楊繼元 趙志剛 李國(guó)平 顧冬花 張才旦卓瑪 杜梅卓 蔡金山 李靜 張俊 趙全邦 胡廣衛(wèi) 沈艷麗

Eg95包蟲病基因工程亞單位疫苗免疫效果試驗(yàn)

楊繼元①趙志剛①李國(guó)平①顧冬花①?gòu)埐诺┳楷敘俣琶纷竣俨探鹕舰诶铎o②張?、仝w全邦②胡廣衛(wèi)②沈艷麗②

（①青海省大通縣畜牧獸醫(yī)站 810100 ②青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 青海 西寧）

為了解Eg95包蟲病基因工程亞單位疫苗免疫牦牛的效果，以便為今后疫苗生產(chǎn)與推廣使用提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，大通縣畜牧獸醫(yī)站于2018年至2019年進(jìn)行了包蟲病基因工程疫苗免疫及免疫效果試驗(yàn)。結(jié)果表明：通過(guò)組間減囊率、個(gè)體荷蟲量統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)用的Eg95蛋白基因工程疫苗在預(yù)防牛感染包蟲或減少感染包蟲數(shù)量方面有較好的效果，二免效果尤為明顯。

包蟲病 免疫效果 牦牛

包蟲病是由寄生在犬等食肉動(dòng)物小腸內(nèi)的棘球絳蟲的幼蟲寄生于人或動(dòng)物體內(nèi)引起的人獸共患寄生蟲病，幾乎遍布全球。我縣牛羊感染率約在15%以上，犬糞抗原陽(yáng)性率在10%~21%。我國(guó)的內(nèi)蒙古、四川、西藏、甘肅、青海、寧夏、新疆等7個(gè)省(自治區(qū))的牧區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)是棘球蚴病的嚴(yán)重受害區(qū)。其危害程度已到了危及人類生命、妨礙畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展、嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和因病致貧、因病返貧的地步。因此，為了解Eg95包蟲病基因工程亞單位疫苗免疫牦牛的效果，以便為今后推廣應(yīng)用提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，大通縣畜牧獸醫(yī)站于2018-2019年進(jìn)行了包蟲病基因工程疫苗免疫及免疫效果試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)牛為大通縣種畜繁殖場(chǎng)4月齡左右毛犢牛100頭。

1.1.2 棘球絳蟲 將購(gòu)買的6條犬栓于籠內(nèi)，用已感染包蟲的內(nèi)臟飼喂，經(jīng)反復(fù)用ELISA法檢測(cè)，糞抗原呈陽(yáng)性時(shí)宰殺，逐條檢查小腸內(nèi)的棘球絳蟲感染情況，并刮取已感染棘球絳蟲犬的小腸黏膜置于干凈的飲料瓶?jī)?nèi)，備用。

1.1.3 試驗(yàn)疫苗 注射所用的“包蟲病基因工程亞單位疫苗”由重慶澳龍生物制品有限公司試制，疫苗批號(hào)2016001，規(guī)格為10頭份/瓶，每頭份含保護(hù)性抗原(Eg95蛋白)250μg和Quli A佐劑5mg。

1.1.4 檢測(cè)試劑 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自重慶澳龍生物制品公司，批號(hào)20170402。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疫苗安全性觀察方法 試驗(yàn)牛頸部皮下注射牛包蟲病疫苗1頭份/頭(共含500μg的Eg95蛋白)，對(duì)照組試驗(yàn)牛注射相同體積的疫苗稀釋液。注射后觀察試驗(yàn)牛有無(wú)嘔吐、抽搐、休克等應(yīng)激反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)試驗(yàn)牛體溫變化情況。

1.2.2 免疫與檢測(cè)方法 （1）將100頭試驗(yàn)牛經(jīng)基礎(chǔ)抗體檢測(cè)后，剔除基礎(chǔ)抗體OD450nm>0.3的牛，將包蟲抗體陰性(OD450nm≤0.3)的牛不分性別隨機(jī)分為免疫組、強(qiáng)化免疫組和對(duì)照組，每組20頭，然后佩戴耳標(biāo)并編號(hào)登記，按組進(jìn)行免疫。（2）免疫組：對(duì)4月齡左右的犢牛20頭采集血清后進(jìn)行免疫，頸部皮下注射1頭份的包蟲病疫苗，分別于30、60d攻毒，攻毒后頸部采集靜脈血，分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。（3）強(qiáng)化免疫組(二免組)：對(duì)4月齡左右的犢牛20頭采集血清后進(jìn)行免疫，頸部皮下注射1頭份的包蟲病疫苗，30d時(shí)采集血清并進(jìn)行第二次免疫，二次免疫30d攻毒、攻毒后頸部采集靜脈血，分離血清。（4）對(duì)照組：采集血清按照相同方法頸部皮下注射無(wú)Eg95的疫苗稀釋液，分別于0、30、60d攻毒、攻毒頸部采集靜脈血，分離血清。

1.2.3 感染方法 將保存于飲料瓶?jī)?nèi)的新鮮的小腸粘膜，50倍稀釋后灌服給免疫組、強(qiáng)化免疫組和對(duì)照組的試驗(yàn)牛各50ml。灌服完棘球絳蟲后，所有試驗(yàn)牛均由同一牧工飼養(yǎng)于同一草場(chǎng)，期間用血清學(xué)方法檢測(cè)抗體滴度。

1.2.4 剖檢方法 隨機(jī)抽取免疫組2頭、強(qiáng)化免疫組2頭和對(duì)照組3頭試驗(yàn)牛采集血清，宰殺、分組統(tǒng)計(jì)其內(nèi)臟組織中的包囊數(shù)量。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和處理

（1）試驗(yàn)中，由于試驗(yàn)牛是放牧牛，采樣時(shí)放牧員不一定每次能將試驗(yàn)牛收集齊，且放牧牛野性大，不一定所有試驗(yàn)牛均能采上樣品，所以在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)剔除了采樣次數(shù)低于3次的個(gè)體數(shù)據(jù)。（2）減囊率=(對(duì)照組囊包數(shù)-試驗(yàn)組囊包數(shù))÷對(duì)照組囊包數(shù)×100%。（3）符合率=剖檢陽(yáng)性牛與血清學(xué)陽(yáng)性符合數(shù)÷剖檢?？倲?shù)×100%。（4）試驗(yàn)操作方法按試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 血清學(xué)結(jié)果判定方法和標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)滿足下列條件，方為有效。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD450nm≥0.6±0.02；標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照孔平均OD450nm≤0.3±0.02。

1.4.2 疫苗免疫后抗體水平檢測(cè)結(jié)果的判定 樣品OD450nm≤0.3，判為細(xì)粒棘球蚴(包蟲)抗體陰性；樣品OD450nm>0.3，判為細(xì)粒棘球蚴(包蟲)抗體陽(yáng)性；樣品OD450nm處于0.3±0.02臨界值范圍內(nèi)，建議重復(fù)檢測(cè)，以確保結(jié)果準(zhǔn)確。

1.4.3 對(duì)細(xì)粒棘球(包蟲)免疫保護(hù)力檢測(cè)結(jié)果的判定 樣品OD450nm≤0.3，判為無(wú)保護(hù)力，所檢樣品對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染無(wú)保護(hù)力；樣品OD 450nm介于0.3與0.6之間，判為保護(hù)力低下，抗體水平較低，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染有一定保護(hù)力；樣品OD450nm≥0.6，判為有保護(hù)力，所檢樣品抗體水平較高，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%的抵抗力；樣品OD450nm處于0.3±0.02或者0.6±0.02兩個(gè)臨界值范圍內(nèi)，重復(fù)檢測(cè)，以確保結(jié)果準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測(cè)和剖檢數(shù)量

表1 血清學(xué)檢測(cè)和剖檢數(shù)量 (份)

2.2 免疫試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)牛注射Eg95蛋白基因工程疫苗后，均未出現(xiàn)嘔吐、抽搐、休克等應(yīng)激反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng)，體溫也無(wú)明顯變化。說(shuō)明該疫苗在牦牛上使用是安全的。

2.2.2 免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表2 不同時(shí)間群體免疫抗體滴度 (頭、%)

表3 不同時(shí)間免疫抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (頭、%)

表4 不同時(shí)間免疫抗體有一定保護(hù)力有保護(hù)力個(gè)體數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (頭、%)

從表2、3、4檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，各組供試?；A(chǔ)抗體檢測(cè)值均≤0.3，說(shuō)明選擇的供試牛細(xì)粒棘球蚴(包蟲)抗體陰性，也就是說(shuō)試驗(yàn)前供試牛未感染包蟲。注射Eg95蛋白基因工程疫苗后30d時(shí)，群體平均免疫抗體滴度>0.3，個(gè)體陽(yáng)性率為89.47%，群體抗體滴度>0.6，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%抵抗力的牛達(dá)100%；從個(gè)體抗體滴度來(lái)看，免疫牛在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%抵抗力的牛只有68.42%，10.52%的牛免疫抗體呈陰性，其因有可能是個(gè)體對(duì)疫苗的敏感性或者是檢測(cè)試劑的敏感性或者因加樣等操作造成的。60d時(shí)，一免組群體平均免疫抗體滴度>0.3、個(gè)體陽(yáng)性率為60%，個(gè)體免疫抗體滴度≥0.6，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%的抵抗力的牛占40%，介于0.3與0.6之間、抗體水平較低，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染有一定保護(hù)力的牛占20%，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染無(wú)保護(hù)力的占40%，而二免組免疫抗體水平繼續(xù)在上升，群體和個(gè)體抗體>0.3、群體和個(gè)體陽(yáng)性率達(dá)100%，個(gè)體免疫抗體滴度≥0.6，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%的抵抗力的牛為100%。384d時(shí)，一免組群體平均免疫抗體滴度>0.3，個(gè)體陽(yáng)性率為57.14%，個(gè)體免疫抗體滴度≥0.6，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%的抵抗力的牛只有14.28%，介于0.3與0.6之間、抗體水平較低，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染有一定保護(hù)力的牛占28.57%對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染無(wú)保護(hù)力的占57.14%，二免組群體平均免疫抗體滴度>0.3，個(gè)體陽(yáng)性率為60%，個(gè)體免疫抗體滴度≥0.6，在攻毒試驗(yàn)中可提供高于90%的抵抗力的牛有40%，介于0.3與0.6之間、抗體水平較低，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染有一定保護(hù)力的牛占20%，對(duì)細(xì)粒棘球蚴感染無(wú)保護(hù)力的占40%。

2.3 剖檢試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同組不同部位荷蟲數(shù)

表5 不同組不同部位荷囊數(shù) (頭)

從表5剖檢數(shù)據(jù)來(lái)看，包蟲在牦牛內(nèi)臟器官中，肺臟的荷蟲數(shù)最多，其次是肝，第三位是脾，第四位是腎，第五位是心臟，囊經(jīng)最大28mm,最小0.9mm,對(duì)照組、一免組、二免組平均荷蟲量分別為351.67、207.67、13.67個(gè)，其他部位未發(fā)現(xiàn)囊包；134個(gè)包囊396張片鏡檢均未檢出原頭蚴；一免組囊包數(shù)數(shù)與對(duì)照組相比，其減囊率為40.95%，二免組與一免組相比，減囊率為93.42%，二免組與對(duì)照組相比，減囊率為96.11%。結(jié)果表明，雖然Eg95蛋白基因工程疫苗在預(yù)防牛感染包蟲或減少感染包蟲數(shù)量方面有較好的效果，但每一組牛都感染了包蟲，其因有可能與攻毒時(shí)機(jī)不準(zhǔn)確或攻毒量過(guò)大有關(guān)。

2.3.2 剖檢牛個(gè)體血清學(xué)和結(jié)果陽(yáng)性符合性對(duì)比

表6 各組試驗(yàn)牛個(gè)體血清學(xué)和剖檢結(jié)果

（1）表6對(duì)照組6頭牛中3頭攻毒后234d時(shí)抗體滴度均有所升高，至767d時(shí)除7715號(hào)?？贵w持續(xù)上升外，其余兩頭抗體滴度反而有所下降；一免組7721號(hào)牛免疫后30d、和攻毒后234d時(shí)抗體上升很快，抗體滴度也很高，但到免疫后60d、攻毒后767d時(shí)抗體滴度很快下降了下來(lái)，7505號(hào)免疫和攻毒后抗體滴度上升快，免疫和攻毒后抗體滴度下降比較緩慢；二免組7514號(hào)牛一免、二免后抗體上升快，抗體滴度維持比較穩(wěn)定、且產(chǎn)生的抗體滴度比較高，攻毒后抗體滴度有所上升，但幅度不大，7521號(hào)牛一免后上升的抗體滴度比較低，二免后抗體有明顯的上升，但到攻毒時(shí)抗體已下降了一免后的水平，攻毒后抗體不但沒(méi)有上升，反而有所下降。該結(jié)果表明：在不考慮疫苗的前提下，免疫抗體產(chǎn)生與否，產(chǎn)生抗體的滴度高與低主要與牛的個(gè)體因素有關(guān)；該試劑可用于免疫牛產(chǎn)生抗體產(chǎn)生的水平和免疫抗體消長(zhǎng)，但不能區(qū)分抗體是自然感染還是免疫而產(chǎn)生的抗體。（2）若依據(jù)疫苗免疫后抗體水平判定，剖檢和血清學(xué)檢測(cè)的陰性符合率為0，陽(yáng)性符合率為57.14%(4/7)；若依免疫保護(hù)力判定，陰性符合率為0，陽(yáng)性符合率為28.56(2/7)。結(jié)果進(jìn)一步證明，該試劑不能真實(shí)反映感染抗體檢測(cè)的結(jié)果，因而不能用于個(gè)體感染包蟲與否的診斷。

2.3.3 血清學(xué)抗體

表7 試驗(yàn)牛組間血清學(xué)和剖檢結(jié)果 (頭)

表7可以看得出各組免疫和攻毒后產(chǎn)生的抗體呈曲線型上升或下降，同時(shí)組間統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)同樣表明了3.3.2的分析結(jié)果。

3 結(jié)論

（1）組間減囊率、個(gè)體荷蟲量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)用的Eg95蛋白基因工程疫苗在預(yù)防牛感染包蟲或減少感染包蟲數(shù)量方面有較好的效果，二免效果尤為明顯。但本試驗(yàn)中，有可能是因?yàn)楣ザ緯r(shí)機(jī)把握不準(zhǔn)或攻毒量過(guò)大或其他因素影響，每一組牛都有包蟲感染，具體何因尚待進(jìn)一步探討[4]。（2）剖檢牛免疫、攻毒后抗體滴度變化證明，在不考慮疫苗因素的前提下，免疫抗體產(chǎn)生與否[6]，產(chǎn)生抗體的滴度高與低主要與牛的個(gè)體因素有關(guān)。（3）剖檢牛個(gè)體、群體血清學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)和剖檢符合率說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)用免疫抗體試劑盒的免疫抗體檢測(cè)試劑可用于免疫牛產(chǎn)生抗體水平和抗體消長(zhǎng)的檢測(cè)[7]，但該試劑不能區(qū)分自然感染抗體和免疫抗體，因而不能用于個(gè)體感染包蟲與否的診斷。

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（2020–04–21）

青海省人畜包蟲病防控策略與創(chuàng)新技術(shù)應(yīng)用，2016-SF-A5；青海省第二批、第三批“高端創(chuàng)新人才千人計(jì)劃”

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