金 鹿，娜美日嘎，孫海洲，桑 丹，李勝利，張春華，張崇志，任曉萍，珊 丹，凌樹禮

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

鈣（Ca）是動物體內(nèi)極為重要的一種常量礦物質(zhì)元素，參與動物體骨骼和牙齒的構(gòu)成，參與神經(jīng)調(diào)節(jié)，維持血液、肌肉、細(xì)胞膜的正常功能，保持酶的活性。Ca2+穩(wěn)恒是動物的各項生理活動（如肌肉的收縮、信號傳遞、骨質(zhì)的沉積、細(xì)胞更新）正常進(jìn)行的基礎(chǔ)[1]。動物機體Ca 的代謝主要包括胃腸道吸收、骨動員和腎重吸收三大關(guān)鍵點，其中胃腸道吸收中的跨細(xì)胞膜吸收方式占70%左右，是維持Ca2+穩(wěn)態(tài)最主要的因素[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道，Ca2+的跨細(xì)胞吸收依賴于一定數(shù)量和活性的胞膜鈣轉(zhuǎn)運蛋白的參與，瞬時性受體電位通道香草酸受體（Transient Receptor Potential Vanilla Receptor 6，TRPV6）、維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白（Vitamin D-dependent 9 ku calcium-Binding Protein，CaBP-D9k）、維生素D 受體（Vitamin D Receptor，VDR）是該吸收途徑中主要的限速大分子，也是主要的動力學(xué)參數(shù)[3-5]。由此可見，探索其在胃腸道的表達(dá)特征對深入研究Ca2+跨膜吸收動力學(xué)具有重要意義。現(xiàn)有對腸道中Ca2+代謝相關(guān)基因的研究多集中于人、小鼠、大鼠等單胃動物上，而有關(guān)反芻動物的研究報道極少[4,6]。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR 已成為定量檢測基因表達(dá)水平強有力的工具。因此，本研究以內(nèi)蒙古白絨山羊斷奶羔羊為研究對象，旨在應(yīng)用實時熒光定量PCR 技術(shù)定量檢測CaBP-D9k、TRPV6和VDR在胃腸道中的mRNA 表達(dá)差異，為進(jìn)一步闡明反芻動物胃腸道Ca2+吸收機制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RNAisoTMPlus（No：D9108A）、Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，No：DRR036A）、SYBR premix EX TaqTM（TaKaRa，No：DRR041A）、EASY Dilution（No：D9160）、DNA Marker DL2000（No：D510A）、6×Loading Buffer（No：D604）均購自TaKaRa 公司（大連）。氯仿（≥99.8%）、無水乙醇（≥99.7%）、異丙醇（≥99.7%）、瓊脂糖皆由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，核酸染料由天根生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器 超低溫冰箱（Thermo Forma）、凝膠成像分析系統(tǒng)（GENE 公司）、高速低溫離心機（Eppendo rf5810）、熒光定量儀（ABIMP3005，USA）、PCR實時定量儀（Illumina Eco）。

1.1.3 試驗動物及樣品采集 試驗選取9 只內(nèi)蒙古白絨山羊4 月齡斷奶羔羊，自由采食、自由飲水10 d 后進(jìn)行屠宰，快速分離各段胃腸道組織，包括瓣胃、皺胃、瘤胃、網(wǎng)胃，以及十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸，從各段腸道中上部取3 cm 樣品組織，通過預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）對其進(jìn)行沖洗，迅速放入液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 提取RNA 根據(jù)RNAisoTMPlus 提取試劑盒的說明，提取胃腸道組織的總RNA。通過酶標(biāo)儀檢測提取物OD 值A(chǔ)260/A280在1.8～2.2，符合總RNA 提取的純度要求。于2% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，總RNA 提取質(zhì)量良好，完整性高。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 反轉(zhuǎn)錄操作過程應(yīng)依據(jù)Prime Script RT reagent Kit 試劑盒說明書，在冰上操作。反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.3 相對熒光定量PCR 使用熒光定量PCR 儀（ABIMP 3005）應(yīng)用SYBY Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系總體積為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，PCR Forward/Reverse prime（r10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H2O 7.2 μL。實時熒光定量PCR 程序：95.0℃預(yù)變性30 s；95.0℃ 30 s 變性，60℃30 s 退火，72.0℃ 20 s 延伸，并實施循環(huán)反應(yīng)40 個；70℃時進(jìn)行51 個0.06 s 的循環(huán)，再進(jìn)行熔解曲線的繪制。

通過Primer 5 和Olige 6 軟件對羊的各個基因的PCR特異性引物進(jìn)行設(shè)計，具體參照表1 的引物序列。由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對得到的引物進(jìn)行合成。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 表格計算，試驗中測定基因（CaBP-D9k、TRPV6和VDR）表達(dá)量的對數(shù)值（y）與Ct 值（x）呈反比例關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)都趨于1（r2＞0.98），擴(kuò)增效率都趨于1（E=0.8～1.2），可以利用2-△△Ct公式進(jìn)行相對表達(dá)量的計算。利用 軟件的進(jìn)行單因素方差分析，選用Duncan's 進(jìn)行多重比較。對試驗結(jié)果進(jìn)行判斷時，差異顯著水平設(shè)為P＜0.05。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)蒙古白絨山羊胃腸道中TRPV6mRNA 表達(dá)量由圖1 可知，TRPV6mRNA 表達(dá)量最高的部位在十二指腸，其次是空腸，然后是網(wǎng)胃，回腸、皺胃表達(dá)量較低，最低為結(jié)腸，四者差異顯著。小腸腸段內(nèi)空腸與回腸內(nèi)TRPV6mRNA 表達(dá)量接近（P＞0.05），但均顯著高于胃（瘤胃、瓣胃）和大腸（盲腸、結(jié)腸、直腸）。

2.2 內(nèi)蒙古白絨山羊胃腸道中CaBP-D9kmRNA 的表達(dá)量 如圖2 所示，CaBP-D9kmRNA 在十二指腸中表達(dá)量最高，遠(yuǎn)高于胃腸道的其他部位（P＜0.05），而在大腸內(nèi)則處于較低水平。在消化道中，CaBP-D9k的表達(dá)量順序為十二指腸＞空腸＞網(wǎng)胃＞結(jié)腸＞瘤胃＞瓣胃＞皺胃＞直腸＞盲腸＞回腸。由此可見，隨著小腸腸道向后延伸，CaBP-D9kmRNA 表達(dá)量逐漸變低。

2.3 內(nèi)蒙古白絨山羊胃腸道VDRmRNA 表達(dá)量 如圖3 所示，VDRmRNA 在十二指腸內(nèi)的表達(dá)量顯著高于其他胃腸道，依次為十二指腸、空腸、結(jié)腸、直腸、盲腸、回腸、網(wǎng)胃、皺胃、瓣胃、瘤胃，即小腸＞大腸＞胃。

3 討 論

Ca2+的跨細(xì)胞吸收途徑主要為Ca2+經(jīng)TRPV6 介導(dǎo)入胞、與CaBP-D9k結(jié)合并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞另一側(cè)、由PMCA1b 和鈉鈣交換體運載出胞外排入血3 個步驟[7-8]。CaBP-D9k、TRPV6、VDR 作為影響Ca2+吸收動力學(xué)參數(shù)的主要限速大分子，在胃腸道各組織中的分布特異性較強，在Ca2+跨膜的吸收上分工不同，在調(diào)控中共同發(fā)揮作用[9]。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古白絨山羊斷奶羔羊各腸段中TRPV6、CaBP-D9k、VDR3 個基因的特異表達(dá)不同，使得消化道各部位對Ca2+的吸收存在不同特征。

本試驗結(jié)果得出，TRPV6、CaBP-D9k、VDR在內(nèi)蒙古白絨山羊胃內(nèi)的表達(dá)水平均較低，表明胃并非是Ca2+吸收和調(diào)節(jié)中的主要位點，在Ca2+穩(wěn)恒維持中發(fā)揮作用不大，這與前人的研究結(jié)果類似[10-11]。因此本試驗將瘤胃作為分析對照樣本。

小腸作為Ca2+吸收的主要部位，吸收量高達(dá)90%[12]。然而，小腸各部位對于Ca2+的吸收能力不同，十二指腸對Ca2+的吸收特點是速度快、量少，而回腸對Ca2+的吸收特點則是速度慢、量大。此外，小腸內(nèi)食糜的停留時間對于小腸各段的Ca2+吸收量影響較大，經(jīng)測定食糜在回腸中停留時間達(dá)到100～120 min，在十二指腸卻極短，只有2～6 min[13]。而在小腸對Ca2+的吸收方式上，主要通過跨細(xì)胞膜和旁細(xì)胞2 種形式將Ca2+轉(zhuǎn)運到血液中，進(jìn)而維持血鈣穩(wěn)恒[14]。其中，Ca2+的跨細(xì)胞吸收主要依賴于胞膜鈣轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量及活性，受食糜滯留時間影響較小，近端小腸是這一途徑的主要位點，而旁細(xì)胞過程主要與胃腸道內(nèi)外Ca2+電化學(xué)濃度差有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小腸腸段，隨著十二指腸向空腸、回腸的延伸，CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表達(dá)量均降低。據(jù)研究報道，在飼糧Ca水平不足的情況下，十二指腸對代償性維持正常Ca 吸收起重要作用，常伴有較高的Ca2+跨膜吸收相關(guān)基因表達(dá)[16]。本研究中，在內(nèi)蒙古白絨山羊斷奶羔羊十二指腸中檢測到了小腸腸段中最高的CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表達(dá)量，提示十二指腸是小腸內(nèi)Ca2+經(jīng)TRPV6 介導(dǎo)入胞，通過VDR 的調(diào)控，與CaBP-D9k特異相結(jié)合，是Ca2+跨膜吸收途徑中效果最好的位點[4]。在Ca2+經(jīng)旁細(xì)胞途徑吸收中，主要受胃腸道內(nèi)外Ca2+電化學(xué)濃度差影響，由于食糜在回腸停留時間最長，該部位是旁細(xì)胞途徑吸收的主要位點。因此，Ca2+跨膜吸收相關(guān)基因表達(dá)量在該位點有所降低[17]。這與本研究結(jié)果相符，即在小腸腸道內(nèi)，以回腸的CaBP-D9k、VDR、TRPV6mRNA 表達(dá)量最低。

此外，大腸在改善腸道功能、營養(yǎng)物質(zhì)吸收方面的調(diào)節(jié)作用不容忽視。食物中的Ca 運行至小腸末端時，未吸收的部分進(jìn)入大腸。近端大腸可吸收這些不易被利用吸收的外源Ca 或內(nèi)源Ca，同時也可有效吸收遠(yuǎn)端小腸分泌的Ca。Karbach[18]報道在大鼠體內(nèi)大腸前段Ca的吸收量最大，占大部分，達(dá)到十二指腸與結(jié)腸的10 倍。Wilson 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，盲腸和結(jié)腸也能吸收少量的Ca，吸收量占整個腸道的7%。Karbach 等[20]通過45Ca的體外測定方法，發(fā)現(xiàn)鈣含量在盲腸中累積最多，證實在大鼠體內(nèi)，盲腸是Ca 吸收的主要部位。然而，也有報道指出，食糜流經(jīng)整個胃腸道中，盲腸對Ca2+吸收量極其有限，從而使得Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)較低[16]。盲腸的Ca2+跨膜吸收作用極其關(guān)鍵，該部位對Ca2+吸收能力對于整個消化道Ca2+的吸收起決定性作用[4]。此外，Lutz 等[21]研究表明，大鼠內(nèi)Ca2+的吸收主要集中在遠(yuǎn)端結(jié)腸與直腸部位，并非近端盲腸，這一研究結(jié)果也被Trinidad 等[22]所證實。本研究結(jié)果得出，3 個基因的mRNA 表達(dá)量在盲腸、結(jié)腸、直腸中差異不顯著，但從數(shù)值上看，結(jié)腸中CaBP-D9k和VDR的mRNA 表達(dá)量高于盲腸與直腸。這與前人的研究結(jié)果不盡一致，這可能與試驗所選取的動物種屬不同等有關(guān)。然而，目前對大腸Ca2+吸收機制相關(guān)的研究報道較少，尤其在斷奶羔羊領(lǐng)域的研究更少，有待于更進(jìn)一步的研究探討。

4 小 結(jié)

本研究結(jié)果表明，CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 均在十二指腸中表達(dá)量最高，CaBP-D9k和TRPV6mRNA 與VDRmRNA 分別在大腸內(nèi)、胃內(nèi)處于較低的表達(dá)水平；CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表達(dá)量隨著小腸的延伸而逐漸降低；CaBP-D9k、TRPV6和VDRmRNA 表達(dá)量受到胃腸道Ca2+跨膜吸收能力的影響，它們之間關(guān)聯(lián)度較高。