張開屏，田建軍，景智波，曹凱慧，馬牧然，馬俊杰，靳 燁

（1. 內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，呼和浩特 010070； 2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 呼和浩特 010110）

0 引 言

發(fā)酵香腸是指在一定的控制條件下，通過(guò)微生物發(fā)酵使香腸pH值下降，水分活度降低而制成的一類風(fēng)味獨(dú)特的肉制品[1]。發(fā)酵香腸的制作過(guò)程主要包括腌制、發(fā)酵、干燥和成熟 4個(gè)階段，其中成熟階段是發(fā)酵香腸特征風(fēng)味物質(zhì)形成的重要階段[2]。Marco等指出，發(fā)酵肉制品的風(fēng)味物質(zhì)主要包括了醛類、酮類、醇類、酯類、酸類、含硫化合物、呋喃類以及芳香族化合物等[3]，Calkins等指出這些物質(zhì)的來(lái)源是通過(guò)脂肪的水解氧化、蛋白質(zhì)的降解、硫胺素的降解、酯化反應(yīng)和微生物的作用而得到[4]，但在這些反應(yīng)當(dāng)中，脂肪的水解氧化和蛋白質(zhì)的水解作用占主導(dǎo)地位[5]。

脂肪是發(fā)酵香腸的主要成分，在發(fā)酵香腸加工中脂類物質(zhì)的變化主要表現(xiàn)在脂肪的水解和氧化。這兩種反應(yīng)存在著一定的聯(lián)系，在脂肪水解反應(yīng)中產(chǎn)生的游離脂肪酸，成為脂肪氧化反應(yīng)的重要底物，是發(fā)酵香腸重要的風(fēng)味前體物質(zhì)之一[6]。Waade等通過(guò)添加葡萄球菌來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵劑后不飽和脂肪酸含量增加，遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸含量[7]。Lorenzo等發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵香腸加工過(guò)程中，在發(fā)酵和成熟過(guò)程中脂肪酸有明顯的逐漸釋放的現(xiàn)象，而成熟以后各組脂肪酸含量并無(wú)顯著差異[8]。Xiao等研究發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)發(fā)酵肉制品中單不飽和脂肪酸的組成有一定的影響[9]。郭壯等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)臘腸的發(fā)酵成熟和風(fēng)味品質(zhì)的形成有著至關(guān)重要的作用[10]；Zalacain等在發(fā)酵香腸中添加外源脂酶，發(fā)現(xiàn)脂酶可促改變游離脂肪酸組成，試驗(yàn)組的香腸脂肪酸總量略有增長(zhǎng)，不飽和脂肪酸含量顯著增加[11]。如今微生物脂肪酶已從細(xì)菌屬中廣泛分離，如芽孢桿菌，葡萄球菌，假單胞菌等[12-13]。脂肪酶會(huì)影響發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過(guò)程中脂肪酸的釋放速度及其組成比例，且在發(fā)酵香腸加工過(guò)程中不飽和脂肪酸釋放速度大于飽和脂肪酸。

本文通過(guò)中性紅平板培養(yǎng)基變色反應(yīng)、三丁酸甘油酯透明圈直徑測(cè)試，對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶能力測(cè)試，同時(shí)分析比較不同產(chǎn)酶能力菌株中脂肪酶基因Lip0069、Lip0893表達(dá)量的變化情況，篩選出產(chǎn)脂肪酶能力較高的乳酸菌TR1-1-3。以菌株TR1-1-3調(diào)制發(fā)酵劑來(lái)制作發(fā)酵香腸，以自然發(fā)酵ZR組、添加脂肪分解酶M組、產(chǎn)脂肪酶中等和弱的菌株ZF22和ZF19組為對(duì)照，分別在發(fā)酵香腸制備過(guò)程中0、2、4、6、12、24 d取樣，分析了不同發(fā)酵階段乳酸菌對(duì)發(fā)酵香腸中脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材 料

試驗(yàn)乳酸菌菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)與技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。培養(yǎng)基：MRS、TPY培養(yǎng)、中性紅油脂平板、富集培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)[14]執(zhí)行。

原料肉：羊肉（內(nèi)蒙古草原金鑫食品有限公司提供，肥瘦比為1∶4）。腸衣：市售25 mm 羊小腸。

1.1.2 藥品試劑

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，美國(guó) Sigma 公司。DNA試劑盒，蛋白酶K，天根試劑公司。Taq-DNA聚合酶，dNTP Mix，DNA Marker，溶菌酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司。對(duì)硝基苯酚酯，Sigma公司。RNA試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TB GreenTM Premix Ex Taq? II 定量試劑盒，大連寶生物公司。甲醇、無(wú)水硫酸鈉、焦性沒食子酸、正己烷、氫氧化鈉等均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

ISQ型GC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo公司。Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。LightCycler? 96 SW 1.1 實(shí)時(shí)定量PCR儀，上海羅氏有限公司。凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Bio-rad。NanoDrop2000核酸蛋白分析儀，美國(guó) Thermo Fisher Scientifc 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

用TPY液體培養(yǎng)基活化試驗(yàn)菌株三代，鏡檢保證其純度，再37 ℃富集培養(yǎng)48h，得到富集培養(yǎng)液。參照文獻(xiàn)，通過(guò)中性紅平板變色法和三丁酸甘油酯透明圈法判定菌株的產(chǎn)脂肪酶能力[15-16]。

1.2.2 菌株脂肪酶相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

1）普通PCR擴(kuò)增

依據(jù)菌株TR1-1-3全基因組測(cè)序結(jié)果[17]，Lip0069、Lip0893分別為編碼脂肪酶的基因，由上海美吉生物公司設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，提取菌株TR1-1-3的DNA為模板，采用相應(yīng)引物進(jìn)行普通PCR，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增后的產(chǎn)物并測(cè)序，從而判斷菌株中是否含有脂肪酶基因。

普通PCR擴(kuò)增基因Lip0069：正向引物：5′-GAC TGA TTG TAG GAG TTC CA-3′；反向引物：5′-TTG TGC CTA TCT CCT TGT TT-3′，長(zhǎng)度764bp。Lip0893正向引物：5′-CGA TCT TGA TAC TTA GTC ATC C-3′；反向引物：5′-GTT CTT AAC ATC AGA CTA CTG G-3′，長(zhǎng)度1 250 bp。

普通 PCR反應(yīng)體系：模板 DNA 2.0μL、上游引物1.0μL、下游引物 1.0μL、2×Taq PCR Mix 12.5μL、R Nase Free dH2O 8.5μL[18]。

2）RNA的提取及cDNA的合成

采用細(xì)菌 RNA試劑盒提取菌株 RNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)被提取總RNA的純度與含量。cDNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法將RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，置于?20 ℃保存、待用。

3）熒光定量PCR檢測(cè)

依據(jù)TB GreenTM試劑盒說(shuō)明書設(shè)定熒光定量PCR程序和試劑配制。Lip0069，Lip0083為試驗(yàn)基因，以核糖體18S rRNA為參考基因，以cDNA為模板，在 Light Cycler? 96 SW 1.1 儀中對(duì)目的基因及參考基因進(jìn)行相對(duì)定量 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)供試菌株中脂肪酶基因的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers of real-time quantization PCR

反應(yīng)體系：TB GreenTMPremix Ex Taq? II 12.5μL、上游引物 1.0μL、下游引物 1.0μL、cDNA 模板 2.0μL、R Nase Free dH2O 8.5μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 30 s，95 ℃延伸 15 s，共 40 個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸30 s，4 ℃保存待測(cè)[19]。

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)處理方法：本試驗(yàn)采用的是相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算方法選用2-ΔΔCt。

1.2.3 香腸工藝

參照文獻(xiàn)[20]，略有改動(dòng)。配料：瘦肉 75%、肥膘25%、蔗糖 0.5%、葡萄糖 0.5%、食鹽 2.5%、亞硝酸鈉100 mg/kg、抗壞血酸0.05%、發(fā)酵劑108CFU/g。工藝流程：原料肉→瘦肉絞碎，肥肉切丁→攪拌腌制（4 ℃，12 h）→灌腸→排氣→發(fā)酵（濕度90%～95%，25 ℃，48 h）→干燥（濕度85%，15 ℃，48 h）→成熟（濕度75%，12 ℃，48 h）→成品貯藏（4 ℃，6～24 d）。

1.2.4 香腸的分組

以產(chǎn)脂肪酶能力強(qiáng)的2株乳酸菌TR1-1-3和ZF22分別調(diào)制發(fā)酵劑來(lái)制作發(fā)酵香腸，分別以自然發(fā)酵ZR組、添加脂肪分解酶M組、產(chǎn)脂肪酶弱的菌株ZF19組為對(duì)照，分別在發(fā)酵香腸制備過(guò)程中 0、2、4、6、12、24 d取樣，分析不同發(fā)酵階段乳酸菌對(duì)發(fā)酵香腸中脂肪酸組成的影響。

1.2.5 脂肪酸的測(cè)定

取不同階段的發(fā)酵香腸去除腸衣后，液氮研磨至顆粒粉末，取0.4～0.5 g肉樣于50 mL離心管中，依據(jù)《食品中脂肪酸的測(cè)定：GB5009.168-2016》中所述方法進(jìn)行脂肪酸測(cè)定[21]。

色譜條件：色譜柱，柱長(zhǎng)100 m，內(nèi)徑250μm，膜厚0.2μm；進(jìn)口溫度與檢測(cè)器溫度分別為250 和280 ℃；高純氮?dú)鉃檩d氣；分流比9:1；進(jìn)樣量1.0μL；升溫程序：初始溫度120 ℃，持續(xù)5 min；150 ℃，升溫速率1.5 ℃/min，28 min；220 ℃，升溫速率 1.5 ℃/min，10 min。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±SD）表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行整理，采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 22.0進(jìn)行oneway ANOVA分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

2.1.1 產(chǎn)脂肪酶乳酸菌初篩試驗(yàn)

經(jīng)前期菌株生理生化特性分析，選取了10株產(chǎn)生物胺陰性、對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用、具有耐鹽及耐亞硝酸鹽特性、且具有降膽固醇能力的乳酸菌，進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶初篩試驗(yàn)。通過(guò)觀察中性紅平板變色情況，首先定性分析菌株是否具有產(chǎn)脂肪酶能力，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 產(chǎn)脂肪酶定性試驗(yàn)Table 2 Qualitative test of lipase production

根據(jù)表 2中性紅平板的變色情況可知，TE5302、ZW01、TE6401和WE25-2并未使中性紅平板變色，表明這 4株菌沒有產(chǎn)脂肪酶的能力或產(chǎn)脂肪酶的能力較弱。WE29-2T、XC-7-3-1和TF1303、TR1-1-3以及ZF19使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，即菌株在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的脂肪酶能夠分解橄欖油產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化。因此對(duì)這6株菌進(jìn)行產(chǎn)脂肪酶復(fù)篩試驗(yàn)。

2.1.2 產(chǎn)脂肪酶乳酸菌復(fù)篩試驗(yàn)

將能使中性紅平板變色的 6株乳酸菌活化，接種到三丁酸甘油酯平板中，觀察菌株分解三丁酸甘油酯產(chǎn)生的透明圈大小，定性判斷菌株產(chǎn)脂肪酶活力的大小。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 乳酸菌產(chǎn)脂肪酶能力試驗(yàn)Table 3 Lipase production capacity test of lactic acid bacteria

觀察菌株代謝過(guò)程中分解三丁酸甘油酯所產(chǎn)的透明圈直徑范圍為 9.05～12.65 mm，透明圈直徑平均為10.33 mm。其中瑞士乳桿菌TR1-1-3、ZF22分解三丁酸甘油酯所產(chǎn)的透明圈直徑分別為（12.65±0.212 ）和（11.00±0.28）mm，透明圈直徑顯著高于其他菌株（P＜0.05），因此定性確定TR1-1-3、ZF22產(chǎn)脂肪酶活力顯著高于其他試驗(yàn)菌株，且TR1-1-3產(chǎn)酶活力最強(qiáng)。

2.2 菌株脂肪酶相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定分析

2.2.1 普通PCR結(jié)果

以試驗(yàn)菌株提取的DNA為模板，用各基因相應(yīng)引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖 1所示。條帶從左到右依次為擴(kuò)增Lip0069、Lip0893基因的產(chǎn)物片段。由圖可知，各基因目的條帶清晰明亮，產(chǎn)物單一，大小分別為764、1 250 bp將目的基因的片段與DL2000DNA Marker比較，其大小一致，說(shuō)明獲得預(yù)期產(chǎn)物，引物反應(yīng)性能良好，符合試驗(yàn)要求，同時(shí)說(shuō)明菌株中含有此功能特性基因。

2.2.2 菌株脂肪酶相關(guān)基因表達(dá)量分析

選取來(lái)自不同種屬和相同種屬的脂肪酶活性高低不同的菌株，MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h提取RNA，進(jìn)行脂肪酶相關(guān)基因（Lip0069、Lip0893分別為編碼脂肪酶的基因）表達(dá)量的測(cè)定，以此從基因角度分析驗(yàn)證菌株產(chǎn)脂肪酶活性的原因所在，具體測(cè)定如圖2所示。

圖2 菌株脂肪酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of lipase gene in the strain

由圖2可知，菌株TR1-1-3在MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h后，脂肪酶相關(guān)基因Lip0069、Lip0893的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.421±0.038）、（0.206±0.001），2種脂肪酶基因表達(dá)量顯著（P＜0.05）高于其他菌株，TR1-1-3、ZF22、ZF19基因表達(dá)量與其菌株酶活性的測(cè)定結(jié)果一致，Lip0069、Lip0893基因相對(duì)表達(dá)量較高的菌株其脂肪酶活性也較高，同時(shí)試驗(yàn)菌株中TR1-1-3菌株表達(dá)量高于 RQ3-1-7。Meghwanshi等分析結(jié)果表明，乳酸菌中產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株主要存在于乳桿菌屬中[22]。

2.3 乳酸菌對(duì)脂肪酸組成的影響

脂肪酸的含量及其在全部脂肪酸中所占比例如表 4所示，發(fā)酵過(guò)程不同時(shí)間段樣品中飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acids, SFA）、單不飽和脂肪酸酸（Monounsaturated Fatty Acids, MUFA）和多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA）的含量如表5、6、7所示。

表4 脂肪酸的含量及其占比Table 4 Fatty acid content and its proportion

由表4可知，香腸在發(fā)酵和4 ℃低溫冷藏階段，SFA、MUFA和PUFA的含量均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，其中24 d時(shí)，ZR和TR1-1-3中SFA的含量增加了但是在脂肪酸中所占比例卻有所下降，ZR和TR1-1-3均從0 d的56.6%下降到24 d的46.6%，而添加酶制劑的M組SFA的百分比含量從0 d的56.6%上升到了67.9%，其他組別 SFA的占比變化不明顯。24 d時(shí) ZR、TR1-1-3、ZF22和ZF19組中MUFA的含量和占比均有所上升，且TR13增幅最大，僅M組中MUFA的占比表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。

2.3.1 乳酸菌對(duì)飽和脂肪酸的影響

飽和脂肪酸SFA的測(cè)試結(jié)果如表5所示。由表5可知，試驗(yàn)組檢測(cè)到的 SFA共有 16種，碳原子數(shù)小于 6的短鏈脂肪酸沒有檢測(cè)到，碳原子數(shù)為 6～12的中鏈脂肪酸檢測(cè)到5種，分別為己酸（C6:0）辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）、十一烷酸（C11:0）和月桂酸（C12:0），碳鏈上碳原子數(shù)大于12的長(zhǎng)鏈脂肪酸檢測(cè)到11種，含量較高的主要有肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），且C18:0的含量最高。

SFA總體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，TR1-1-3和ZF22在發(fā)酵的0～2 d時(shí)間內(nèi)，飽和脂肪酸的增長(zhǎng)速度最快，且與ZR、M和ZF19相比差異顯著（P＜0.05）。在4 ℃低溫冷藏的6～24 d，TR1-1-3對(duì)SFA含量的影響與其他處理組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著（P＜0.05）。

2.3.2 乳酸菌對(duì)單不飽和脂肪酸的影響

單不飽和脂肪酸MUFA的測(cè)試結(jié)果如表6所示。由表6可知，試驗(yàn)組檢測(cè)到的MUFA共有9種，分別為肉豆蔻烯酸（C14:1）、順-十五碳烯酸（C15:1）、棕櫚油酸（C16:1）、十七碳烯酸（C17:1）、反油酸（C18:IT9）、油酸（C18:1C9）、二十碳烯酸（C20:1）、二十二碳烯酸（C22:1）和神經(jīng)酸（C24:1）。試驗(yàn)組觀察階段含量較高的主要是油酸（C18:1C9）、棕櫚油酸（C16:1）、十七碳烯酸（C17:1）、肉豆蔻烯酸（C14:1），其中油酸（C18:1C9）含量最高。

MUFA總體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，12 d觀測(cè)值幾乎達(dá)到最高，在低溫冷藏的12～24 d的過(guò)程中，試驗(yàn)組均表現(xiàn)為MUFA的含量有所下降。TR1-1-3和ZF22在發(fā)酵的0～2 d時(shí)間內(nèi)，MUFA的增長(zhǎng)速度最快且與ZR、M和ZF19相比差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵4 d后MUFA的含量，除ZR組外其他處理組均發(fā)生了明顯變化，其中TR1-1-3組 MUFA的含量上升到了 36.57 mg/10 g，增加了321.80%，增長(zhǎng)幅度最高。12 d時(shí)5個(gè)試驗(yàn)組的含量均達(dá)到最高，其含量分別為 52.78、26.34、64.19、37.98、36.36 mg/10 g，分別增長(zhǎng)了508.77%、203.81%、640.37%、338.06%、319.38%。TR1-1-3試驗(yàn)組增長(zhǎng)比例最高，且與其他處理組差異顯著（P＜0.05）。

表5 乳酸菌對(duì)飽和脂肪酸的影響Table 5 Effects of lactic acid bacteria on saturated fatty acids

表6 乳酸菌對(duì)單不飽和脂肪酸的影響Table 6 Effects of lactic acid bacteria on mono-unsaturated fatty acids

ZR、M、TR1-1-3、ZF22、ZF19組0 d時(shí) MUFA的平均含量為8.67 mg/10 g，其中油酸（C18:1C9）含量最高，含量為1.8 mg/10 g，所占比例為20.76%。在12 d 時(shí)油酸（C18:1C9）含量分別為 39.00、17.94、49.30、27.09、25.86 mg/10 g，與0 d相比分別增長(zhǎng)了20.67、8.97、26.39、14.05、13.37倍，且在 12 d時(shí)含量達(dá)到最高，其中TR1-1-3變化最大，與其他試驗(yàn)組相比均差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 乳酸菌對(duì)多不飽和脂肪酸的影響

多不飽和脂肪酸PUFA的測(cè)試結(jié)果如表7所示。由表7可知，試驗(yàn)組檢測(cè)到的 PUFA共有 9種，分別為反亞油酸（C18:2T9）、順亞油酸（C18:2C9）、γ-亞麻酸（C18:3N6）、α-亞麻酸（C18:3N）、二十碳二烯酸（C20:2）、二十碳三烯酸（C20:3）、順-二十碳三烯酸（C20:3N3）、花生四烯酸（C20:4）和二十二碳六烯酸（C22:6，DHA）。其中亞油酸（C18:2C9）、亞麻酸（C18:3N6、C18:3N3）、花生四烯酸（C20:4）、二十二碳六烯酸DHA（C22:6）含量較高。

表7 乳酸菌對(duì)多不飽和脂肪酸的影響Table 7 Effects of lactic acid bacteria on polyunsaturated fatty acids

續(xù)表 (continued table)

PUFA 總體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)， ZR、M、TR1-1-3、ZF22、ZF19組在0 d時(shí)，多不飽和脂肪酸（PUFA）含量為9.61 mg/10g，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，PUFA的含量增加。發(fā)酵2 d后PUFA的含量，只有TR1-1-3發(fā)生了明顯的變化（P＜0.05）,含量上升到了 12.11 mg/10g，增長(zhǎng)了 26.01%。發(fā)酵4 d 后PUFA的含量TR1-1-3和ZF22組發(fā)生了明顯變化（P＜0.05），其含量分別增長(zhǎng)了27.06%和27.89%。在6～24 d的4 ℃低溫冷藏階段，PUFA的含量總體呈上升趨勢(shì)，其中12 d時(shí)，ZR、M、TR1-1-3、ZF22、ZF19中PUFA的含量分別增加了51.04%、3.13%、54.17%、39.58%、31.25%，TR1-1-3和ZR的增加量最高，且與其他組相比差異顯著（P＜0.05）。

PUFA中n-3PUFA主要包括α-亞麻酸（C18:3N3，α-Linolenic Acid，ALA）、二十二碳六烯酸（C22:6，Docosahexaenoic Acid，DHA）、二十碳五烯酸(C20:5，Eicosapentaenoic Acid，EPA)，對(duì)抑郁癥、心血管疾病有預(yù)防和治療作用[23-24]。富含n-3 PUFA 的飲食可以顯著降低人類血液中血脂（TG）含量[25-26]，抑制動(dòng)脈硬化[27]。DHA和EPA 是目前關(guān)注較多的n-3 PUFA，Egert 等[28]和Mori 等[29]的研究均發(fā)現(xiàn)，DHA 對(duì)血脂正常和高血脂癥人群都有顯著的降血脂作用。ZR、M、TR1-1-3、ZF22、ZF19組在12 d時(shí)共檢測(cè)到2種亞麻酸，分別為γ-亞麻酸（C18:3N6）和α-亞麻酸（C18:3N3），其中 C18:3N6在試驗(yàn)的不同階段其含量變化差異不顯著（P＞0.05），12 d時(shí)α-亞麻酸（C18:3N3）的含量分別為1.73、1.19、1.60、1.51、1.54 mg/10 g，分別增加了 86.81%、31.87%、75.82%、64.84%、64.84%，其中ZR和TR1-1-3的增幅最大。二十二碳六烯酸DHA（C22:6）各組試驗(yàn)階段變化差異均不顯著（P＞0.05）。

PUFA中n-6PUFA主要包括反亞油酸（C18:2T9）、順亞油酸（C18:2C9）和花生四烯酸（C20:4）。ZR、M、TR1-1-3、ZF22、ZF19組在12 d時(shí)亞油酸（C18:2C9）含量分別為4.47、2.05、4.97、2.98、2.81 mg/10g，分別增加了320.56%、96.26%、367.30%、180.37%、161.68%，TR1-1-3和ZR變化最大且與其他組差異顯著（P＜0.05）。TR1-1-3與對(duì)照組ZR相比，TR1-1-3在發(fā)酵的第2 d 時(shí)亞油酸（C18:2C9）的含量已發(fā)生明顯差異，ZR在冷藏的第 12 d時(shí)亞油酸（C18:2C9）的含量才發(fā)生明顯差異（P＜0.05），可見TR1-1-3明顯加快了亞油酸（C18:2C9）的產(chǎn)生速度。對(duì)照組ZR在12 d時(shí)PUFA的含量增長(zhǎng)了51.04%，TR1-1-3在12 d時(shí)PUFA的含量增長(zhǎng)了54.17%，且TR1-1-3與其他試驗(yàn)組相比均差異顯著（P＜0.05）。反亞油酸（C18:2T9）各組變化差異均不顯著（P＞0.05）。在整個(gè)試驗(yàn)階段n-6/n-3為2.77，遠(yuǎn)小于FAO/WHO的上限標(biāo)準(zhǔn)（5:1）[30]。

TR1-1-3與對(duì)照組ZR相比，TR1-1-3在發(fā)酵的第2 d時(shí) PUFA的含量已發(fā)生明顯差異，ZR在冷藏的第 12 d時(shí)PUFA的含量才發(fā)生明顯差異，可見TR1-1-3可明顯加快PUFA的生成速度，縮短發(fā)酵香腸的成熟時(shí)間。

3 結(jié) 論

1）10株試驗(yàn)菌株中有6株在代謝過(guò)程中產(chǎn)脂肪酶，其中瑞士乳桿菌TR1-1-3產(chǎn)酶活力最強(qiáng)。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株 TR1-1-3中編碼脂肪酶的基因 Lip0069、Lip0893表達(dá)量最高。

2）乳酸菌對(duì)發(fā)酵香腸脂肪酸組成的影響試驗(yàn)表明，香腸在發(fā)酵、干燥/成熟和4 ℃低溫冷藏階段，試驗(yàn)組共檢測(cè)到34種脂肪酸，包括16種SFA、9種MUFA、9種PUFA。

3）SFA含量較高的主要有肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），在4℃低溫冷藏階段僅ZR和TR1-1-3中SFA的含量在脂肪酸中所占比例有所下降，而添加酶制劑的M組有所上升，其他組別SFA的占比變化不明顯（P＞0.05）。

4）MUFA中含量較高的主要是油酸（C18:1C9）、棕櫚油酸（C16:1）、十七碳烯酸（C17:1）、肉豆蔻烯酸（C14:1）。發(fā)酵2 d后，僅TR1-1-3和ZF22組MUFA的含量明顯上升（P＜0.05）。12 d時(shí)5個(gè)試驗(yàn)組MUFA的含量均達(dá)到最高，其中TR1-1-3增長(zhǎng)比例最高，且與ZR、M組差異顯著（P＜0.05）。

5）PUFA中含量較高的主要是亞油酸（C18:2C9）、亞麻酸（C18:3N6、C18:3N3）、花生四烯酸（C20:4）、DHA（C22:6）。發(fā)酵2 d后只有TR1-1-3組PUFA的含量發(fā)生了明顯的變化（P＜0.05），ZR在冷藏的第12 d時(shí)PUFA的含量才發(fā)生明顯差異，TR1-1-3在12 d時(shí)PUFA的含量增長(zhǎng)了54.17%，且與其他試驗(yàn)組相比均差異顯著（P＜0.05）。

綜上可知，所有試驗(yàn)組中SFA、MUFA和PUFA的含量在0～12 d均表現(xiàn)為上升趨，12～24 d變化趨勢(shì)變緩。乳酸菌TR1-1-3可降低產(chǎn)品中SFA在脂肪酸中所占比例，明顯加快 MUFA、PUFA的增加速度及其含量，可為研究改善香腸脂肪特性提供良好的前景。