段夢(mèng)琪 ，張 健，張芳芳，吳綠草，郭新穎，蔡如玉，祁雨田，商 鵬*，強(qiáng)巴央宗

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院藏豬協(xié)同研究中心，西藏林芝 860000；3.黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉(xiāng)畜牧水產(chǎn)中心，黑龍江大慶 163000）

肌肉生長(zhǎng)速度和脂肪沉積能力是豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀[1]。豬的這些經(jīng)濟(jì)性狀不僅與飼養(yǎng)管理水平有關(guān)，更重要的是與調(diào)控肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積的基因有關(guān)[2]。長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶6(ELOVL6) 基因就是調(diào)控脂肪酸合成的重要調(diào)控因子之一[3-4]。ELOVL6基因?qū)儆诔L(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶家族(Elongase of Very Long Chain Fatty Acids，ELOVLs)[5-6]。Takashi 等[7]研究表明，在ELOVL6基因缺失的小鼠中，肝臟內(nèi)源性脂肪酸的合成被完全抑制，并證實(shí)ELOVL6基因通過(guò)與脂肪酸的從頭合成來(lái)維持肝臟內(nèi)硬脂酸鹽和油酸鹽含量。因此，ELOVL6基因不僅在脂肪組織中發(fā)揮作用，在肝臟組織中也表現(xiàn)出十分關(guān)鍵的作用。

藏豬是我國(guó)青藏高原特有的原始小型地方豬種，具有肌內(nèi)脂肪含量高、肉質(zhì)鮮美、生產(chǎn)速度慢等特點(diǎn)[8-10]。目前，ELOVL6基因在豬上的研究較少[11]，在藏豬上的研究則幾乎空白。隨著西藏藏豬產(chǎn)業(yè)大力發(fā)展，圍繞藏豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的研究顯得越發(fā)重要。本實(shí)驗(yàn)以藏豬、滇南小耳豬和大約克豬為研究對(duì)象，采用RTqPCR 方法檢測(cè)背脂、背最長(zhǎng)肌和肝臟ELOVL6基因mRNA 表達(dá)水平的差異，并對(duì)ELOVL6基因的Intron 3區(qū)域進(jìn)行了多態(tài)性分析，為進(jìn)一步研究藏豬和滇南小耳豬肌內(nèi)脂肪沉積與生長(zhǎng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)選取藏豬、滇南小耳豬和大約克豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，藏豬耳組織樣采集于海拔3 000 m 左右的西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)牧場(chǎng)，滇南小耳豬和大約克豬采集于云南省西雙版納。共采集112 頭份耳組織樣品（藏豬40 頭份，滇南小耳豬37 頭份，大約克豬35 頭份），用于基因組DNA 的提取。選擇6 月齡藏豬、滇南小耳豬和大約克豬各9 頭進(jìn)行屠宰，分別采集背脂、背最長(zhǎng)肌和肝臟組織，立即放入RNA-Later 保存液，液氮速凍，用于總RNA 的提取。

1.2 cDNA 的合成及DNA 的提取 RNA 提取采用Trizol法（Trizol Reagent,Invitrogen）提取實(shí)驗(yàn)豬背脂、背最長(zhǎng)肌及肝臟組織的總RNA。用1% 瓊脂糖凝膠電泳法和Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和質(zhì)量，-80℃低溫冰箱保存。

cDNA 合成利用FastKing RT Kit（With gDNase）快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根）。先配制gDNA 去除反應(yīng)體系：加入5×gDNA Buffer 2 μL，根據(jù)RNA 濃度計(jì)算配比量，用RNase-free Water補(bǔ)足10 μL，42℃孵育3 min；配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL：10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNasefree Water 5 μL，混勻后加入到去除gDNA反應(yīng)體系中，充分混勻后42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，-20℃保存。

DNA 提取采用苯酚氯仿抽提法從耳緣組織中提取基因組DNA，用1% 瓊脂糖凝膠電泳法和Nano Drop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度和質(zhì)量，RNase Free Water 溶解，-20℃保存。

1.3 定量PCR 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 公布的ELOVL6基因的mRNA 序列（登錄號(hào)：XR_305072），選用HPRT（登錄號(hào)：NM_001032376）為內(nèi)參基因。采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用0.1%DEPC 水溶解，4℃保存。

1.4 定量PCR 以cDNA 為模板，用表1 中引物擴(kuò)增ELOVL6基因和HPRT基因片段，PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用SYBR Green 定量PCR 試劑盒（天根）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏，Light Cycler96）進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)背脂、背最長(zhǎng)肌和肝臟組織cDNA 樣品進(jìn)行定量PCR，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣和空白樣。樣品目的基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算：

ΔCT(樣品)=CT(樣品目的基因)-CT(樣品內(nèi)參基因)

ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)=CT(標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因)-CT(標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因)

ΔΔCT=ΔCT(樣品)-ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)

目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCT

1.5 基因頻率與基因型頻率 根據(jù)NCBI 上已公布的ELOVL6基因Intron 3 的序列（登錄號(hào)：NC_010450）設(shè)計(jì)引物（表2）。分別對(duì)藏豬、滇南小耳豬及大約克豬的基因組DNA 進(jìn)行特異性擴(kuò)增，每10 個(gè)樣品產(chǎn)物均勻混池，進(jìn)行測(cè)序，初步篩選SNPs 位點(diǎn)后進(jìn)行單個(gè)個(gè)體測(cè)序，統(tǒng)計(jì)分析基因頻率與基因型頻率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 17.0 軟件對(duì)ELOVL6基因表達(dá)量進(jìn)行雙因素（品種和組織）方差分析，并進(jìn)行Ducan's 多重比較；對(duì)ELOVL6基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 時(shí)差異顯著，P＜0.01 時(shí)差異極顯著，P＞0.05 無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 和DNA 提取結(jié)果 圖1、圖2 分別為RNA 提取和DNA 提取結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)膠圖。在圖1 中，28S 和18S 條帶清晰，無(wú)降解和DNA 污染；在圖2 中，DNA 濃度適中，條帶清晰，無(wú)明顯拖尾。通過(guò)Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 和DNA，OD值均在2.0 左右，無(wú)蛋白等污染，提取質(zhì)量較高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表1 基因定量的引物序列

表2 直接測(cè)序法篩選SNPs 的引物序列

2.2 豬ELOVL6基因mRNA 定量 如圖3 所示，在相同品種的不同組織中，背脂組織ELOVL6基因mRNA表達(dá)量最高，其次是背最長(zhǎng)肌，肝臟組織表達(dá)量最低；在相同組織的不同品種中，背脂和背最長(zhǎng)肌組織3 個(gè)豬種間差異極顯著，其中藏豬表達(dá)量最高，其次是滇南小耳豬，大約克豬則最低；在肝臟組織中，該基因在藏豬和滇南小耳豬的表達(dá)量均極顯著高于大約克豬，藏豬和滇南小耳豬差異不顯著。

2.3 豬ELOVL6基因的基因型頻率和基因頻率分布 藏豬、滇南小耳豬、大約克豬個(gè)體測(cè)序后，經(jīng)軟件Chromas Pro 和SPSS17.0 分析，在Intron 3 區(qū)域存在'G99954A、'G99793A、'G99650A 共3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，均符合哈迪-溫伯格定律，且為連鎖突變（見表3）。結(jié)果如表4 所示，在'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 個(gè)位點(diǎn)中，藏豬、滇南小耳豬均與大約克豬存在極顯著差異，藏豬與滇南小耳豬差異不顯著。

3 討 論

ELOVL6 是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂肪酸生成和代謝過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸生物合成的限速酶[12-13]。目前，大量對(duì)ELOVL6基因的研究集中在糖尿病及胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用上[14-15]。近年來(lái)，ELOVL6基因在脂肪生成方面的研究也取得了一些成果，如胡忠昌[16]等通過(guò)克隆延黃牛ELOVL6基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)ELOVL6基因可能是影響牛相關(guān)脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因；黃萬(wàn)龍等[17]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定發(fā)現(xiàn)ELOVL6基因在脂肪酸代謝通路上發(fā)揮關(guān)鍵作用；Hiroki[18]等在基因缺失小鼠上發(fā)現(xiàn)ELOVL6基因缺失對(duì)心肌長(zhǎng)鏈脂肪酸成分影響顯著，ELOVL6可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)LCFA 組合物在壓力超負(fù)荷期間通過(guò)激活A(yù)MPK/KLF4 軸（一種新鑒定的控制心臟表型的信號(hào)傳導(dǎo)途徑）調(diào)節(jié)肥大反應(yīng)的新作用。因此，可以推測(cè)ELOVL6基因可以調(diào)控脂肪沉積，與脂肪的生成有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)藏豬、滇南小耳豬、大白豬的ELOVL6基因mRNA 表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，在背脂和背最長(zhǎng)肌中，藏豬＞滇南小耳豬＞大白豬且均存在極顯著差異；在肝臟中，藏豬極顯著高于大白豬，滇南小耳豬極顯著高于大白豬；在豬的ELOVL6基因Intron3 區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 個(gè)連鎖突變位點(diǎn)，體現(xiàn)為藏豬、滇南小耳豬均與大約克豬存在極顯著差異，藏豬與滇南小耳豬差異不顯著。由此可以看出，ELOVL6基因在國(guó)內(nèi)脂肪型地方品種中，其表達(dá)量均高于外來(lái)瘦肉型品種。Zhang 等[19]通過(guò)GEAS 技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)外不同品種豬的肌內(nèi)脂肪進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)豬脂肪含量高時(shí)，ELOVL6等基因的表達(dá)量高，與本實(shí)驗(yàn)所得定量結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了ELOVL6基因的表達(dá)與脂肪沉積能力呈正相關(guān)。藏豬肉質(zhì)鮮美，口感好，主要由于藏豬肉肌內(nèi)脂肪含量較高[20]。根據(jù)RT-qPCR 結(jié)果顯示，在不同品種豬中，藏豬背最長(zhǎng)肌中ELOVL6基因表達(dá)量最高，可能與其肌內(nèi)脂肪含量和肌纖維分化有關(guān)，說(shuō)明ELOVL6基因在肌肉中的表達(dá)量越高，肌內(nèi)脂肪含量就越高，從而影響肉品質(zhì)。聯(lián)合多態(tài)性位點(diǎn)和熒光定量PCR 結(jié)果，'G99954A、'G99793A、'G99650A 3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)的多態(tài)性與RT-qPCR 結(jié)果基本一致，而RTqPCR 結(jié)果與豬品種類型顯著關(guān)聯(lián)。因此，本實(shí)驗(yàn)提示，ELOVL6基因'G99954A、'G99793A、'G99650A 的3 個(gè)位點(diǎn)的連鎖突變可能是調(diào)控豬肌肉生長(zhǎng)、脂肪沉積性狀的關(guān)鍵功能位點(diǎn)，對(duì)開發(fā)肉質(zhì)性狀的遺傳標(biāo)記及利用分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)豬肉的選育有很大應(yīng)用意義。

表3 不同品種豬3 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率

表4 不同品種豬突變位點(diǎn)的差異性

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR 和一代測(cè)序技術(shù)，圍繞ELOVL6基因，從不同品種豬其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的3 個(gè)組織器官著手，探究了ELOVL6基因Intron 3 區(qū)域的多態(tài)性及mRNA 表達(dá)差異的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)ELOVL6基因'G99954A、'G99793A、'G99650A 位點(diǎn)的多態(tài)性與mRNA 表達(dá)差異性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示，ELOVL6基因的3 個(gè)連鎖突變位點(diǎn)可能是調(diào)控ELOVL6基因表達(dá)的關(guān)鍵功能位點(diǎn)，為優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)性狀的開發(fā)提供科學(xué)材料，也為優(yōu)質(zhì)豬遺傳選育工作提供可靠依據(jù)。