胡章喜 , 尚麗霞 , 鄧蘊(yùn)彥 , 唐贏中

(1. 中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島266071)

1 船舶壓艙水(泥)與有害藻華地理擴(kuò)散

船舶壓載水或壓艙水是 19世紀(jì) 70年代以來遠(yuǎn)洋船舶在空載或輕載時(shí)為保障穩(wěn)定性而從各港口或近海泵入[1], 然而它的大量運(yùn)輸與排放卻可能對(duì)排入地區(qū)的海洋生態(tài)系統(tǒng)造成巨大的負(fù)面影響甚至是嚴(yán)重的生態(tài)災(zāi)害[1-2]。最早可能在19世紀(jì)90年代就已經(jīng)有人認(rèn)識(shí)到浮游植物可能通過壓艙水(泥)地理擴(kuò)散, 但 1908年丹麥哥本哈根大學(xué) Carl Hansen Ostenfeld教授根據(jù)歷史紀(jì)錄推斷1903—1907年在丹麥發(fā)生赤潮的硅藻中華盒形藻(Biddulphia = Odontella sinensis)是通過船舶壓艙水傳入歐洲的[3], 算是學(xué)術(shù)界最早發(fā)表于正式學(xué)術(shù)期刊的相關(guān)研究。1973年在一艘到達(dá)澳大利亞的遠(yuǎn)洋船上檢出了活的浮游動(dòng)物, 算是對(duì)壓艙水導(dǎo)致生物入侵的第一個(gè)確證[4]。經(jīng)過相對(duì)沉寂的幾十年, 直到20世紀(jì)80年代中期科學(xué)界才開始真正意識(shí)到這個(gè)問題的重要性并開始了一系列定量檢測(cè)和研究。1985年Carlton發(fā)表了一篇著名的關(guān)于“壓艙水的生物學(xué)”的綜述[2], 此后至今的三十多年這個(gè)領(lǐng)域開始了爆炸性的發(fā)展, 累計(jì)已發(fā)表了至少500篇文章。根據(jù)對(duì)1955—2013年發(fā)表的近400篇有關(guān)壓艙水的文章分析[1], 它們可以被歸為七大類：(1)種類調(diào)查, (2)遠(yuǎn)海水交換的效率, (3)壓艙水處理系統(tǒng)或工藝的效率, (4)新的分析方法或手段, (5)港口的生物調(diào)查, (6)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估, (7)不同方向或課題的綜述。從中可以看到, 最初的工作主要是對(duì)壓艙水中種類組成的調(diào)查, 20世紀(jì)90年代后期開展不同航運(yùn)方式的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及不同種類的環(huán)境耐受性的研究增多且占據(jù)主流, 2000年以后主要研究不同處理方式或策略的效果以及繼續(xù)研究更準(zhǔn)確、更具代表性的采樣、分析、檢測(cè)技術(shù)。值得一提的是, 2007年國際著名同時(shí)也是有害藻華領(lǐng)域唯一的專業(yè)學(xué)術(shù)期刊Harmful Algae出版了第一個(gè)有關(guān)壓艙水傳播與有害藻華地理擴(kuò)散關(guān)系研究的?？?。2018年, 另一專業(yè)期刊Journal of Sea Research也出版了一期有關(guān)壓艙水的專刊, 內(nèi)容包括了當(dāng)今世界上很多本領(lǐng)域重要科學(xué)家的研究文章或綜述, 如2015年由7個(gè)國家的19個(gè)研究人員在一艘從佛德角到德國洪堡的船上開展的現(xiàn)場(chǎng)聯(lián)合研究結(jié)果, 包括試驗(yàn)處理設(shè)備、處理方法、檢測(cè)方法的有效性[4]。大量的研究不僅引起了更廣泛的學(xué)術(shù)界關(guān)注, 也引起了很多國家和政府間組織的高度重視。因此, 國際海事組織(Intergovernmental Maritime Organization, IMO)在1993年和1997年分別出臺(tái)了一個(gè)關(guān)于壓艙水管理的指導(dǎo)性規(guī)范, 2004年2月 13日在倫敦召開的成員國外交大會(huì)上更是通過了具有法律約束性的國際公約即《控制和管理船舶壓艙水和沉積物國際公約, The International Convention for the Control and Management of Ship’s Ballast Water and Sediment, BWM Convention》(以下簡(jiǎn)稱壓艙水公約)[5]。該公約對(duì)船舶壓艙水的排放標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定, 2017年9月8日正式生效。而按照相關(guān)程序, 該公約于2019年1月22日起對(duì)我國正式生效。全球現(xiàn)共有78個(gè)國家/地區(qū)加入了壓艙水公約, 占世界商船總噸位的77.19 %。據(jù)10年前的估計(jì), 全世界每年通過商船排放的壓艙水至少35億噸[6]。而對(duì)我國約25個(gè)主要港口的統(tǒng)計(jì), 每年進(jìn)出我國沿海水域的壓艙水有數(shù)十億噸之多, 實(shí)為全球之最?？梢? 該公約無論從什么方向看都將對(duì)我國產(chǎn)生重要影響。我國加入壓艙水公約, 不僅意味著懸掛我國國旗的國際航行船舶必須滿足該公約要求, 同時(shí)意味著我國也可以對(duì)泊靠在中國港口的外籍船舶按照該公約實(shí)施對(duì)壓艙水(泥)的港口國檢查。

自2004年壓艙水公約出臺(tái)以來, 我國有關(guān)部門向 IMO提出了多項(xiàng)壓艙水管理相關(guān)提案, 有的提案已經(jīng)被采納。有些大學(xué)和研究院所的研究人員還從開發(fā)、發(fā)展壓艙水處理技術(shù)方面開展了研究, 如氯化處理[7]、強(qiáng)電場(chǎng)電離放電[8-9]、柴油機(jī)余熱加熱[10]、微孔過濾與紫外輻射結(jié)合處理[11]、低溫等離子體處理[12]等。還有一些關(guān)于壓艙水(泥)中外來生物特別是微藻的檢測(cè)研究(見后述)。2017年, 科技部立項(xiàng)了由國內(nèi)多家科研單位承擔(dān)的一項(xiàng)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃, 其中就包括《我國近海外來生物入侵災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)防控技術(shù)和裝備研發(fā)》的課題。這都是對(duì)公約第 6條要求各當(dāng)事國單獨(dú)或聯(lián)合努力促進(jìn)、推動(dòng)壓艙水管理的科技研究的積極響應(yīng)。有關(guān)職能部門如河北海事局已經(jīng)開始起草《壓載水取樣與檢測(cè)技術(shù)要求》和《船舶壓載艙沉積物港口接收設(shè)施技術(shù)要求》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn), 國家檢驗(yàn)檢疫局(現(xiàn)屬海關(guān)總局)還于2017年在江陰分局成立了壓艙水檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。這些都為我國進(jìn)行壓艙水和(底泥)管理、處理奠定了良好的基礎(chǔ)?？傊? 如何對(duì)進(jìn)出中國海域的巨量壓艙水(泥)進(jìn)行檢驗(yàn)與管理以防止外來生物的入侵, 如何因應(yīng)壓艙水公約的全面實(shí)行從而維護(hù)航運(yùn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的同時(shí)推動(dòng)我國水域生態(tài)環(huán)境保護(hù), 是擺在海事管理機(jī)構(gòu)面前的一個(gè)重要課題, 也是從事海洋生態(tài)學(xué)和環(huán)境保護(hù)的研究群體面前的重要研究課題。

海洋有害藻華(Harmful algal blooms, HABs)是一類重要的海洋生態(tài)災(zāi)害, 過去幾十年以來在世界范圍內(nèi)頻繁暴發(fā), 并呈現(xiàn)增加的態(tài)勢(shì), 而且若干藻華種類還表現(xiàn)出向其他國家和地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)[13-15]。有害藻華為何在世界范圍頻發(fā)和地理擴(kuò)散, 除水體富營養(yǎng)化是一個(gè)已經(jīng)取得全世界有害藻華生態(tài)學(xué)家共識(shí)的最重要的外在原因[13-14]和全球氣候變暖的影響之外, 許多研究證明和很多重要的科學(xué)家都認(rèn)為通過船舶壓艙水及其壓艙泥傳播也是非常重要的外部原因[16-21]。如Hallegraeff教授1993年在分析世界范圍有害藻華呈現(xiàn)增加趨勢(shì)的原因時(shí)給出了四個(gè)可能的因素： (1)有害藻華在全球范圍得到重視后增加了有關(guān)的研究; (2)近海養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展; (3)人類活動(dòng)引起的富營養(yǎng)化及氣候變化(如變暖); (4)甲藻孢囊通過船舶壓艙水的異地入侵[22]。在最近剛剛出版的、有全世界眾多著名有害藻華領(lǐng)域的科學(xué)家合作的《Global Ecology and Oceanography of Harmful Algal Blooms》一書的前言中, 包括我國有害藻華研究領(lǐng)域領(lǐng)軍人周名江研究員在內(nèi)的五位主編認(rèn)為： “可以肯定, 全球范圍的有害藻華發(fā)生的數(shù)量、頻次、范圍和持續(xù)時(shí)間在過去的幾十年間都在增加。還可以肯定的是這其中很多是由人類活動(dòng)引起的, 如更多的營養(yǎng)鹽輸入和船舶壓艙水或者水產(chǎn)養(yǎng)殖種類引種導(dǎo)致的藻華生物入侵”[15]。

據(jù)統(tǒng)計(jì), 在所有海洋微藻藻華事件中, 其中75%是由甲藻引起的[23], 而且許多種類還會(huì)產(chǎn)生各種毒素。甲藻是一類最具有生態(tài)學(xué)重要性的浮游植物, 除引起有害藻華和產(chǎn)生毒素外, 也是海洋尤其是近海的重要初級(jí)生產(chǎn)者, 而且核糖體DNA測(cè)序結(jié)果表明它們?cè)诒韺雍Ｑ笤镏姓剂舜蟾?0%[24]。甲藻一個(gè)很重要的生物學(xué)特征是其許多種類包括藻華種類在生活史中可以形成休眠孢囊。甲藻的這一特征在其生態(tài)學(xué)上具有十分重要的意義。首先, 孢囊由于其較厚的孢囊壁從而能夠抵抗惡劣環(huán)境, 在海洋沉積物中可長期存活(幾個(gè)月到長達(dá)上100年), 而在環(huán)境條件合適時(shí)萌發(fā), 一如高等植物的種子, 從而為一個(gè)地域的種群繁衍以致藻華提供種源(seeds)[25-26]。其次, 孢囊對(duì)極端環(huán)境的耐受性(黑暗、缺氧、低溫、pH等)和存活能力也使其更容易通過人為或自然過程進(jìn)行地理擴(kuò)散, 如通過養(yǎng)殖貝類的異地引種和通過壓艙水及其沉積物(以下簡(jiǎn)稱壓艙泥)傳播[16-17,21-22]。已故國際著名有害藻華生態(tài)學(xué)家、Harmful Algae前主編Smayda教授說過： “那些被明確認(rèn)為是通過船舶壓艙水傳播從而異地形成有害藻華的種類無例外的都是產(chǎn)孢囊或者休眠細(xì)胞的種類”[21]。因而, 我們可以反過來推論： 那些可以產(chǎn)生休眠孢囊的甲藻理論上都可以通過壓艙泥進(jìn)行異地?cái)U(kuò)散。孢囊在極端環(huán)境下的耐受性和存活能力既影響甚至決定了壓艙水(泥)的處理方式的選擇,也影響和決定著處理效果檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與選擇。更進(jìn)一步, 在我們針對(duì)防范有害藻華通過壓艙水傳播的檢測(cè)或者處理技術(shù)的評(píng)估中, 都應(yīng)該以壓艙泥中的甲藻孢囊作為最主要的檢測(cè)或者研究?jī)?nèi)容。

從20世紀(jì) 90年代起, 中國有害藻華(主要是甲藻)的發(fā)生頻率、規(guī)模和面積(即時(shí)空廣度)不斷增大,對(duì)我國沿海養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)資源、漁產(chǎn)品質(zhì)量、生態(tài)環(huán)境、人類健康構(gòu)成了重大的危害和威脅, 有些還會(huì)給海洋生態(tài)系統(tǒng)健康(如對(duì)生物多樣性的影響)和核電設(shè)施構(gòu)成威脅[25,27-29]。在有害藻華發(fā)生頻次、規(guī)模、危害程度增加的同時(shí), 特別值得關(guān)注的是新的有毒有害藻華甲藻的種類數(shù)也在最近十幾年不斷發(fā)現(xiàn)[30-31], 如太平洋亞歷山大藻或鏈狀亞歷山大藻[32]、劇毒卡爾藻(Karlodinium veneficum)[33-36]、多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides, 即多環(huán)旋溝藻)[37]、褐色馬格里夫藻(Margalefidinium fulvescens, 即褐色旋溝藻)[38],Azadinium poporum[39]、Takayama xiamenensis[40]、寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)[41]和若干從沉積物孢囊萌發(fā)而發(fā)現(xiàn)的若干新紀(jì)錄種和新種, 如Gymnodinium microreticulatum[42]、Gymnodinium inusitatum[42]、Scrippsiella enormis[43]、Azadinium dalianense[44]。邏輯上很自然的, 新出現(xiàn)的藻華類型和新發(fā)現(xiàn)的種類是本來就已經(jīng)長期存在于中國還是外源入侵種就成為一個(gè)具有重要科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義的問題。要回答此問題, 就必須從可能的外源傳播途徑如壓艙泥和我國海域沉積物二個(gè)方面開展工作。雖然可能通過壓艙水(泥)傳播的外源生物包括各種動(dòng)物(特別是浮游動(dòng)物)、浮游植物、真菌、細(xì)菌到病毒, 但本文關(guān)注的是最主要的有害藻華原因類群-甲藻的休眠孢囊, 故以下對(duì)國內(nèi)外研究進(jìn)展的敘述只包括甲藻, 偶或涉及其他有害藻華類群。

2 國內(nèi)外有關(guān)壓艙泥中甲藻孢囊多樣性的檢測(cè)與溯源

船舶壓艙水及其底泥很早就被證明是外源浮游生物入侵的重要攜帶者[16,20-21]。其中, 有害藻華種類隨壓艙水(泥)傳播更是在最近二十年引起廣泛關(guān)注和擔(dān)憂。自 1908年 Ostenfeld[3]發(fā)表他推斷 1903—1907年在歐洲暴發(fā)赤潮的中華盒形藻是通過壓艙水傳入的文章后, 有關(guān)研究沉寂了 70多年[2]。一直到1985年伍茲霍爾海洋研究所的被稱為“海洋入侵種(研究)先驅(qū)”(“Marine Invasive Species Pioneer”)[1]的Carlton 發(fā)表著名的關(guān)于“壓艙水生物學(xué)”的全面綜述并提出了一個(gè)海洋生物通過壓艙水(泥)入侵定居的四階段概念模型才掀起了一個(gè)關(guān)于壓艙水研究的高潮, 從那時(shí)以來已經(jīng)發(fā)表了至少 500篇以上的研究文章。

在眾多對(duì)壓艙水中浮游植物的檢測(cè)中, 不少研究早就發(fā)現(xiàn)壓艙水中的浮游植物種類會(huì)因?yàn)楦∮蝿?dòng)物捕食、黑暗、缺氧、溫差等原因隨時(shí)間(航行距離)很快減少[45-47]。而甲藻由于能夠在脅迫條件下形成休眠孢囊沉入壓艙泥, 從而保持長期存活[48]。所以,雖然在剛剛泵入壓艙水時(shí)取樣在水中能夠找到較多的甲藻(營養(yǎng)細(xì)胞)和其他浮游植物, 但在長時(shí)間航行之后(如半個(gè)月或以上), 在到港的壓艙泥中反而會(huì)保留比壓艙水中多很多的甲藻種類[17,49-50]。而由于休眠孢囊對(duì)環(huán)境脅迫具有更大的抗性和適應(yīng)性[25,51], 其入侵風(fēng)險(xiǎn)也要高于壓艙水中以營養(yǎng)細(xì)胞存在的種類。由于壓艙水公約的要求首先是針對(duì)水而不是泥,且需要檢測(cè)、達(dá)標(biāo)的是所有生物(除了我們關(guān)心的浮游植物, 還有大者如蝦蟹, 小如細(xì)菌病毒), 所以國內(nèi)外大量的研究, 尤其是那些意在評(píng)價(jià)處理方法效果的隨船跟蹤監(jiān)測(cè), 把注意力更多地傾注于對(duì)壓艙水而不是壓艙泥的檢測(cè)。

20世紀(jì)80年代末至90年代初, 澳大利亞塔斯馬尼亞大學(xué)的Hallegraeff教授實(shí)驗(yàn)室對(duì)形成有害藻華藻類特別是甲藻和硅藻的休眠孢囊通過船舶壓艙水傳播從而地理擴(kuò)散的國際共識(shí)作出了奠基性的貢獻(xiàn)[16-17]。他們通過對(duì)澳大利亞18個(gè)港口中的343艘船只的壓艙水及壓艙泥進(jìn)行調(diào)查(光鏡和掃描電鏡觀察以及孢囊萌發(fā)試驗(yàn)), 發(fā)現(xiàn)所有的沉積物樣品中都存在大量硅藻和硅藻休眠孢子(resting spore), 包括大量澳大利亞本地沒有的種類, 50%的沉積物樣品中存在總共53種甲藻孢囊(resting cyst), 其中包括許多非本地種,有 20種孢囊和孢子得到成功萌發(fā)。尤其引人注意的是, 16艘船的壓艙泥中檢測(cè)出麻痹性貝毒(PSP毒素)原因種塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense, 根據(jù)最新關(guān)于塔瑪復(fù)合體的分類, 該種極可能是A. australiense, 澳洲亞歷山大藻)、鏈狀亞歷山大藻(A.catenella=A. pacificum, 太平洋亞歷山大藻)和鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum), 最多的單個(gè)壓艙底泥中攜帶3億個(gè)塔馬亞歷山大藻孢囊[17]。他們的研究結(jié)果直接推動(dòng)了澳大利亞檢驗(yàn)檢疫部門于 1991年制定了有關(guān)壓艙水管理和控制的法規(guī)[30]。自那以后, 不同國家和實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家繼續(xù)從壓艙泥中開展甲藻孢囊的檢測(cè)。如Macdonald[52]從90%的到岸英國運(yùn)輸石油天然氣的貨輪壓艙泥樣品中檢出甲藻孢囊。Hamer等[53]從到達(dá)英格蘭和威爾士港口船只的壓艙泥中檢出48種甲藻孢囊, 包括有毒的、形成藻華的、本地沒有的種類。Burkholder等[46]從美國軍用船只壓艙水中檢出了 33種甲藻, 包括重要的有害有毒種類如Dinophysis acuminata, 劇毒卡爾藻(Karlodinium veneficum), 微小原甲藻(Prorocentrum minimum)。較重要的是, Casas-Monroy等[54]從加拿大東西海岸和大湖區(qū)的147條船的壓艙泥中檢出60種甲藻孢囊, 尤其是檢出了當(dāng)?shù)馗劭诤Ｓ蛭丛l(fā)現(xiàn)過的劇毒的魚毒性甲藻多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)。

前面列舉的從壓艙泥中鑒定甲藻孢囊的工作都是通過光鏡或掃描電鏡的形態(tài)觀察, 也有少數(shù)情況通過挑取單孢囊萌發(fā)[16-17,53,55-56]。但是, 除了耗時(shí)費(fèi)力以外, 形態(tài)鑒定或孢囊萌發(fā)都需要專業(yè)的訓(xùn)練,甚至是分類專家也會(huì)覺得非常困難, 因?yàn)椴煌N類孢囊可能形態(tài)極為相似, 或形態(tài)高度簡(jiǎn)單, 或孢囊體積極小, 或分類學(xué)特征難以判別。這樣, 錯(cuò)誤鑒定就很常見, 甚至難以避免[57-58]。但分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為我們準(zhǔn)確鑒定孢囊種類提供了多種選擇, 如熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、熒光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、單細(xì)胞PCR(single-cell PCR)等。分子技術(shù)甚至可以幫助我們對(duì)某地新出現(xiàn)的種類進(jìn)行溯源[59-62]。比如, 至今最可靠的一個(gè)例證是 Hallegraeff實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用分子標(biāo)記, 輔之以沉積物的同位素定年和分子進(jìn)化分析, 令人信服地推斷出現(xiàn)在澳洲塔斯瑪利亞的塔瑪亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻非?？赡苁?00多年前通過運(yùn)木材的船從日本、韓國或其他東南亞國家攜帶過來的[20,63]。最近的例子是Garrett 等[55]通過LSU rDNA和ITS序列分析, 推斷從一艘經(jīng)全球航行?？糠鹆_里達(dá)坦帕灣港的商船中壓艙泥樣品中分離的有毒甲藻Vulcanodinium rugosum很可能起源于日本, 因?yàn)榉肿舆M(jìn)化分析表明其與新西蘭本地以及法國的種群有別, 但與日本種群完全吻合。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing,NGS)的成熟, 其高通量、靈敏性、特異性、自動(dòng)化等特征可以使之應(yīng)用于大量環(huán)境樣品的快速檢測(cè), 因此可望在壓艙泥甲藻孢囊的檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有巨大的應(yīng)用前景。Zaiko等[64]曾經(jīng)建議過應(yīng)用此技術(shù)于壓艙水(泥)的檢測(cè), 但在我們下節(jié)將要介紹的本實(shí)驗(yàn)室最近的工作之前, NGS還沒有被應(yīng)用到這一領(lǐng)域。

我國開展有關(guān)壓艙水(泥)的研究主要都是在2004年IMO的壓艙水公約出臺(tái)之后(除個(gè)別例外)。李偉才等[65]于 2003—2004年對(duì)日照港和鄰近錨地水域及其船舶壓艙水中的浮游植物進(jìn)行了調(diào)查, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)壓艙水中含有較高的有害物種, 從 23艘日照港口的入境船舶壓艙水樣品中鑒定了浮游植物41種(硅藻36種, 甲藻4種, 金藻1種)。楊清良等[66]檢測(cè)了2006—2007年間福建省4個(gè)港口12艘外輪的壓艙水樣品, 檢出浮游植物7門86屬240種(包括60種赤潮生物)和浮游動(dòng)物5門30屬52種。張金鵬等[67]檢測(cè)了5艘廈門港國際船舶的14個(gè)壓艙水水樣中的硅藻, 檢出硅藻37屬111種, 其中赤潮種28種, 潛在有毒種1種, 非本海域種6種。楊清良等[68]又從壓艙水中檢出分屬于7個(gè)浮游植物門類和5個(gè)動(dòng)物門類的309種壓艙水生物(包括 60種赤潮生物), 還從來自東南亞港口的船舶壓艙水中檢出了 12種福建口岸本地及鄰近海域從未記錄的 12 種淡水和半咸水藻類?？梢钥吹? 這些初步研究都是只檢測(cè)壓艙水樣品, 所檢出的以硅藻為主, 因?yàn)槭堑桨洞? 所以甲藻種類較少。而對(duì)壓艙泥中甲藻孢囊的檢測(cè), 迄今只見到戴鑫烽等[69]用光學(xué)顯微鏡方法鑒定?？恐凵礁鄣?艘商船壓艙泥樣品的工作, 共鑒定出 24種甲藻孢囊, 3種未知種孢囊, 也發(fā)現(xiàn)4份樣品中甲藻孢囊的種類組成具有明顯差異, 但均檢測(cè)出能產(chǎn)生麻痹性貝毒的甲藻孢囊種類, 如亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻?？偫ǘ? 由于起步較晚或者認(rèn)識(shí)不足, 我國開展的壓艙泥甲藻孢囊的工作還極少或者初步(如只有光鏡鑒定一種手段), 有害藻華研究群體對(duì)基本的風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)識(shí)因?yàn)楦鞣N條件限制(如很難采集到壓艙水樣品, 壓艙泥樣品因?yàn)榧夹g(shù)上的限制更難)還很不充分, 而且對(duì)我們中國海域的本底情況即甲藻種類區(qū)系還沒有全面的了解, 所以很難判斷是否存在壓艙水帶來的生態(tài)入侵及其風(fēng)險(xiǎn)有多大。研究的整體水平和受重視程度不僅與美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、德國、日本的差距很大, 與我們國家作為海洋大國、貿(mào)易大國的地位極不相稱, 對(duì)我國生物多樣性保護(hù)、防范生物入侵和外來有毒有害種類暴發(fā)藻華,以及應(yīng)對(duì)貿(mào)易爭(zhēng)端和制定反制措施甚為不利, 對(duì)認(rèn)識(shí)我國生物多樣性本底狀況也甚為不利。

3 美國港口船舶壓艙泥中甲藻孢囊具有很高的種類多樣性和樣品間的異質(zhì)性

我們自2015年起與美國歐道明大學(xué)Dobbs教授合作, 通過應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的特異性引物、高通量二代測(cè)序、生物信息學(xué)分析、光鏡和掃描電鏡觀察、單孢囊PCR克隆測(cè)序等手段, 研究了2001—2003年采自?？吭诿绹蠛^(qū)(the Great Lakes)和切薩皮克灣(Chesapeake Bay)的23艘船舶壓載艙的32份底泥樣品中甲藻孢囊的種類多樣性(樣品在 4℃黑暗條件下已經(jīng)保存 12～14年), 并由此獲得了一系列非常重要的結(jié)果和認(rèn)識(shí)(圖1)[70]。這也是國際上首次采用高通量測(cè)序和分子條形碼技術(shù)檢測(cè)壓艙泥中的甲藻孢囊。

首先, 我們?cè)趬号摰啄嘀袡z測(cè)到了很高的甲藻種類多樣性。32個(gè)樣品平均每個(gè)得到 79個(gè) OTUs (operational taxonomy unit, 可以簡(jiǎn)單理解為相當(dāng)于種的分類單元)。在 801個(gè)甲藻 OTUs中, 包括至少 10目30科63屬, 特別是有高達(dá)62%的OTUs不能注釋到GenBank中任何已知種類[間隔區(qū)(gaps)＞ 50 bps, 覆蓋長度＜ 85%, 或相似性＜ 80%]。需要說明的是, 這不是所采用方法的限制, 而是因?yàn)樽匀唤绱嬖谥罅窟€沒有被人們發(fā)現(xiàn)、研究、描述的種類。即使在307個(gè)得到很好注釋的OTUs中, 也有51個(gè)OTUs在GenBank最近的參考序列沒有注釋或鑒定到種。所以, 加起來就有68%或545個(gè)OTUs很可能都是還未被研究過的新種甚至新的屬、科、目。另外的256個(gè)OTUs 被完全注釋到 71個(gè)種(注： 因?yàn)榉N下遺傳多樣性甚至種下的不同生態(tài)型以及隱存種, 很多 OTUs會(huì)被注釋到一個(gè)種, 如61個(gè)OTUs 注釋到Scrippsiella acuminata), 其中 56個(gè)種還從未在此前的壓艙泥中被發(fā)現(xiàn)報(bào)道過(即本研究為首次報(bào)道)。我們完全鑒定的 73個(gè)種(包括2個(gè)通過單孢囊PCR克隆測(cè)序獲得鑒定)使得迄今為止文獻(xiàn)中報(bào)道的從壓艙泥中檢測(cè)到的甲藻種類達(dá)到142種(本研究占50 %)。我們從壓艙泥中獲得如此高的甲藻種類多樣性, 是通過傳統(tǒng)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)鑒定無論如何難以獲得的。

第二, 我們觀察到樣品間種類組成的高度異質(zhì)性(heterogeneity)。表現(xiàn)在四個(gè)方面： (1)雖然有16個(gè)OTUs在超過50 %的樣品中檢出, 但沒有一個(gè)OTU在所有32個(gè)樣品中都出現(xiàn); (2)把32個(gè)樣品按照停泊港口分為5組進(jìn)行維恩圖分析發(fā)現(xiàn), 只有31個(gè)OTUs為 5組樣品所共有(都是常見的產(chǎn)孢囊種類); (3)PCoA分析也清楚地表明, 樣品間, 甚至同一條船不同艙的樣品間, 其種類組成也有很大差異; (4)分別有366和146個(gè)OTUs只在1個(gè)或2個(gè)樣品中檢出, 絕大部分都是還未被描述的種類。毫無疑問, 這種異質(zhì)性是由不同船舶的航線和航行歷史以及不同壓水艙的注水歷史造成的。

第三, 在我們完全鑒定的73種甲藻中, 有36種藻華原因種, 18種有毒種(如5種亞歷山大藻Alexandrium affine,A. fundyense,A. ostenfeldii,A. pacificum,A.pseudogonyaulax,Gymnodinium catenatum,Azadinium poporum,A. polongum,Karenia cristata,K. papilionacea,Apocalathium aciculiferum,Margalefidinium polykrikoides,Margalefidinium fulvescens), 23種此前未報(bào)道過能產(chǎn)生孢囊, 9種直徑小于15 μm (其中只有一種此前在壓艙泥中檢測(cè)到), 34種為近10年內(nèi)新描述的種, 56種為首次在壓艙底泥中報(bào)道。這里列出的每一個(gè)數(shù)字都具有值得深思的重要意義。

圖1 壓載艙底泥中甲藻孢囊的種類多樣性研究流程(包括通過應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的特異性引物、高通量二代測(cè)序、生物信息學(xué)分析、光鏡和掃描電鏡觀察、單孢囊PCR克隆測(cè)序等手段)和主要研究結(jié)果[70]Fig. 1 Analytical procedures for dinoflagellate resting cyst biodiversity in ballast tank sediments (including the design of specific primers targeting the D2 domain of LSU rDNA, high-throughput sequencing, bioinformatics analysis, light and scanning electron microscopy observation, and single-cyst PCR sequencing) and the main research results[70]

第四, 為驗(yàn)證上述的高通量測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果(證明檢測(cè)到的種類為孢囊), 我們從壓艙泥中通過挑取單孢囊和單細(xì)胞PCR測(cè)序鑒定檢測(cè)到7種孢囊, 其中有二個(gè)種的孢囊即多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)和寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)特別重要(見圖 2), 值得在此討論。多環(huán)馬格里夫藻是世界廣布的裸甲藻, 經(jīng)常形成大規(guī)模有害藻華, 對(duì)水生生物有劇毒[71-72], 對(duì)其他浮游植物具有強(qiáng)烈化感作用[73], 已證明能形成休眠孢囊[74-75], 而且過去三十年在全球呈現(xiàn)出非常明顯的地理擴(kuò)散趨勢(shì)[76]。該藻1998年在我國香港和2010年以來在我國東海、黃海膠州灣海域有過暴發(fā)不同規(guī)模藻華的記錄。該藻在全球不同海域的種群在LSU rDNA序列上具有較大的遺傳差異, 或者種群遺傳分化, 從而被分為四種核糖體型(美洲/馬來西亞型、東亞型、菲律賓型、地中海型)[77-78]。有趣的是我們從二條船的壓艙泥中分別分離、鑒定到其中的美洲/馬來西亞核糖體型和東亞核糖體型, 這是形態(tài)學(xué)鑒定不能識(shí)別出來的。寶石多溝藻自 2006年以來在我國珠江口海域連年暴發(fā)藻華[79], 我們最近的研究證明該種其實(shí)在中國四大海域都有分布,但以南海海域最常見、豐度上南高北低, 似乎有自南向北的擴(kuò)散趨勢(shì)(尚未發(fā)表數(shù)據(jù))。除我國外, 此前只在澳大利亞和日本報(bào)道過。因此, 我們上述結(jié)果既為有害甲藻可通過壓艙泥傳播和入侵提供新的個(gè)例, 也對(duì)我國近些年才出現(xiàn)的這二種有害藻華藻提出了它們是本地種還是入侵種的重要問題。

圖2 從壓艙泥中通過挑取單孢囊和單細(xì)胞PCR測(cè)序鑒定出來的多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)和寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)孢囊Fig. 2 Resting cysts of Margalefidinium polykrikoides andPolykrikos geminatum identified by single-cell PCR,cloning, and sequencing from ballast tank sediments.Note： cysts of A and B were Margalefidinium polykrikoides, belonging to the American/Malaysian ribotype; the cyst in C was Margalefidinium polykrikoides, belonging to the East Asian ribotype; and the cyst in D was Polykrikos geminatum[70]

需要說明的是, 對(duì)于可能有人質(zhì)疑高通量測(cè)序檢測(cè)到的是否為孢囊, 我們有若干理由表明它們最可能是孢囊, 雖然來自營養(yǎng)細(xì)胞及其 DNA殘留的可能性尚不能完全排除： (1)樣品在 4℃環(huán)境下已經(jīng)保存12～14年, 營養(yǎng)細(xì)胞的DNA應(yīng)該基本被降解; (2)我們檢測(cè)到的豐度最高、在樣品中出現(xiàn)頻率最高的種類基本上都是在海洋沉積物中常見的(Pelagodinium béii=Gymnodinium béii除外, 因?yàn)槠涫欠癞a(chǎn)孢囊尚未見諸于文獻(xiàn)); (3)得到完全鑒定的種類中超過 70%是文獻(xiàn)中已經(jīng)證明為產(chǎn)孢囊的種類; (4)我們光鏡和電鏡觀察確乎看到了大量孢囊種類, 其中多數(shù)都是根據(jù)形態(tài)難以鑒定的(現(xiàn)代甲藻孢囊研究的先驅(qū)、奧斯陸大學(xué)Barrie Dale教授在本實(shí)驗(yàn)室訪問研究時(shí)也難以通過形態(tài)鑒定); (5)我們通過單孢囊 PCR測(cè)序鑒定的 7種孢囊就包括了高通量測(cè)序得到的種類Polykrikos geminatum和Scrippsiella acuminata, 及沒在高通量測(cè)序中確證的Apocalathium malmogiense和二種核糖體型的多環(huán)馬格里夫藻。

4 科學(xué)問題與研究方向

從我們最近的工作及與文獻(xiàn)報(bào)道的工作比較,我們可以得到這樣幾個(gè)結(jié)論：

(1) 由于方法的限制(光學(xué)顯微鏡為主)、分類學(xué)的滯后(還有“一個(gè)隱藏的世界”等待發(fā)現(xiàn))[80]和樣品覆蓋面有限, 對(duì)通過壓艙泥攜帶、傳播的甲藻孢囊的種類多樣性和有毒有害甲藻的種類被很大程度地低估了。換句話說, 通過壓艙泥傳播有害藻華甲藻的風(fēng)險(xiǎn)可能比以前認(rèn)識(shí)的還要大。有趣的是, 近20年前有人做過同樣的呼吁： “雖然有很多證據(jù)了, 但壓艙水傳播的浮游植物多樣性可能還是沒有充分的被人認(rèn)識(shí)到”[19]。這一觀點(diǎn)今天仍然成立。

(2) 從我們的研究可以判斷, 迄今為止, 基于光鏡下形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)船舶壓艙泥中甲藻孢囊種類的檢測(cè)不可能獲得對(duì)壓艙泥中孢囊種類多樣性的全面認(rèn)識(shí)。形態(tài)學(xué)方法能夠鑒定那些細(xì)胞較大、形態(tài)特征明顯、豐度高、有參考圖譜的種類, 反之, 對(duì)孢囊體積很小(＜ 20 μm)、形態(tài)高度簡(jiǎn)單(球形)或相似、缺少鑒別性特征、豐度較低、新描述或命名的種類就不易甚至不可能鑒定出來, 更不用說大量尚未被發(fā)現(xiàn)和描述的種類了。相較之下, 從對(duì)大量樣品中進(jìn)行種類的準(zhǔn)確鑒定而言, 只要采用的分子條形碼適當(dāng)和測(cè)序深度足夠, 應(yīng)用高通量二代測(cè)序具有毋庸置疑的優(yōu)越性。特別需要指出的是, 對(duì)于那些現(xiàn)在還不能完全鑒定的種類, 所獲得的特征性基因序列數(shù)據(jù)庫將為以后的入侵種溯源和譜系地理學(xué)研究提供重要的數(shù)據(jù)資源。

(3) 此前的研究和綜述文章都未曾對(duì)船舶間甚至一艘船不同艙的樣品間的種類組成的高度異質(zhì)性予以重視。很明顯, 這是由船舶的整個(gè)航行歷史決定的, 如泵入壓艙水的海域、航行路線與距離、是否清洗壓艙水艙、是否采取處理措施等。邏輯上, 其實(shí)這也可以理解, 正是因?yàn)槊糠N甲藻都有其自然的地理分布范圍, 才有這種不同船舶間種類組成的異質(zhì)性,也才有外源生物入侵的風(fēng)險(xiǎn)與擔(dān)憂, 也才有通過壓艙泥的檢測(cè)對(duì)入侵種類進(jìn)行溯源的可能性。

從壓艙水處理技術(shù)、工藝、設(shè)備研究和開發(fā)領(lǐng)域的角度看, 種類多寡或風(fēng)險(xiǎn)高低對(duì)其影響不大。但從有害藻華生態(tài)學(xué)和壓艙水(泥)的檢驗(yàn)檢疫角度,則不能采取這樣實(shí)用主義的立場(chǎng)。因?yàn)? 我們要對(duì)可能已經(jīng)發(fā)生的和未來可能發(fā)生的入侵風(fēng)險(xiǎn)做出更明確的實(shí)證性評(píng)估和開展追根溯源研究, 要對(duì)壓艙水(泥)中可能帶來的重要種類采取針對(duì)性的檢測(cè)和追溯來源國家或港口(但只有知道了哪些種才能開發(fā)特異性的檢測(cè)技術(shù))。因此, 根據(jù)上文對(duì)國內(nèi)外研究的綜述和對(duì)我們最近的相關(guān)工作的簡(jiǎn)述, 提煉出了研究有害藻華種類通過壓艙水(泥)入侵的科學(xué)問題和基本技術(shù)路線：

(1) 外源有害藻華通過壓艙水(泥)入侵中國的風(fēng)險(xiǎn)到底有多高？我們認(rèn)為此問題實(shí)際上可以轉(zhuǎn)換為下列二個(gè)問題： 進(jìn)入中國港口的船舶壓艙泥中的甲藻孢囊種類清單與中國海域沉積物中的孢囊種類有哪些不同？不同來源的壓艙水底泥中的甲藻孢囊清單或名錄之間存在的差異與船舶航行歷史有多大的關(guān)系？已有工作基礎(chǔ)讓我們確信, 只有同時(shí)獲取足夠數(shù)量和代表性的壓艙泥樣品和中國海域的沉積物樣品并對(duì)之進(jìn)行比較完備的檢測(cè), 才能對(duì)到底有多高的入侵風(fēng)險(xiǎn)做出更明確的評(píng)估。簡(jiǎn)單言之, 當(dāng)壓艙泥中含有中國海域沉積物中沒有的有毒有害種類越多, 則由船舶壓艙水(泥)帶來的外來種入侵風(fēng)險(xiǎn)就越高。因此, 我們必須獲得和對(duì)照中國海域沉積物中和更多不同來源的到港船舶壓艙泥中甲藻孢囊清單,以此為基礎(chǔ)評(píng)估壓艙水(泥)帶來的有害藻華種類入侵我國海域的可能風(fēng)險(xiǎn), 建立重點(diǎn)檢測(cè)種類的名錄。

(2) 我們通過高通量測(cè)序從壓艙泥中檢測(cè)到的種類, 特別是以前從未從壓艙水及其沉積物報(bào)道的種類和還沒有報(bào)道產(chǎn)孢囊的種類, 到底來自于孢囊還是營養(yǎng)細(xì)胞或 DNA碎片？這一科學(xué)問題的來源是,盡管根據(jù)前面的論證, 我們可以判斷用高通量測(cè)序檢測(cè)到的種類最可能是來自于孢囊而不是營養(yǎng)細(xì)胞,但是在我們與不同學(xué)術(shù)背景專家的互動(dòng)和特別是與領(lǐng)域內(nèi)眾多研究者的討論使我們意識(shí)到必須對(duì)這一問題或人們的保留態(tài)度有更積極的、科學(xué)的應(yīng)對(duì)。因?yàn)? 對(duì)此問題更令人信服的回答不僅可能解除形態(tài)學(xué)背景和分子生物學(xué)背景研究者的二個(gè)方面的疑惑, 本身也具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義, 因?yàn)樽C明一種藻華甲藻能夠形成休眠孢囊就為其藻華暴發(fā)以致地理擴(kuò)散提供了一種最重要的機(jī)制[25-26,51]。我們知道, 應(yīng)用分子生物學(xué)手段檢測(cè)可以得到更完備、準(zhǔn)確的名錄, 尤其是大量的未知種類(即未被研究、描述的種類), 但可能會(huì)被質(zhì)疑得到的信號(hào)可能來自營養(yǎng)細(xì)胞(或 DNA片斷)。反之, 使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和形態(tài)學(xué)鑒定, 可以看到一個(gè)個(gè)細(xì)胞是營養(yǎng)細(xì)胞還是孢囊, 似乎“有圖有真相”, 然而這只適合豐度較高、形態(tài)特征明顯、孢囊較大、已經(jīng)有參考圖譜的種類。而這類孢囊實(shí)際上只占能夠產(chǎn)孢囊種類的少部分[25,70]。對(duì)于孢囊形態(tài)高度類似、豐度低、形態(tài)簡(jiǎn)單、個(gè)體很小的種類(小于20 μm;絕大部分研究中采用20 μm篩絹或篩網(wǎng)來分離孢囊時(shí)很可能漏掉)和未曾深入研究和證明產(chǎn)孢囊的種類就不合適。因此, 我們必須建立分子檢測(cè)和形態(tài)鑒別相結(jié)合的技術(shù)手段, 以得到更全面、準(zhǔn)確、確定的信息。具體而言, 就是在高通量第二代測(cè)序甚至第三代測(cè)序得到種類名錄的基礎(chǔ)上, 根據(jù)序列信息, 對(duì)重要的、代表性的種類(產(chǎn)毒素的; 未曾報(bào)道產(chǎn)孢囊的;種類不確定的; 肯定是新種、屬的, 等等), 設(shè)計(jì)特異性分子探針和引物, 應(yīng)用 FISH-LM-Single-cell PCR克隆測(cè)序的手段, 得到特定孢囊的準(zhǔn)確又有形態(tài)觀察的鑒定。我們前期對(duì)多環(huán)馬格里夫藻、米氏凱倫藻、寶石多溝藻等重要種類的檢測(cè)[70,81]證明了此研究路線的有效性。當(dāng)然, 如果通過孢囊萌發(fā)建立有價(jià)值種類的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)系, 則是在這一重要領(lǐng)域探索的額外“紅利”。

綜上, 在對(duì)我國近海沉積物中孢囊的多樣性獲得更加全面的認(rèn)識(shí)后, 再對(duì)海外到港船舶壓艙泥中孢囊進(jìn)行細(xì)致的采樣和分析, 將能夠?qū)Υ皦号撍?泥)可能給中國海域帶來的外源有害藻華種類入侵風(fēng)險(xiǎn)得到一個(gè)系統(tǒng)、全面的實(shí)證性評(píng)估依據(jù), 為我國最近幾十年出現(xiàn)的新型有害藻華種類是否為外源入侵種提供初步的解釋證據(jù)。更重要的, 為我國在正式加入IMO的壓艙水公約后開展對(duì)?？恐袊劭诘耐廨嗊M(jìn)行有關(guān)檢驗(yàn)檢疫的執(zhí)法提供重要的、最基礎(chǔ)性的依據(jù), 也為我國有害藻華防控和預(yù)警預(yù)測(cè)提供重要的第一手參考資料。