張樹山，張德福，戴建軍，吳彩鳳，孫玲偉

（上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

優(yōu)秀種公羊是影響育種效率的核心因素之一，而精液冷凍保存技術正是提高優(yōu)秀種公羊利用效率的重要途徑。羊冷凍精液的應用不僅能通過減少公羊飼養(yǎng)數(shù)量來提高經濟效益，也可大大降低或避免疫情發(fā)生的風險，在綿羊的新品種培育和遺傳資源保護方面均具有重大意義[1]。綿羊精液冷凍保存技術始于20 世紀50 年代，最初冷凍精液（采用牛冷凍稀釋液）人工授精受胎率僅為5%，80 年代的平均受胎率才達到50%左右[2]。從20世紀90 年代至今，綿羊冷凍精液的輸精效果受冷凍技術水平、母羊發(fā)情鑒定及輸精方法等多個環(huán)節(jié)因素影響，常規(guī)方法輸精的受胎率不到60%，而采用腹腔鏡子宮角輸精能獲得與鮮精相當?shù)乃絒1]。普遍認為，綿羊精液冷凍保存技術發(fā)展和應用相對滯后，主要受制于以下因素：第一，落后的硬件水平使羊精液冷凍保存技術長期處于低水平的平臺期；第二，綿羊子宮頸的特殊的螺旋形構造，運動能力降低的冷凍精子通過子宮頸難度較大，導致綿羊冷凍精液授精受胎率遠低于鮮精水平，且一直沒能建立與冷凍精液相配套的非手術法深部位輸精方法；第三，活體種公羊仍是國內綿羊育種企業(yè)遺傳資源交流的主要形式，對綿羊冷凍精液需求不是很緊迫。此外，羊精液和體細胞等冷凍保存技術大多由相關科研單位攻關并掌握，而在過去幾十年里，國內產、研資源整合程度較低，這也是制約國內綿羊育種和集約化生產進程的一個重要因素。

近十年來，家畜精液冷凍研究和標準化生產的硬件水平得到極大提高，如精子冷凍儀、降溫平衡及精液灌裝-封口等設備的廣泛應用，使家畜冷凍精液實現(xiàn)商業(yè)化和標準化生產成為現(xiàn)實，為綿羊精液冷凍保存技術的提高提供了較好條件。各級政府部門已通過項目和政策支持等手段促進科研院所與畜牧企業(yè)聯(lián)合申報、主持科研項目及科研成果轉化，已取得顯著成效。此外，近幾年由于家畜活體運輸導致疫情頻發(fā)，導致活體種羊遠距離引種難度增大，冷凍精液可能是最合適的替代形式。本文對綿羊精液冷凍技術研究發(fā)展現(xiàn)狀做一綜述，建議加強綿羊生產企業(yè)和科研單位資源整合，以期提高綿羊精液冷凍保存技術水平并推動冷凍精液的商業(yè)化生產。

1 綿羊精液冷凍保存技術的關鍵因素

1.1 冷凍稀釋液

1.1.1 冷凍稀釋基礎液（含有雞蛋卵黃但無甘油等冷凍保護劑）綿羊冷凍稀釋基礎液主要有以下幾類：①基于檸檬酸-果糖（或葡萄糖）、脫脂牛奶、乳糖、蔗糖、Tris 的稀釋液。綿羊精液的滲透壓約為382 mOsm，早期研究者們考慮到稀釋液加入甘油后會導致溶液滲透壓下降，其認為高滲透壓的“檸檬酸-果糖（或葡萄糖）卵黃稀釋液”中的單糖可進入精子細胞內，從而降低滲透壓變化對精子產生的負面影響[3]。利用檸檬酸-果糖（或葡萄糖）類稀釋液制備羊冷凍精液的輸精受胎率為17%～40%[4]。②基于脫脂牛奶的稀釋液。早期試驗發(fā)現(xiàn)，脫脂牛奶（巴氏消毒處理）單獨使用或與檸檬酸、葡萄糖等組合使用，相互之間冷凍效果差異不大[6]。脫脂牛奶稀釋液在歐洲國家應用較多，冷凍精液輸精的受胎率平均在30%～45%[4]。該類稀釋液的優(yōu)點是簡單、方便，盡管動物源成分的牛奶存在生物安全風險，目前仍廣泛使用[5]。③基于乳糖的稀釋液。乳糖能在冷凍降溫過程中降低溶液結晶溫度，與EDTA-Na 組合的稀釋液的冷凍效果較好，該類稀釋液廣泛用在牛、豬和綿羊等家畜[7]精液冷凍。Platov 等[6]在綿羊上利用乳糖類冷凍稀釋液結合兩步稀釋法制作顆粒凍精，受胎率約為26%～60%。④基于蔗糖的稀釋液。早期研究就發(fā)現(xiàn)，蔗糖保護精子頂體完整性的功能優(yōu)于葡萄糖和果糖等雙糖[7]。故研究者們在蔗糖稀釋液基礎上添加維生素E、二丁羥基甲苯（Butylated Hydroxytoluene，BHT）和海膽色素A（Echinochrome A）等抗氧化劑，開發(fā)出多個配方并使用至今，制作的綿羊顆粒凍精受胎率為19%～55%[8]。⑤基于Tris 的稀釋液。20 世紀70 年代Tris 就開始用于綿羊精液冷凍，綿羊精子對Tris 的耐受濃度為250～400 M。Tris 與葡萄糖組合的效果優(yōu)于乳糖和果糖等其他雙糖，制作的顆粒凍精輸精受胎率為30%～57%[9]。Tris-葡萄糖配方仍是目前常用的冷凍稀釋液[10]。目前冷凍稀釋液研發(fā)已不再局限于上述分類，研究人員以精子適宜的滲透壓和pH 范圍作為約束條件，采用糖類（單糖、雙糖及多糖）、抗氧化凋亡成分及一些兩性離子緩沖液等相互組合優(yōu)化，研發(fā)出與細管法冷凍和精子冷凍儀相配套的冷凍稀釋基礎液[11-12]。

自動物精液冷凍保存技術研究以來，卵黃一直是保護精子免受冷休克打擊的主要成分，其機理可能是卵黃中的低密度脂蛋白、磷脂及膽固醇等成分能進入精子質膜和頂體外膜中，通過增強膜穩(wěn)定性來發(fā)揮保護作用[13-14]。近十幾年來，出于對畜牧業(yè)的生物安全性和商品化稀釋液生產的標準化等因素考慮，研究者們一直努力利用非動物源、類卵黃功能性成分替代卵黃，如已開發(fā)出多個大豆卵磷脂的冷凍稀釋液配方，且對精子的冷凍保護效果與卵黃相當或接近。

1.1.2 冷凍保護劑 冷凍保護劑中尤其甘油在精子冷凍保存技術發(fā)展歷程上至關重要，其在精子冷凍上應用使精子冷凍保存成為可能。作為滲透性冷凍保護劑，甘油有較強的親水性，可以在細胞脫水過程中，通過改變精子細胞外滲透壓來降低精子細胞內含水量，從而減少細胞內生成冰晶對精子的危害，且能限制和干擾水分子晶格的排列來抑制細胞內外水形成冰晶，使水處于過冷狀態(tài)降低形成結晶的溫度[15-16]；甘油也容易滲透進入綿羊精子細胞內，使水分和一些鹽類排出胞外，避免電解質濃度增加的不良影響[17]。目前在綿羊精子冷凍中，顆粒法冷凍甘油較適宜添加水平為3%～4%，而細管法冷凍為6%～9%[1]?？紤]到甘油和DMSO 等滲透性冷凍保護劑均有不同程度的毒性，研究者們采用兩步稀釋法，試圖通過降低甘油與精子的接觸時間和添加時溫度來降低對精子毒性作用，結果表明與一步稀釋法差異不顯著且操作繁瑣，故目前廣泛使用一步稀釋法，即在精液采集后（約30℃）就加入含有甘油（終濃度6%～8%）的稀釋液，經1～3 h 降溫平衡至5℃、冷凍[11,18]。

冷凍保護劑的發(fā)展趨勢是利用無毒、高效的冷凍保護成分部分或完全取代甘油。研究證實，一些雙糖和植物性多糖類[5]作為非滲透性冷凍保護劑對精子有較好的保護作用，但仍不能完全代替甘油為代表的滲透性冷凍保護劑，目前仍是通過甘油與非滲透性冷凍保護劑結合使用來提高精子冷凍保護效果。

1.1.3 冷凍稀釋液的抗菌成分 動物精液及使用的稀釋液中均含有豐富的營養(yǎng)物質、適宜的pH 和滲透壓，在沒有抗生素或抗生素失活情況下，細菌數(shù)量會以幾何級快速增加。含有微生物或病原體污染的液態(tài)（4～20℃）和冷凍保存精液（-196℃）可能引起母畜繁殖障礙或疾病[19]。目前，抑制家畜精液中微生物和細菌的主要手段仍是添加青、鏈霉素等常規(guī)及一些新型廣譜抗生素。然而，抗生素會使病原菌產生耐藥性，且對精子有不可忽視的毒性作用。如在澳大利亞和德國約90%的豬AI 中心仍使用單一抗生素，其中保存精液檢測出慶大霉素耐藥菌的AI 中心比例分別為66.7%（18/24）和26%（88/344）[20]。出于耐藥性和抑菌效果考慮，人們開始將一些新型廣譜抗生素低濃度結合使用（即“雞尾酒”法）用于降低精液保存過程中的抗生素耐藥性[21]。此外，抗菌肽具有微量抗菌譜廣（包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌和寄生蟲）、抗部分帶包膜病毒的作用，且大多數(shù)抗菌肽對正常真核細胞無毒性或低毒性、幾乎無耐藥性，被認為是現(xiàn)有抗生素的最佳替代品。迄今為止，已有一些人工合成抗菌肽在家畜精液保存中的研究[22-23]。然而，目前從已知海量的抗菌肽中篩選、試驗工作量巨大，以及天然提取、化學合成和基因工程等方法仍存在局限性，故為精液冷凍保存尋找有效的抗菌肽來替代抗生素仍任重道遠。

1.2 綿羊精子冷凍及解凍方法 在精子程序冷凍儀廣泛應用前，綿羊精子冷凍普遍采用顆粒法或PVC 細管法，冷凍過程中的降溫速率主要通過控制銅網(wǎng)或冷凍架與干冰或液氮面的距離實現(xiàn)。顆粒法凍精制作簡單、成本低，但不易標記、易污染，且解凍不方便。而PVC 細管法不存在上述問題，且宜貯存、適合自動化的商業(yè)化凍精生產。近十年來，家畜精液冷凍的硬件水平得到了極大提高。通過調控降溫速率的低溫操作柜結合水浴方法，能使精液冷凍前降溫平衡比傳統(tǒng)的在冰箱內包裹降溫更為平穩(wěn)；精液細管自動灌裝、封口和打印設備的廣泛應用可大大節(jié)約勞動力且實現(xiàn)生產標準化；采用精子冷凍專用的程序化冷凍儀可以通過計算機控制液氮噴速精確控制精液降溫速率，使精液冷凍降溫程序實現(xiàn)最優(yōu)化成為可能。綜上，綿羊冷凍精液的商業(yè)化生產的硬件條件已具備。

冷凍精液的解凍要經過-15～ -60℃的危險溫區(qū)，故精液的升溫過程與冷凍過程對冷凍精子的品質同樣重要。普遍認為，小劑型凍精采用高溫快速解凍法效果好，而大劑型凍精則不適合快速解凍。Graham 等[24]研究證實，65℃快速解凍精液的產羔率顯著高于40℃解凍。筆者所在課題組在湖羊上證實，冷凍精液細管（0.25 mL）在70℃條件下的解凍效果優(yōu)于其他溫度（待發(fā)表）。研究已證實，綿羊冷凍精液濕解凍法優(yōu)于干解凍法[2]。解凍液中的抗氧化等成分可抑制解凍后精子活性氧（ROS）對精子的損傷，通過稀釋降低滲透性冷凍保護劑的濃度可降低對精子的毒性作用，且能在保證有效精子數(shù)量前提下增加輸精母羊的數(shù)量[25]。

1.3 人工授精及同期發(fā)情 由于綿羊子宮頸的生理結構特性，使得母羊因素-人工輸精環(huán)節(jié)與精子冷凍效果一樣重要。

綿羊屬于季節(jié)性多次發(fā)情家畜，具有發(fā)情期短、發(fā)情癥狀不明顯等特征，發(fā)情鑒定一般采用公羊試情，其準確性主要取決于輸精員的經驗。最近幾年，研究發(fā)現(xiàn)綿羊的卵泡直徑超過5 mm 以上時，利用B 超很容易鑒別并形成良好聲像圖，可以根據(jù)綿羊卵泡發(fā)育情況來預測排卵時間，能為操作人員提供輸精較適宜時機[26]。但利用B 超進行發(fā)情鑒定存在設備成本高、對操作人員要求高等問題，在羊場普遍應用存在一定難度。

綿羊輸精方法主要有陰道輸精法（Vaginal artificial insemination，VAI）、子宮頸輸精法（Cervical Artificial Insemination，CAI）、經子宮頸輸精法（Post-cervical Insemination，PCAI）和腹腔鏡輸精法（Laparoscopic Artificial Insemination，LAI）4 種，技術要點及效果見表1。

Eppleston 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，輸精深度每增加1 cm，受胎率增加7%～12%，即輸精部位越接近受精部位，輸精效果越好。一些研究者通過改進常規(guī)輸精器或輸精前注射松弛子宮頸激素等手段增加綿羊輸精深度，但冷凍精液的受胎率提高幅度不大[28]。早期冷凍精液輸精試驗多采用傳統(tǒng)子宮頸輸精法，該輸精方法操作雖然便捷，但輸精量大、情期需多次輸精（2～3 次）和受胎率較低。目前在綿羊上常規(guī)手術法或腹腔深部位（子宮角）輸精是適合冷凍精液輸精的有效方法。手術法和腹腔鏡可以清晰觀察到綿羊卵泡和排卵點，是目前最直觀、最準確的發(fā)情鑒定方法，能將少量冷凍精液越過子宮頸送至離受精部位更近的一側或雙側子宮角，理論上能達到近100%的受胎率。其中，腹腔鏡深部位輸精法雖然對設備和操作有較高要求，但與手術法相比具有微創(chuàng)、出血少和術后母羊恢復快等優(yōu)點。早在20 世紀80 年代，腹腔鏡輸精法在澳大利亞等養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達國家就已廣泛用于綿羊冷凍精液的輸精。國內，腹腔鏡技術最早應用于綿羊胚胎移植中，直到90 年代才開始有用于深部位輸精的報道。張堅中等[29]、石國慶等[30]和王軍建等[31]先后利用腹腔鏡技術進行綿羊冷凍精液輸精試驗，情期受胎率在65.2%～75.8%。目前，國內一些專業(yè)化公司已建立了同期發(fā)情-腹腔鏡輸精技術體系并實現(xiàn)了商業(yè)化，能為國內綿羊冷凍精液的應用提供較完善的服務。

表1 綿羊的常用輸精技術[25]

一般認為，在綿羊發(fā)情的適宜時間范圍內輸入的有效精子數(shù)比輸精次數(shù)更為重要，但適宜的輸精時機較難把握，故綿羊鮮精或冷凍精液的常規(guī)方法輸精，通常采用多次輸精來提高受胎率。以冷凍精液為例，一般在發(fā)情早期進行第1 次輸精，間隔8～24 h 再進行第2 次輸精，受胎率可提高12.5%～25.9%[25-26]；也有報道在情期內進行3 次輸精，但能否提高受胎率存在爭議。可見，采用常規(guī)輸精法對冷凍精液的輸精量有較高要求，而手術或腹腔鏡輸精法可以大大減少輸精量，且只需要輸精1 次即可。

同期發(fā)情技術能通過激素控制并調整綿羊群體的發(fā)情周期，使它們在特定的時間內集中表現(xiàn)發(fā)情，已在集約化、規(guī)?；木d羊育種和生產企業(yè)中廣泛應用，尤其與腹腔鏡輸精法結合并發(fā)展成為一個較成熟的技術體系，能大大提高鮮精或冷凍精液的受胎率[32]。目前，在綿羊上還沒有較成熟、高效的非手術法深部位輸精方法，在今后相當長時間內綿羊冷凍精液最有效、可行的輸精方法仍然是結合同期發(fā)情的腹腔鏡輸精法。

2 通過產研結合促進綿羊精液冷凍保存技術發(fā)展及應用

2.1 國內科研單位與綿羊育種企業(yè)建立優(yōu)秀種公羊“精子庫”的迫切性和必要性 我國地方綿羊品種在世界綿羊遺傳資源中具有重要的地位，但目前地方綿羊品種原有的優(yōu)良特性逐漸退化，部分品種甚至已瀕臨絕種或絕種。其原因包括幾個方面：第一，國內綿羊育種長期受肉用性能為主的市場導向影響，大量引入、飼養(yǎng)外來肉用品種對地方品種進行雜交改良，造成我國固有綿羊品種遺傳多樣性和純種數(shù)量受到破壞和下降；第二，人們對地方品種的保護意識不足，用于地方綿羊品種保存的經費極為有限，而傳統(tǒng)的活體保種需要建立專門化的保種場，基礎建設成本較高；第三，我國部分綿羊育種、生產企業(yè)及保種場大多科技力量較弱，且與相關科研院所銜接不夠緊密，在利用新技術進行遺傳資源保存方面也存在較大困難。近三十年來，由于國外肉用和肉毛兼用的綿羊育種水平的比較優(yōu)勢，促使國內大型綿羊育種和生產單位耗費巨資從歐美養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達國家大規(guī)模、持續(xù)引進優(yōu)秀種羊，如德國肉用美利奴、特克塞爾、無角道賽特、波德代羊、夏洛萊、薩?？撕投挪囱虻缺姸嗳庥闷贩N，為改良我國已有肉羊品種發(fā)揮了積極的作用。故國內引進的大量優(yōu)秀種羊以及自主培育品種/品系也是不可忽視的一個遺傳資源寶庫。

家畜遺傳資源保存除活體保存外，主要有精子、卵母細胞、胚胎及體細胞冷凍保存等形式。其中，精液冷凍保存技術是公認的性價比最高的遺傳資源保存方法。一方面，公畜的遺傳影響、選擇強度、選擇準確性和年更新率等均遠大于母畜，且跨場比較條件下群體變異度擴大，使得保存優(yōu)秀種公畜的遺傳資源更為有意義；另一方面，“精液冷凍保存-人工授精”的技術難度和成本均遠低于“卵母細胞/胚胎冷凍-體外受精/移植”及“體細胞冷凍保存-克隆”等技術體系。以冷凍精液的形式來保存動物遺傳資源始于20 世紀70 年代。在英國和德國等發(fā)達國家，早在七八十年代就已建立了牛、綿羊等冷凍“精子庫”；前蘇聯(lián)也分別冷凍保存了26個品種牛和33 個品種羊的數(shù)十萬份精液[33]。國內的家畜冷凍“精子庫”建設相對滯后，保種仍以傳統(tǒng)的活體保種為主。如“九五計劃”中，我國建立了魯西黃牛的精子和胚胎庫，標志著精子冷凍保存技術開始用于我國家畜遺傳資源保護[34]。然而，國內早期的家畜“精子庫”建設是基于泡沫盒熏蒸、顆粒法冷凍等傳統(tǒng)方法，冷凍精子品質和效率都較低；而當前家畜精液冷凍技術平臺已今非昔比，部分畜牧科研單位和育種企業(yè)已擁有精子冷凍儀、精液的灌裝-封口-標記等先進設備，為提高綿羊“精子庫”的建設水平和效率達到新高度提供了有力保障。地方綿羊品種種質資源保護中，可以由科研單位或育種型企業(yè)發(fā)揮技術和設備優(yōu)勢，為傳統(tǒng)保種場提供精子冷凍保存技術服務和“精子庫”的維護；而企業(yè)的種質資源保存則通過與科研單位及專門化技術公司等社會資源的高效整合，能有效避免重復建設并實現(xiàn)社會資源的高效整合。

基于綿羊精子耐凍性存在明顯的個體差異問題，先對種公羊群體進行精子耐凍性篩選，將耐凍性較好的種公羊精子入庫長期保存，而對精子耐凍性較差公羊則通過體細胞的采集、培養(yǎng)后作冷凍保存，在需要時再用克隆技術將其“復活”。

2.2 國內綿羊育種企業(yè)以冷凍精液取代活體種公羊輸出的必要性 種公羊的活體引種一直是過去和目前國內外引種的主要方式，高昂的引種成本（包括購買和運輸費用）及種公羊飼養(yǎng)及管理成本是造成養(yǎng)羊業(yè)利潤微薄的一個重要因素。此外，對引種單位及所在地域而言，引入遺傳資源意味著面對潛在的生物安全危機。近幾年，政府已加強了對家畜活體引種的規(guī)范和限制，先后出臺了限制畜禽調運、加強畜禽移動監(jiān)管等措施（《中華人民共和國農業(yè)農村部公告第2 號》，2018 年）。2013—2016 年，國內多地區(qū)頻繁發(fā)生嚴重的小反芻獸疫疫情，2018 年非洲豬瘟疫情爆發(fā)，一次又一次地為全社會敲響了生物安全警鐘。家畜活體長途運輸門檻提高會大大增加家畜引種的難度和成本，預示著家畜活體引種被嚴格限制和取代已是大勢所趨。普遍認為，低溫（5℃）和冷凍保存精液是目前能取代種公羊活體引種的可行方式。現(xiàn)有技術條件下，豬液態(tài)保存精液在適宜溫度（5℃）下的有效保存期普遍在2～6 d，輻射地域則取決于運輸條件。但其使用受時空限制明顯，僅適合近距離、短期內使用。

近幾年來，在各級政府的宏觀調控和業(yè)內人士的不懈努力下，國內家畜精液冷凍保存的硬件水平得到質的提升。繼牛之后豬冷凍精液也開始步入商業(yè)化生產進程，廣東溫氏集團、上海祥欣畜禽有限公司等國內育種企業(yè)與科研院所或家畜精液冷凍專門化技術公司合作，并相繼建立冷凍精液商業(yè)化生產平臺，已開始為國內外客戶提供優(yōu)質遺傳資源和配套技術指導。上海農業(yè)科學院畜牧所與上海永輝羊業(yè)有限公司等單位聯(lián)合申報市科委“羊的精液冷凍保存技術研究”，便是產、研結合較好的范例。與牛和豬冷凍精液相比，綿羊冷凍精液實現(xiàn)商業(yè)化生產、銷售還有一定差距。另外，建立綿羊冷凍精液相配套的深部位輸精法，或使客戶接受微創(chuàng)的腹腔鏡輸精方法，也是綿羊冷凍精液廣泛應用的重要前提[35]。

養(yǎng)羊業(yè)完全可以參照豬冷凍精液的成功模式，綿羊育種企業(yè)與科研單位通過資源整合、共建冷凍精液商業(yè)化生產平臺（或成立專門化公司），生產平臺可建立在規(guī)?；d羊育種企業(yè)中，或建立以小型儀器為主、可面向全國客戶提供綿羊精液冷凍技術服務的流動平臺；同時，在原活體種羊銷售網(wǎng)絡基礎上建設綿羊冷凍精液銷售、技術指導等體系，并加強網(wǎng)絡銷售、種羊遺傳信息和售后服務等建設。

可以預見，以冷凍精液形式取代種公羊活體引種，不僅為引種公司安全生產提供有力保障，也能大幅度降低種公羊運輸、飼養(yǎng)、管理及免疫等成本，從而提高綿羊育種和生產企業(yè)的經濟效益。

3 小 結

普遍認為，綿羊冷凍精液的廣泛應用將為其育種和生產模式等帶來極大變化，是養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展史上的一次技術革命。綜上，推動國內大型綿羊育種企業(yè)獨立或與相關科研單位及專門技術服務公司聯(lián)合起來，推動綿羊精液冷凍保存技術發(fā)展并實現(xiàn)冷凍精液商業(yè)化生產，并同步實現(xiàn)我國地方品種和引進品種的優(yōu)秀種公羊遺傳資源有效保存，可加速國內綿羊聯(lián)合育種進展，從而推動我國養(yǎng)羊業(yè)實現(xiàn)育種跨越式、可持續(xù)發(fā)展。