強(qiáng)，黏滯阻力增大，特性黏度增大導(dǎo)致分子量增大，同時(shí)有利于與纖維大分子和交聯(lián)劑分子接觸從而提高抑菌性和耐洗性。

2.5 CCTS的最低有效抑菌濃度

圖6 中可以明顯看出樣品對(duì)大腸桿菌的促進(jìn)、抑制以及細(xì)菌死亡的結(jié)果。甲殼素對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，而季銨型甲殼素的MIC值為0.4g/L。經(jīng)醚化劑改性后的甲殼素由于季銨基團(tuán)提高了其溶解性能且堿性增強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

圖6 樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌率及菌落生長(zhǎng)情況

殼聚糖、CCTS的MIC值分別為0.3g/L、0.2g/L。殼聚糖上的氨基具有一定的抑菌效果，帶正電的自由氨基能與細(xì)胞壁上的負(fù)電荷結(jié)合，在細(xì)菌表面形成一層高分子保護(hù)膜阻止了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌內(nèi)運(yùn)輸，而CCTS 含有的季銨基團(tuán)比氨基堿性更強(qiáng)，抑菌性增強(qiáng)；且溶解性增強(qiáng)，分子量增大，所形成的保護(hù)膜更加致密，更能阻止細(xì)菌對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞壁形成孔洞而造成胞內(nèi)成分外漏，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此季銨基團(tuán)的引入進(jìn)一步增強(qiáng)了CCTS的抑菌性能。

2.6 兔毛織物的抗菌活性

兔毛纖維是一種蛋白質(zhì)纖維，能夠促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖不僅會(huì)使織物遭到損壞甚至危害人體健康，因此對(duì)兔毛織物進(jìn)行抗菌整理具有重要意義。

圖7 不同整理劑對(duì)大腸桿菌的抑菌率

通過不同整理劑整理的兔毛織物對(duì)大腸桿菌抑菌效果的比較如圖7所示，結(jié)果與上節(jié)抑菌率大致吻合，經(jīng)脫乙酰后得到的CCTS 抑菌率達(dá)到99.9%以上。甲殼素溶解性差，整理過程中大部分沉積在兔毛纖維表面，抑菌性和耐洗性均不佳；甲殼素分子接枝上陽(yáng)離子季銨基團(tuán)，提高了親水性能，但由于季銨型甲殼素上的活性基團(tuán)較少，水溶性較差，與交聯(lián)劑反應(yīng)程度較小，大部分會(huì)涂覆在織物表面，在洗滌過程中會(huì)損失掉，抑菌性能表現(xiàn)不明顯；而殼聚糖溶于弱酸，同時(shí)自身氨基具有一定的抑菌性能，殼聚糖分子上的氨基、羥基與檸檬酸上的羧基反應(yīng)生成酰胺鍵和酯鍵從而交聯(lián)到兔毛纖維上，具有較好的耐洗性；CCTS 溶解性能提高且含有更強(qiáng)的抑菌基團(tuán)，更容易發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，因此耐洗性和抑菌性能最佳。

在此基礎(chǔ)上，針對(duì)CCTS 整理的兔毛織物進(jìn)行抗菌試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。經(jīng)過多次洗滌后兔毛織物抑菌效果依舊保持穩(wěn)定，這表明CCTS 是一種長(zhǎng)效優(yōu)異的毛織物抗菌整理劑。

圖8 織物洗滌次數(shù)對(duì)大腸桿菌的抑菌率影響

3 結(jié)論

（1）甲殼素和CHPTAC-乙基通過醚化反應(yīng)制備了CCT。再經(jīng)脫乙酰合成了CCTS。通過紅外光譜、核磁共振碳譜分析得到季銨基團(tuán)已被引入到甲殼素分子中，并經(jīng)脫乙酰得到CCTS。通過黏均分子量、透射比的測(cè)定得到CCTS 與殼聚糖相比分子量增大，溶解性能增強(qiáng)。

（2）采用最小抑菌法測(cè)定樣品抗菌活性，得到CCTS 對(duì)大腸桿菌的MIC 值為0.2g/L，此值優(yōu)于天然殼聚糖的MIC值，因此推斷季銨基團(tuán)的引入、溶解性能的提高、分子量的增大可能是CCTS 抑菌性提高的內(nèi)在因素。

（3）采用振蕩法測(cè)定整理前后兔毛織物的抗菌活性。結(jié)果表明，CCTS 對(duì)大腸桿菌具有明顯的抗菌作用。經(jīng)CCTS 整理后的兔毛織物對(duì)大腸桿菌的抗菌活性顯著提高，抑菌率高于CCT 和天然殼聚糖，達(dá)到99.9%以上，這表明CCTS 是一種長(zhǎng)效優(yōu)異的毛織物抗菌整理劑，在毛織物抗菌整理上將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。