陳楠生

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

有害藻華(harmful algal blooms)是由于藻類快速繁殖和累積造成的自然生態(tài)現(xiàn)象, 可能具有災(zāi)難性的生態(tài)或經(jīng)濟后果, 比如導(dǎo)致海洋動、植物死亡、海洋食品污染、海洋食物鏈的改變, 以及旅游資源的破壞等[1-2]。近年來, 國內(nèi)外赤潮發(fā)展具有新特點, 包括暴發(fā)規(guī)模加大、持續(xù)時間更長、致災(zāi)效應(yīng)加重和全球擴張明顯[3]。我國海岸線長, 近岸海域面積大, 包括渤海、黃海、東海和南海, 有害藻華是我國海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的問題之一[1]。對于引發(fā)有害藻華的物種, 應(yīng)用傳統(tǒng)的基于形態(tài)分類的研究方法, 積累了大量的數(shù)據(jù)。然而基于形態(tài)分類的研究方法有很大的局限性。首先, 需要研究人員具有專業(yè)經(jīng)驗, 來準(zhǔn)確分辨不同藻類物種; 其次, 藻類細(xì)胞在分析過程中的形態(tài)穩(wěn)定性的不同可能造成結(jié)果的偏差; 另外, 細(xì)胞太小的微微藻往往會被忽略; 還有, 形態(tài)相似的隱存種得不到準(zhǔn)確區(qū)分[4-6]。

分子分析方法的引入大大加強了我們對包括有害藻華物種在內(nèi)的浮游植物生物多樣性的理解[7]。早在20多年前, 美國和法國科學(xué)家分別通過克隆測序葉綠體16S rDNA和核糖體18S rDNA序列鑒定到海水中存在多種真核浮游植物[5,8-9](圖 1)。隨后, 18S rDNA被作為分子標(biāo)記研究自然海域浮游植物的組成,并發(fā)現(xiàn)兩類與甲藻進(jìn)化關(guān)系較近的生物類群, 即海洋alveolateⅠ和 alveolateⅡ[10-11], 并確認(rèn)了 AlveolateⅠ和AlveolateⅡ都是寄生性甲藻[12]。

這些基于DNA分子標(biāo)記擴增、測序研究野外樣本的方法迅速顯示出強大的潛力, 并逐步演變成為宏條形碼分析[13], 即針對包括很多物種的自然樣本,而不是單一物種為研究對象的基因組研究。宏條形碼分析已廣泛應(yīng)用于包括有害藻華在內(nèi)的浮游植物的生態(tài)學(xué)研究[14]。宏條形碼分析策略與基于全基因組測序的宏基因組學(xué)分析(metagenomics analysis)相輔相成, 宏條形碼分析關(guān)注物種組成及相對豐度,宏基因組學(xué)則重點關(guān)注基因功能。2015年美國《科學(xué)》雜志發(fā)表了系列利用宏條形碼分析的文章, 報道Tara Oceans國際合作項目的研究成果(圖2)[15]。通過對采集到的334個浮游植物樣本針對18S rDNA V9進(jìn)行擴增和高通量測序, 得到了150 000個可操作分類單元(operational taxonomy units, OTUs), 其中1/3未能比對到已知物種, 說明海洋中存在大量的尚未得到描述的真核物種。Tara Oceans數(shù)據(jù)的分析結(jié)果揭示了藻類物種的全球分布格局, 包括藻類物種的生物地理學(xué)[16-22]、季節(jié)性變化規(guī)律[23-24]和共生性[25]。另外一個有代表性的宏條碼研究是由國際海洋采樣日聯(lián)盟(Ocean Sampling Day Consortium)發(fā)起的國際合作項目[26-27]。這個由歐盟資助的微生物B3項目發(fā)起的國際組織意在通過國際合作, 在同時間獲取海洋樣本, 完成測序分析。迄今, 海洋采樣日聯(lián)盟已經(jīng)協(xié)同完成了多個重大項目, 比如, 通過對全球141個采樣位點樣本的同時采樣, 和18S rDNA V4序列的測序, 首次完成了大規(guī)模海洋綠藻的全球分布分析[26]。近年來, 隨著DNA測序技術(shù)在海洋生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用,DNA測序正在代替?zhèn)鹘y(tǒng)技術(shù), 逐步被應(yīng)用于監(jiān)測海洋生態(tài)狀況[28]。另外, 國際合作項目全球微生物組計劃(Earth Microbiome Project)也展開了較多的海洋浮游植物的宏條形碼分析[29]。

圖1 宏條形碼分析的里程碑事件Fig. 1 Milestones in metabarcoding analysis

圖2 Tara Oceans項目-浮游植物與其他浮游生物的豐富度分布格局[15]Fig. 2 Tara Oceans Project： Abundance profile of phytoplankton and other plankton

宏條形碼分析方法引入我國以后, 促進(jìn)了針對各海域的有害藻華研究[30-33]。特別是近年來, 宏條形碼研究越來越多, 包括對渤海[34-38]、黃海、東海[39-40]、南海[41-43]、膠州灣[4,44]、北部灣、長江口、珠江口[45-46]等的研究, 取得了顯著進(jìn)展。本綜述系統(tǒng)介紹這些進(jìn)展, 并分析存在的機會與挑戰(zhàn)。

1 宏條形碼分析技術(shù)

1.1 條形碼的選擇

宏條形碼分析通用的條形碼包括核糖體 rRNA基因18S rDNA、28S rDNA、 ITS序列、葉綠體基因rbcL和16S rDNA[47]和線粒體基因CO1等。這些通用分子標(biāo)記的最大優(yōu)勢在于它們的通用性, 即可以通過設(shè)計通用 PCR擴增引物進(jìn)行擴增、測序, 并且可以用于分析絕大多數(shù)的浮游植物, 包括有害藻華物種。早期的宏條形碼分析是通過克隆、測序策略完成的, 即擴增全長或局部的通用分子標(biāo)記, 克隆, 然后挑選單克隆, 通過第一代DNA測序(即桑格測序)技術(shù)讀取每一條條形碼的序列。隨著第二代DNA測序技術(shù)的出現(xiàn), 高通量、低成本的第二代DNA測序技術(shù)逐步取代低通量、高成本的第一代DNA測序技術(shù), 變成宏條形碼主流測序技術(shù)。由于第二代DNA測序技術(shù)的讀長比較短, 因此基于第二代DNA測序技術(shù)的宏條形碼分析往往針對上述通用分子標(biāo)記的局部, 比如, 18S rDNA的V4區(qū)域[4]或V9區(qū)域[15], 28S rDNA的D1-D2區(qū)域[48]等特異性條形碼。目前, 第二代DNA測序技術(shù)是開展宏條形碼研究的主流, 但是, 由于二代DNA測序得到的DNA片段往往不足以分辨不同物種, 基于第二代DNA測序的宏條形碼分析不能充分回答很多問題。隨著第三代單分子DNA測序技術(shù)的日益成熟, 特別是基于PacBio測序平臺的測序通量的不斷增加, 成本逐步下降, 越來越多的人開始嘗試將第三代DNA測序技術(shù)應(yīng)用于宏條形碼分析[49]。

1.2 宏條碼分析方法: 從OTU分析到ASV分析

很長一段時間以來, 宏條形碼分析的通常分析思路是通過分子標(biāo)記(即條形碼)擴增和測序后, 對測序結(jié)果進(jìn)行聚類分析, 生成可操作分類單元(OTU)。每一個可操作分類單元OTU包括樣本中相差很小(通常在3%以內(nèi))的序列。OTU分析方法被廣泛用于分析宏條形碼研究項目。通常, 人們期待OTU 具有如下兩方面的功能： 其一, 把針對某種分子標(biāo)記的環(huán)境樣本的高通量測序結(jié)果轉(zhuǎn)換成物種分類信息, 并且不同的相似性對應(yīng)不同的分類單元;其二, 通過把相似的序列聚類起來, 從而減少測序錯誤帶來的副作用, 降低對生物多樣性分析和物種組成分析的負(fù)面影響[50]。然而, OTU并不能夠很好地執(zhí)行上面的兩個功能。OTU并沒有具體的分類信息,不能與物種進(jìn)行一一對應(yīng)。而且, 模擬研究發(fā)現(xiàn)OTU聚類分析得到的 OTU數(shù)目往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于物種數(shù)目, 表明OTU聚類分析具有很高的假陽性[50]。同時, 由于OTU聚類分析忽視了現(xiàn)代測序結(jié)果中的質(zhì)量信息, 浪費了區(qū)分更精細(xì)的序列多樣性的可能性,人為限制了OTU聚類分析的分辨率, 表明OTU聚類分析還具有很高的假陰性[51-52]。

OTU聚類分析的另外一個嚴(yán)重的弊端是分析結(jié)果不能用于比較不同樣本的物種組成。無參考數(shù)據(jù)庫的OTUs(de novoOTUs)分析結(jié)果非常依賴樣本的組成(圖3), 因此, 兩個不同樣本的OTU聚類分析結(jié)果不能進(jìn)行比較。為了支持不同樣本聚類分析結(jié)果的可比性, 人們提出了“封閉式”有參OTUs(closedreference OTUs)的概念, 即在聚類過程中, 根據(jù)相似性, 序列都圍繞參考數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行聚類,得到 OTUs。因此, 只要利用相同的參考數(shù)據(jù)庫, 分析得到的 OTUs是可以比較的。這個分析思路的局限是, 參考數(shù)據(jù)庫中不存在但是樣本中存在的數(shù)據(jù)就不能得到聚類(圖 3)。因此, 封閉式有參 OTUs分析受到參考數(shù)據(jù)庫的局限[50]。并且, 參考數(shù)據(jù)庫的任何變化比如數(shù)據(jù)庫升級都會影響分析結(jié)果。

圖3 基于ASV的分析在逐步取代基于OTU的分析[50]Fig. 3 Replacement of OTU-based analysis by ASV-based analysis

為了解決上述OTU相關(guān)的問題, 人們提出了基于擴增子序列變異(amplicon sequence variant, ASV)概念。ASV算法的基本假設(shè)是真實的DNA序列在測序結(jié)果中出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于測序誤差, 不依賴閾值區(qū)分不同的ASV[50]。因此, 來自不同樣本的ASV序列具有可比性[50]。

基于這個概念的宏條形碼分析具有既不依賴參考數(shù)據(jù)庫, 也不依賴相似性閾值的優(yōu)點。因此, 與基于OTU概念的分析方法相比, 基于ASV的宏條形碼分析方法具有很高的優(yōu)越性, 可以捕獲樣本中所有的變異, 并且可以用于比較分析不同樣本的物種組成(圖3)。由于基于ASV的分析更加準(zhǔn)確, 分析結(jié)果可以用于比較不同樣本的物種組成, 可以重復(fù)使用,并且更加全面, 基于OTU的宏條形碼分析方法在逐步被基于 ASV的方法替代[50,53]。常用的用于分析ASV的方法包括DADA2[51], Deblur[54]和denoise[55]。

DADA算法, 即不同擴增子去噪算法(Divisive Amplicon Denoising Algorithm), 最早發(fā)表于2012年[52]。DADA是在AmpliconNoise算法[55]的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的。DADA的優(yōu)勢在于不需要訓(xùn)練數(shù)據(jù)集, 充分利用序列豐度信息, 通過誤差建模, 評估誤差參數(shù), 最后推測出樣本測序結(jié)果中的序列類型。2016年DADA2發(fā)表, 特別增加了針對Illumina擴增子的測序質(zhì)量模型, 并開發(fā)了R軟件包, 全部分析可以在R環(huán)境下運行, 包括過濾、去重復(fù)、推測序列信息、鑒定嵌合體、結(jié)合雙端測序結(jié)果等[51]。最近, 我們成功利用DADA2方法分析膠州灣2019年冬季航次采集的樣本, 分析發(fā)現(xiàn)了大量浮游植物, 其中包括首次在膠州灣發(fā)現(xiàn)的有害藻華物種, 以及大量的寄生性甲藻, 并評估了浮游植物之間的互作情況[4]。

2 我國海域有害藻華物種的宏條形碼分析進(jìn)展

2.1 近岸海域的宏條形碼分析

渤海是我國唯一的內(nèi)海, 具有半封閉性, 包括遼東灣、渤海灣和萊州灣, 是一個重要的產(chǎn)卵場和索餌場(圖 4)[56]。由于陸生污染物排放和富營養(yǎng)化,赤潮和褐潮暴發(fā)頻率和強度均呈上升趨勢[56-57]?；谛螒B(tài)學(xué)的鏡檢的研究發(fā)現(xiàn)渤海代表性有害藻華物種, 包括夜光藻(Noctiluca scintillans)、原甲藻(Prorocentrumsp.)、血紅哈卡藻(Akashiwo sanguinea)[58], 丹麥細(xì)柱藻(Leptocylindrus danicus)[59]、柔軟擬菱形藻(Pseudo-nitaschia delicatissima)[59]、浮動彎角藻(Eucampia zoodiacus)[59]、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)[59]、諾氏海鏈藻(Thalassiosira nordenskioldi)[59]、旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)[59]、柔弱幾內(nèi)亞藻(Guinardia delicatula)[60]、多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)[61]和有害甲藻(Stoeckeria algicida)[36,62-63]。基于擴增測序 18S rDNA V4的宏條形碼研究證實褐潮的致災(zāi)藻華物種是抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)[64-65]。通過對沉積物樣本進(jìn)行18S rDNA V9區(qū)擴增測序, 發(fā)現(xiàn)了抑食金球藻是一個本地種, 并且是一個在全世界范圍內(nèi)廣泛分布的有害藻華物種[66]。除此之外, 宏條形碼研究還發(fā)現(xiàn)渤海還存在很多豐度較低但是又具有暴發(fā)潛力的有害藻華物種[34,36,38,67-69]。

黃海是一個陸緣海(marginal sea), 具有比較復(fù)雜的海流包括黃海冷水團(tuán)(Huanghai Cold Water Mass,HCWM), 黃海暖流(Huanghai Warm Current, HWC),以及長江沖淡水(Changjiang River Diluted Water,CDW)(圖 4)[70]。蘇北淺灘的浮游植物以硅藻為主[71]。孢囊分析發(fā)現(xiàn)很多有害藻華物種的孢囊, 包括具刺膝溝藻(Gonyaulax spinifera)和多邊舌甲藻(Lingulodinium polyedrum), 鏈狀/塔馬亞歷山大藻(Alexandrium catenella/tamarense), 微小/相似亞歷山大藻(Alexandrium minutum/affine)和鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)[72]?；?8S rDNA V4區(qū)的宏條形碼比較分析發(fā)現(xiàn)南黃海與北黃海海域的綠藻與硅藻具有很高的豐度, 可以支撐海岸帶的食物鏈, 特別是海洋經(jīng)濟貝類的養(yǎng)殖[73]。

位于我國、韓國、日本之間的東海是一個很大的大陸架(continental shelf), 也是一個高產(chǎn)漁場, 其浮游生物受長江沖淡水以及黑潮(Kuroshio Current)的影響比較大[74-75]。東海的長江口附近海域是赤潮暴發(fā)最顯著的位置[1], 對海洋生態(tài)環(huán)境和公共衛(wèi)生產(chǎn)生極大影響[76]。迄今對于東海浮游植物及有害藻華物種的研究以浮游植物色素研究[74]、流式細(xì)胞研究[75]和形態(tài)觀察[77-79]為主。東海有害藻華物種中，東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)[80-83]和米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)[84-85]占主導(dǎo)地位。最近在東海發(fā)現(xiàn)了指狀卡羅藻(Karlodinium digitatum)[84], 血紅哈卡藻的多個隱形種(cryptic species)[85], 以及尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)[86]。廈門島樣本進(jìn)行18S rDNA V9測序, 發(fā)現(xiàn)底棲微型真核生物的多樣性比浮游的更高, 不同生境的物種分布模式以及影響分布模式的關(guān)鍵過程不同[39,87-88]。定鞭藻(haptophyte)是重要的浮游植物, 貢獻(xiàn)顯著的初級生產(chǎn)力, 也具有很高的生物多樣性[89-91]。通過利用定鞭藻特異性引物對18S rDNA V4區(qū)的擴增測序及宏基因組分析證實了定鞭藻的分子多樣性水平, 并檢測到所有定鞭藻的主要分枝, 包括有害藻華物種球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)及三個同屬的棕囊藻物種(P. cordata,P. johnii,以及一個由序列ST3500.059代表的物種)[40]。

南海位于西太平洋北部, 是由多個國家圍繞的半封閉海域, 也是東南亞最大的半封閉的陸源海[92]。南海的主要有害藻華物種包括夜光藻、球形棕囊藻、中肋骨條藻、錐狀斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、海洋卡頓藻(Chattonella marina)和米氏凱倫藻, 有害藻華極大地影響了南海海洋漁業(yè)。鏡檢和形態(tài)學(xué)分析顯示上升流對物種分布具有顯著的影響[93]。調(diào)查研究系統(tǒng)描述了南海浮游植物的組成和季節(jié)性變化, 其中也包括很多有害藻華物種[94-104]。衛(wèi)星遙感方法也跟蹤研究了南海赤潮[105-108], 特別是球形棕囊藻赤潮[109]的形成過程。宏條形碼分析揭示了香港水域微微藻生物的多樣性,遠(yuǎn)高于預(yù)期[110]。全長18S rDNA擴增, 克隆測序分析揭示了南海浮游植物的組成和分布格局, 發(fā)現(xiàn)甲藻是優(yōu)勢物種[111]?；贗TS2的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)了珊瑚礁共生藻類的多樣性[41-43]。

2.2 海灣宏條形碼研究

膠州灣是黃海西部的一個半封閉性內(nèi)灣, 海灣與外?？梢赃M(jìn)行通暢的海水交換, 半交換周期為5天[112]。近 30年來, 經(jīng)濟活動加快和人口增長造成了膠州灣顯著的富營養(yǎng)化[113-114]。長時序遙感影像分析跟蹤膠州灣秋季葉綠素a濃度變化也顯示出膠州灣浮游植物群落的巨大變化[115]。膠州灣發(fā)現(xiàn)的甲藻孢囊中很多是有害藻華物種[116]。近年來, 膠州灣暖水性浮游植物、甲藻等浮游植物類群的數(shù)量呈現(xiàn)升高趨勢[117]。膠州灣有記錄的有害藻華物種高達(dá) 68種, 其中有多種在膠州灣引發(fā)過赤潮暴發(fā)[118]。常見有害藻華物種包括夜光藻[119-120]、浮動彎角藻[121-124]和骨條藻[4]。在挪威海域引發(fā)大規(guī)模有毒藻華的有害藻華物種里氏金色藻(Chrysochromulina leadbeateri)也在膠州灣發(fā)現(xiàn)[125]。歷史調(diào)查報告中, 膠州灣的骨條藻大多被鑒定為中肋骨條藻[124]。最近我們針對18S rDNA V4的宏條碼分析, 加上對分離到的單細(xì)胞骨條藻株系的全長 18S rDNA測序分析表明, 膠州灣的骨條藻為瑪氏骨條藻(Skeletonema marinoi)(圖4)[4]。針對rbcL的宏條形碼分析初步揭示了膠州灣浮游植物的生物多樣性, 春季代表性物種包括隱藻、定鞭藻和紅藻[44]。我們針對18S rDNA的 V4片段完成了宏條形碼分析, 分析了膠州灣冬季(2019年1月)的浮游植物組成及空間分布格局, 鑒定出膠州灣有 28個有害藻華物種, 并發(fā)現(xiàn)了膠州灣物種之間的可能互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖5)[4]。

北部灣位于南海西北部的一個半封閉式的海灣,熱帶季風(fēng)氣候, 曾經(jīng)被認(rèn)為是我國最后“一片干凈的海域”和高產(chǎn)漁業(yè)基地[126]。進(jìn)入19世紀(jì)90年代, 由于自然與人類活動的雙重影響加劇[127], 北部灣海域暴發(fā)了一系列赤潮, 包括紅海束毛藻(Trichodesmium

圖4 膠州灣分離得到的骨條藻是瑪氏骨條藻[4]Fig. 4 Skeletonema marinoi is the primary Skeletonema species in the Jiaozhou Bay

圖5 膠州灣浮游生物之間的互作網(wǎng)絡(luò)[4]Fig. 5 Phytoplankton species-species interaction network in Jiaozhou Bay

erythraeum)赤潮和球形棕囊藻赤潮[128-130]。在過去30年里, 北部灣藻華暴發(fā)頻率、暴發(fā)持續(xù)時間和暴發(fā)規(guī)模都有顯著上升; 這些赤潮暴發(fā)事件不僅影響漁業(yè), 還對附近核電設(shè)施造成了巨大的威脅[126]。基于形態(tài)學(xué)分析在潿洲島附近鑒定出103種浮游植物,包括23種有害藻華物種, 其中球形棕囊藻、紅海束毛藻、菱形海線藻(Thalassionema nitzschioides)、旋鏈角毛藻和洛氏角毛藻(Chaetoceros lorenzianus)占優(yōu)勢[129]。利用流式細(xì)胞儀對北部灣9個航次的分析揭示了浮游植物在北部灣分布的時空變化[131], 浮游植物在夏季和秋季的豐度較高, 并集中于欽州灣附近以及雷州半島的西部。鏡檢發(fā)現(xiàn)欽州灣附近的浮游植物也比較豐富, 優(yōu)勢種包括球形棕囊藻和多種硅藻, 季節(jié)變化顯著[132]。球形棕囊藻囊體在北部灣也呈現(xiàn)出特定的時空分布, 高峰出現(xiàn)在12月到次年3月, 6月囊體很少[133]。迄今利用宏基因組學(xué)方法研究北部灣海域有害藻華物種的組成, 以及在有害藻華暴發(fā)過程中的動態(tài)變化剛剛起步[134]。通過對2014—2015年度樣本的18S rDNA V4序列的測序, 重點分析了5種定鞭藻在北部灣北方的欽州灣分布情況, 發(fā)現(xiàn)與NO3-N正相關(guān), 并且發(fā)現(xiàn)水溫是決定球形棕囊藻豐度的主要原因。

2.3 河口宏條形碼研究

河口往往是多樣性程度很高的物理-生物互作生態(tài)系統(tǒng), 由于淡水注入(freshwater discharge)和咸水倒灌(salt water intrusion), 在河口附近鹽度和營養(yǎng)鹽顯示很大的變化, 形成了河流-海域連續(xù)帶(river ocean continuum)。由于河口附近海域復(fù)雜的物理及生物地球化學(xué)互作, 使得針對這些水域浮游植物的生長、分布規(guī)律, 以及有害藻華暴發(fā)的研究都具有很大的挑戰(zhàn)。

長江口由于長江徑流和泥沙入海, 以及復(fù)雜流系結(jié)構(gòu)和特殊地形, 形成了獨特的生態(tài)系統(tǒng), 也為赤潮暴發(fā)提供了條件[135-137]。長江口及其鄰近海域受到長江沖淡水和黑潮分支的雙重影響, 有害藻華的形成和演變不僅是陸源污染的“指示器”, 也是反映黑潮分支年際變異的“效應(yīng)器”[138]。從20世紀(jì)60年代到 90年代, 人為富營養(yǎng)化(cultural eutrophication)越來越嚴(yán)重[139]。長江口水域有多達(dá)68種有害藻華物種, 其中 5種有在長江口暴發(fā)赤潮的記錄[140],以甲藻為主, 包括東海原甲藻[83]、米氏凱倫藻、亞歷山大藻(Alexandriumspp.)和夜光藻[138,141]。僅次于甲藻的是硅藻, 包括中肋骨條藻[141-143]。中肋骨條藻與夜光藻是常見和多發(fā)性赤潮物種, 二者經(jīng)常形成“混合型”赤潮[144]。長江口內(nèi)到長江口外的鹽度梯度和磷濃度嚴(yán)重影響有害藻華物種的分布[145]。迄今對長江口水域的浮游植物及有害藻華物種的研究以基于形態(tài)分析的鏡檢為主[137,144,146-160]。比如, 對長江口24個站位的72個樣本進(jìn)行的形態(tài)學(xué)鑒定和統(tǒng)計學(xué)分析, 鑒定出 94個物種, 包括骨條藻、東海原甲藻、米氏凱倫藻。發(fā)現(xiàn)不同有害藻華物種引起的不同類型的赤潮在長江口的不同地點同時暴發(fā), 包括一個骨條藻赤潮, 兩個東海原甲藻赤潮, 以及一個米氏凱倫藻赤潮。另外發(fā)現(xiàn)從河口到離岸海域, 赤潮物種逐步從硅藻向甲藻、裸甲藻轉(zhuǎn)變的趨勢[161]。此外近來硅藻有逐步被甲藻替代的趨勢[138]。針對18S rDNA的一個1 001 bp片段的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)長江口水域存在較高的阿米巴藻Amoebophryidae[162]。針對18S rDNA V2-V3的宏條形碼研究發(fā)現(xiàn)長江口附近海域包括很多的甲藻(特別是裸甲藻Gymnodinium和異冒藻Heterocapsa)和硅藻物種(特別是骨條藻)[163]。迄今為止, 還沒有利用宏條形碼方法分析長江口中河流-海水連接帶的浮游植物的相關(guān)研究。

珠江口是一個位于我國南方亞熱帶河口, 連接南海北部大陸架, 其通量僅次于長江口, 全球排第13位。近30年來, 由于工業(yè)發(fā)展, 農(nóng)業(yè)活動, 以及城市化, 珠江口富營養(yǎng)化嚴(yán)重[164]?；谠寮?xì)胞形態(tài)和熒光色素的分析, 發(fā)現(xiàn)珠江口的浮游植物中存在多種有害藻華物種, 包括無紋螺溝藻(Gyrodinium instriatum)、中肋骨條藻、浮動彎角藻、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、三角棘原甲藻(Prorocentrumtriestinum)、叉角藻(Ceratium furca)、血紅哈卡藻、鏈狀裸甲藻、哈曼褐色多溝藻(Pheopolykrikos hartmannii)、雙胞旋溝藻(Cochlodinium geminatum)等[165-173]。珠江口浮游植物組成和動態(tài)分布的季節(jié)性變化, 受包括風(fēng)暴在內(nèi)的環(huán)境因子的影響[172,174-175]。迄今珠江口的宏條形碼研究不多?；趓bcL的宏條形碼的分析展示了珠江口到南海的浮游植物組成, 以及受營養(yǎng)鹽和鹽度梯度影響的分布方式[46]。珠江口河流-海域連接帶的浮游生物在豐水(夏季)和枯水(冬季)之間差異的宏條形碼研究創(chuàng)造性地利用了DNA與RNA的不同特性及其反映的不同狀態(tài), 比較研究了浮游生物的豐度及活性[176]。

3 機遇與挑戰(zhàn)

3.1 宏條形碼分析的穩(wěn)步發(fā)展

由于DNA測序技術(shù)的快速提升, 生物信息學(xué)分析方法的迅速跟進(jìn), 宏條形碼分析也得到了顯著的完善, 經(jīng)歷了三個主要發(fā)展過程： (1)基于對野外樣本的特定分子標(biāo)記(即條形碼)的 PCR擴增、分子克隆和第一代DNA測序技術(shù)的低通量分析。這個階段的主要分析方法是將測序結(jié)果與已知物種的序列合并在一起, 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹, 分析野外樣本的物種組成[10-11,64,162]。(2)基于對野外樣本的特定分子標(biāo)記的PCR擴增, 對測序產(chǎn)物進(jìn)行高通量(第二代DNA測序技術(shù))測序, 利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行 OTU分析,解析野外樣本的物種組成及相對豐度[36,44,163,176-177]。(3)基于PCR擴增、第二代或第三代DNA測序技術(shù),利用ASV分析物種組成及相對豐度[4]。

3.2 宏條形碼分析的競爭優(yōu)勢

與基于形態(tài)觀察和分類的研究方法相比, 宏條形碼研究方法, 具有多方面的顯著優(yōu)勢。(1)分辨率比較高, 能夠區(qū)分隱存種(cryptic species)。在宏條形碼分析中, 分子標(biāo)記中任何差別, 比如只要有單堿基的差別, 都可以通過DNA測序和生物信息學(xué)比較檢測到。因此分辨率比較高。相比而言, 基于形態(tài)觀察的分析方法只能夠分辨出具有顯著區(qū)別的形狀。因此, 基于形態(tài)分析不能分辨的很多不同隱存種,都依據(jù)分子標(biāo)記信息區(qū)分成不同的物種。比如塔瑪亞歷山大藻“復(fù)合種”(“Alexandrium tamarensespecies complex”)根據(jù)分子標(biāo)記信息被區(qū)分為 5種藻：A. fundyense、A. mediterraneum、A. tamarense、A. australiense和A. pacificum[178]。(2)適于開展定量分析。在高分辨率基礎(chǔ)上, 還可以通過測序結(jié)果分析、跟蹤每個不同分子標(biāo)記的數(shù)量, 從而能夠定量分析包括有害藻華物種(以及所有浮游植物、浮游動物)相對豐度在內(nèi)的各種多樣性指標(biāo), 更加準(zhǔn)確地計算浮游植物群落的α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)[179]。(3)宏條形碼分析方法比較容易標(biāo)準(zhǔn)化, 因此比較容易學(xué)習(xí)。相反, 基于形態(tài)學(xué)的分析方法的掌握需要長時間的專業(yè)訓(xùn)練和積累才能夠獲得對不同物種的認(rèn)識, 導(dǎo)致針對相同樣本, 不同研究者可能得到不同的分析結(jié)果, 客觀性比較差。(4)比較容易規(guī)?；? 采樣標(biāo)準(zhǔn)化的宏條形碼方法分析我國各個不同海域,以及相同海域的不同時間點采集的樣本, 并且分析結(jié)果的可比性比較強。相比而言, 基于形態(tài)學(xué)的分析方法由于很大程度上依賴研究者的經(jīng)驗和判斷能力,不同項目的研究結(jié)果往往可比性較低。因此, 宏條形碼分析方法開始應(yīng)用于研究我國近岸海域的浮游植物組成以及動態(tài)變化, 為研究有害藻華的暴發(fā)機理提供了很好的支撐。

3.3 宏條形碼分析帶來的機遇

可以期待, 宏條形碼分析方法將在我國有害藻華研究中起越來越重要的作用。(1)增加不同項目之間的可比性。迄今為止的基于形態(tài)觀察的浮游植物和有害藻華物種調(diào)查研究雖然取得了巨大的成就,描繪出我國近岸海域浮游植物和有害藻華物種的組成和分布。然而, 這些組成和分布研究結(jié)果大多是定性的。未能實現(xiàn)定量分析的原因有很多, 比如, 采集體積 不定量(網(wǎng)采), 研究者的經(jīng)驗和特長不同, 對相同海域的物種鑒定結(jié)果可能不一致, 導(dǎo)致不同研究者獲得的結(jié)果可比性差?；诤陾l形碼的分析將大大提高不同項目之間的定量可比性。(2)發(fā)掘新物種,研究物種的生物地理學(xué)。通過采用規(guī)范性采樣程序,開展高通量測序, 宏條形碼分析可以發(fā)現(xiàn)曾經(jīng)被忽視的浮游植物物種。很多微微型有害藻華物種, 光學(xué)顯微鏡不能充分發(fā)現(xiàn)和區(qū)分, 常常被忽略。比如, 北戴河海域的抑食金球藻正是通過宏條形碼分析得到證實[64]。抑食金球藻的廣泛分布格局也是由宏條碼分析方法實現(xiàn)[66]。宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)海水中大量存在的寄生性甲藻[180]。(3)浮游植物-浮游植物互作。海洋生態(tài)系統(tǒng)中的浮游植物與其他種類浮游植物、浮游動物、浮游微生物之間都存在著多種多樣的相互作用,包括捕食(predator-prey)、共生(host-symbiont)和寄生(host-parasite)[4,181]。

3.4 宏條形碼分析的挑戰(zhàn)

宏條形碼分析具有極大的競爭力, 將在我國浮游植物研究, 特別是有害藻華物種的分布和豐度的動態(tài)研究中起越來越重要的作用。為了確保宏條形碼分析方法釋放更大的威力, 需要突破兩方面的挑戰(zhàn)[182]。

第一個挑戰(zhàn)是高分辨率分子標(biāo)記(即條形碼)的選擇和PCR擴增引物的設(shè)計。(1)選擇對研究對象具有代表性或特異性, 具有高分辨率的分子標(biāo)記。宏條形碼分析中通常使用的分子標(biāo)記包括核糖體RNA基因18S rDNA和28S rDNA, ITS, 線粒體基因CO1,以及葉綠體基因rbcL。使用這些通用分子標(biāo)記的優(yōu)勢是它們都有通用 PCR擴增引物, 并得到充分驗證和應(yīng)用, 具有廣泛的可比性。然而, 這些分子標(biāo)記也有其局限性, 它們往往過于保守, 分辨率有限, 不能夠有效區(qū)分很多同屬物種, 更不能夠區(qū)分同種的不同遺傳株系。除此之外, 這些通用分子標(biāo)記在基因組中往往以多拷貝存在, 而且拷貝數(shù)在不同物種中具有拷貝數(shù)多樣性, 因此這些分子標(biāo)記的測序結(jié)果不能簡單解析其在樣本中的相對豐度。最近證據(jù)表明,有些通用分子標(biāo)記在同一基因組中的多拷貝之間具有序列多樣性, 影響了這些分子標(biāo)記應(yīng)用價值[183]。為了提升分子標(biāo)記對不同物種的分辨率, 可以采用第三代DNA測序技術(shù)測序樣本的全長分子標(biāo)記。也可以通過比較分析, 開發(fā)其他分子標(biāo)記。比如線粒體、葉綠體或核基因組中的高變異區(qū)作為分子標(biāo)記。通用分子標(biāo)記 18S rDNA的通用擴增引物不能很好擴增定鞭藻的信息, 改用 28S rDNA作為分子標(biāo)記,擴增到豐富的定鞭藻的信息[48]。(2)設(shè)計PCR擴增引物, 降低其偏好性。如果PCR擴增引物具有偏好性,測序結(jié)果就不能夠如實反映樣本的組成以及動態(tài)變化規(guī)律。因此, 為了獲得較好的結(jié)果, 選擇適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記, 設(shè)計適當(dāng)?shù)腜CR擴增引物至關(guān)重要。

第二個挑戰(zhàn)是分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫的完整性。針對浮游植物和有害藻華物種的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫包括SILVA[184]和PR2[185]。在通常的宏條形碼分子中, 超過 50%(或更多)的測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中沒有對應(yīng)的參考序列, 因此得不到準(zhǔn)確注釋。隨著數(shù)據(jù)庫不斷更新, 這種情況在逐步得到改善。不過, 我國海域中有很多特有的浮游植物和有害藻華物種。為了獲得對這些物種的覆蓋, 我們需要針對中國特異性物種,充實相應(yīng)的分子標(biāo)記, 完善數(shù)據(jù)庫, 促進(jìn)對我國海域樣本宏條形碼分析結(jié)果的解讀。隨著這些挑戰(zhàn)性問題的解決, 可以預(yù)期宏條形碼方法將會更加有效應(yīng)用于有害藻華物種的研究。

此外, 宏條形碼分析與其他組學(xué)分析技術(shù)比如宏基因組學(xué), 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué), 宏蛋白組學(xué)和宏代謝組學(xué)具有互補的特性。宏條形碼分析集中解析物種組成和相對豐度, 宏基因組學(xué)分析基因組功能, 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白組學(xué)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分析基因表達(dá)以及對環(huán)境的響應(yīng), 宏代謝組學(xué)分析環(huán)境一般的代謝產(chǎn)物。這些組學(xué)技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用將更能發(fā)揮其重要性。