高振東，何 俊

（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128）

自20 世紀90 年代以來，在食品從生產到消費的過程鏈中，可追溯體系的作用日趨凸顯，尤其是對動物性食品安全的重要性，引起了全世界的極大關注。諸多食品質量安全問題，如從世界第一例“瘋牛?。˙SE）”開始，比利時多氯聯(lián)苯二惡瑛事件、丹麥肉類沙門氏菌污染、新西蘭奶粉肉毒桿菌等肉類食品安全事件的發(fā)生，嚴重降低了消費者對動物性食品安全的信任度，動搖了消費者的信心，不利于畜牧業(yè)和社會經濟發(fā)展[1]。在從農場到餐桌的供需消費鏈中，越來越復雜的加工過程使得在最終產品中很難識別最初原材料，且該過程中可能還涉及到不同的運輸和處理方式，牽涉多家工廠以及公司、企業(yè)甚至多個國家[2]。其次，我國作為肉品消費大國，優(yōu)質肉類逐漸成為消費需求增長點，不法商家趁機謀取利益，使用違規(guī)添加劑，導致藥物、重金屬和抗生素等殘留，以至出現(xiàn)以次充好和假冒偽劣產品泛濫等諸多案例[3]。

為保障消費者的知情權，避免多個連續(xù)步驟中不必要的重復測量，使特殊原材料或功能產品（如優(yōu)質肉類、蛋類產品）的銷售過程得到有效監(jiān)督，滿足當前和未來的消費需求（如確認原產地）以及加強對地方品種的保護與研究等，構建完善的動物性食品追溯體系亟待解決。完善的動物性食品追溯體系中需要保持詳細的個體信息、生產加工信息、物流運輸信息、分裝銷售信息等信息流同步一致，最終將匯集信息存儲到中央管理平臺，建立完整的動物個體信息數(shù)據(jù)庫，保障整個產品生產鏈各環(huán)節(jié)可跟蹤與最終產品的可追溯性。標記作為能夠貫穿動物性食品生產鏈的唯一手段，標記技術的好壞尤為重要，生產加工過程中如果出現(xiàn)標記遺落或出錯，造成產品信息丟失或錯漏則會導致追溯鏈斷裂，追溯體系就變得毫無意義，進而造成這些動物性食品安全無法保障[4-5]。因此，標記的穩(wěn)定性和唯一性將直接決定追溯體系的準確性。

本文綜述了不同的追溯標記在追溯體系中的應用情況，分析了生物學特異性遺傳標記的追溯能力差異，并總結了追溯能力最強的SNP 標記技術對物種個體基因組構成的物種起源追溯相關研究進展，以期為開發(fā)利用穩(wěn)定的特異性遺傳標記并構建完善的動物源性追溯體系提供參考。

1 追溯標記的種類及其應用

目前可用于動物追溯的標記技術主要分為非生物學方法和生物學方法兩大類。非生物學標記主要包括形態(tài)學標記、物理標記和理化標記；主要的生物學方法有虹膜識別和DNA 遺傳標記等。

1.1 非生物學追溯標記及其應用 形態(tài)標記主要是利用動物可見或可測量的外部特征（如皮膚、外形、毛色、體型等）進行追溯；物理標記主要是應用機械方法（紋身、烙印、刺青等）、商品條形碼技術、無線射頻識別技術（Radio Frequency Identification，RFID）等進行溯源；理化標記主要有近紅外線光譜技術、蛋白質分析、同位素檢測等。

在物理標記應用方面，21 世紀初，上海市、臺灣省、北京市和山東省在畜禽和食品的安全追溯中均以使用了RFID 技術[6]；安徽省在豬肉生產中使用RFID 標記對飼養(yǎng)和屠宰過程中的信息進行自動采集，采用條形碼對分割肉進行標記，并結合追溯信息體系網絡，初步建成了豬肉生產追溯管理體系[7]；石玉芳等[8]利用二維條碼結合標記轉換技術、數(shù)據(jù)同步技術等，對二維條碼技術在農產品溯源過程進行應用分析，同時實現(xiàn)了商品豬出生到零售全過程的追溯和管理。

在理化標記應用上，徐文杰等[9]應用近紅外光譜分析技術對淡水魚進行了品種的判別分類研究；孫淑敏等[10]應用近紅外光譜分析技術對5 個地區(qū)羊肉產地進行研究，實現(xiàn)了不同物種以及肉類產地的準確溯源（準確率均高于91%）；Slattery 等[11]利用可溶性肌蛋白對新鮮肉牛肉和水牛肉、紅袋鼠肉和灰袋鼠肉的種類進行了精準鑒定，同時利用酯酶同工酶圖譜成功區(qū)分鑒別新鮮綿羊肉和山羊肉、馬肉和驢肉。目前，穩(wěn)定性同位素指紋也是食品產地溯源的有效手段[12]。Camin 等[13]發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的羔羊肉樣的多元素（δ2H、δ13C、δ15N、δ34S）同位素比率之間存在顯著差異。Sacco等[14]和孫淑敏等[15]比較不同地域羊組織中穩(wěn)定性同位素組成的差異，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性δ13C、δ15N同位素比率可以100%判別羊肉肉樣的地域來源。

然而在復雜的動物養(yǎng)殖、生產加工和銷售過程中，由于涉及屠宰、分割等復雜過程，非生物學追溯標記在追溯鏈中應用受限：①形態(tài)學標記基于個體性狀描述動物個體，無法科學區(qū)分不同個體，不能作為追溯標記在追溯鏈中應用；②物理標記在追溯鏈中容易出現(xiàn)標記污染、遺漏、人工失誤甚至信息作假；③理化標記易受肉樣質量和外界環(huán)境等因素的影響，且檢出過程繁瑣復雜。非生物標記由于缺乏穩(wěn)定性和唯一性，在追溯鏈中追溯能力明顯不能滿足目前的食品追溯需求。

1.2 生物學追溯標記及其應用

1.2.1 虹膜識別技術 虹膜特殊的生理結構，被認為是目前最可靠、最有前途的生物特征識別技術之一[16-18]。虹膜結構由遺傳基因決定，其紋理特征具有唯一性、高度穩(wěn)定性，發(fā)育穩(wěn)定后可以保持數(shù)十年幾乎無變化。這些特點決定了虹膜標記不易被復制、偽造或更改，在追溯體系中能有效鑒別物種及個體的唯一性。

我國虹膜識別技術起步較晚，2000—2013 年才逐漸形成自主核心體系，將虹膜識別技術應用到動物生產追溯體系中，保障動物生產和食品安全。方超等[19]以奶牛為例，概述了采用虹膜識別技術進行個體追溯，并詳細介紹了構建基于虹膜識別技術的肉類食品追溯體系的系統(tǒng)流程。Suzaki 等[20]基于100 組馬的虹膜數(shù)據(jù)的識別實驗表明，虹膜識別技術可以進行高精度的馬個體身份識別，即可利用虹膜識別技術建立馬個體鑒別體系。

但虹膜識別技術在實際運用中也存在不足：①大型動物在圖像采集時很難保持靜止，導致采集過程中圖像錯位和失焦，使圖像質量往往較差；②虹膜信息在瞳孔散大和瞳孔縮小時顯著不同[20]；③相較于條碼標記和RFID 標記等非生物學方式，虹膜識別技術雖然準確率很高，數(shù)據(jù)信息準確，但成本、技術要求較高，在大型動物中操作難度較大，且只適用于動物活體追溯。因此，虹膜識別技術在動物性食品的終端消費追溯中受到嚴重制約，但在瀕危及稀有動物的保護中具有很大的開發(fā)潛力。鑒于以上因素，虹膜識別技術雖還沒能進入大范圍使用階段，但在種畜引入、禽類活體交易追溯中有較大的應用前景。

1.2.2 DNA 遺傳標記技術 DNA 標記作為新一代遺傳標記技術，是對未知動物源性食品進行科學鑒別并彌補當前動物追溯體系不足的最優(yōu)標記。從理論上講，只要原產地留有DNA 標記，所有個體都可通過DNA 識別體系追溯到原產地[21]。近年來，國內外已經將DNA 遺傳標記作為標記手段在動物追溯中使用。常用的DNA遺傳標記技術有6 種。

1）限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）。RFLP 是最早出現(xiàn)的以DNA 雜交為基礎的第一代遺傳標記，其標記位點數(shù)量不受限制，結果穩(wěn)定可靠，可重復性好，適合構建遺傳連鎖圖譜，對未知肉樣進行物種鑒別研究應用于追溯體系中[5]。但在使用中，RFLP 存在一些缺陷，如構建DNA 探針步驟繁瑣耗時，DNA 質量要求較高，且接觸放射性物質，存在安全隱患，成本過高等，因此將PCR與RFLP 技術結合應用于動物追溯中，更加簡易安全。利用PCR-RFLP 技術對鯰魚、鮭魚和比目魚進行分析，不論是冷凍、煙熏或熱處理，該技術都能完美鑒別各魚肉所屬物種，是快速鑒定水產肉樣和檢測商品造假的有效且經濟的工具[22-24]。該技術還能準確鑒定牛、豬、羊、雞源性成分，且不受常用烹飪方法的干擾，檢測準確性達100%[25]。但由于PCR-RFLP 技術產出帶型簡單，多態(tài)性不足，僅能鑒別未知肉樣所屬物種，追溯能力不足以精確到個體信息，因此更適用于物種鑒定。

2）隨機擴增多態(tài)DNA（Randomly Amplified Poly morphic DNA，RAPD）。RAPD 技術利用RFLP 的可靠性和PCR 的高效性，對基因組DNA 酶切片段進行選擇性擴增，對于不同基因組DNA，用同一引物擴增即可得到不同帶型進行分子標記研究。由于其擴增產物的多態(tài)性即可反映基因組的多態(tài)性，引物可隨機合成和隨機選定，具有簡便易行（不需要RFLP 分析的預備性工作）且所需DNA 量少等優(yōu)勢，RAPD 技術也能通過動植物的品種（系）和類群鑒定研究應用于追溯體系中。劉德武等[26]用RAPD 標記對6 個品種豬進行了群體遺傳結構分析，在140 個10 堿基隨機引物的擴增產物中篩選出9 個特異性強的引物進行個體DNA 的RAPD 分析，聚類分析結果顯示特異引物擴增產物可明顯鑒別外來豬種和地方豬種。林建新等[27]利用4 個單種引物對羚牛、家牛和黑熊進行區(qū)分，成功構建羚牛、家牛和黑熊DNA 指紋圖譜。由于RAPD 技術能對整個基因組進行多態(tài)性檢測，因此只要篩選到合適的引物，就可找到品種、品系或群體的特征性的RAPD 標記，但依然無法精確到個體，因此更適于進行品種（系）或類群的鑒定。

3）擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。AFLP 是RFLP 與RAPD 相結合的產物，結合PCR 引物與接頭序列識別進行擴增，具有高效、快速、穩(wěn)定、DNA 用量少、多態(tài)性檢出率高、重復性好的特點，通過對動植物的種質鑒定構建遺傳圖譜應用于追溯體系中。Zhao 等[28]使用AFLP 鑒定中國市場中最具代表性的6 個牛品種的89 個個體，8 對引物組合共產生1 095 個多態(tài)性片段，UPGMA（Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Means）聚類分析、PLS-DA 分析后，建立每個樣品的獨特AFLP 指紋，成功區(qū)分所有檢測個體，使之可追溯。大量實驗表明，AFLP 標記在物種的種質鑒別中更加高效便捷，如果2種或多種組合引物一起使用，可以預期AFLP 方法能在更大的樣本量下獲得優(yōu)異的結果，并有助于建立高質量可追溯體系，貫穿整個食品供應鏈。

4）線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mt DNA）。mt DNA 作為細胞質內的遺傳物質，因其分子結構簡單、穩(wěn)定母系遺傳、世代間不出現(xiàn)基因重組、進化速率高等原因，導致mt DNA 比核DNA 更易受遺傳漂變的影響[29-30]。其中線粒體DNA 控制區(qū)又稱為替代環(huán)區(qū)（Displacement-Loop Region，D-loop），是mt DNA 中堿基序列和長度變異最大、最主要的一段非編碼區(qū)，因此mt DNA D-loop 序列被廣泛用于遺傳多樣性及起源進化關系的研究[31]。

Larson[32]采集了324 頭來自40 個國家的80 個代表現(xiàn)代家豬品種和362 頭來自不同地區(qū)的野豬樣本，利用mt DNA 研究豬的馴化起源，結果顯示東南亞擁有最古老的野豬群體，然后逐漸分散至歐亞大陸，揭示了家豬的多點起源。杜金花等[33]、李義書等[34]基于mt DNA D-loop 區(qū)序列分析了彭縣黃雞和儋州雞的遺傳多樣性及其起源進化關系，結果表明彭縣黃雞、儋州雞均為3 個母系起源且遺傳多樣性較低，研究為評估和保護地方品種的遺傳多樣性提供了理論依據(jù)。由于mt DNA嚴格的母系遺傳方式和進化快、無重組等特點，僅能夠準確追溯物種所屬家系，因此更適于用作追溯物種遺傳多樣性起源研究。

5）簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR）。SSR 也稱微衛(wèi)星DNA，即一段簡單的核苷酸重復序列，串聯(lián)重復的核心序列為1～6 bp，串聯(lián)數(shù)目的不同導致SSR 具有高度多態(tài)性（突變率一般在10-3～10-6），由于核心序列串聯(lián)重復數(shù)目不同，使擴增出的PCR 產物不同，凝膠電泳后根據(jù)不同片段大小區(qū)分不同基因型。由于SSR 含量豐富且具有高度多態(tài)性等特點，因而十分適用于進行個體識別、親緣關系鑒定、估測動物種群的育種歷史與遷徙路線等方面[35-36]。吳瀟等[37]、阮泓越等[38]、Zhao 等[39]利用微衛(wèi)星多態(tài)性檢測，在不同豬種和肉牛中分別篩選11、14、16 個特異性SSR 標記，可以成功區(qū)分不同品種的所有個體，并對不同組織進行驗證，匹配準確率高達100%。Dalvit 等[40]驗證和測試了一組12 個SSR 標記，用于評估6 個牛品種的遺傳可追溯體系，結果顯示其中5 個最具多態(tài)性的基因座的區(qū)分率為95%。由此可見，SSR 標記不僅能夠準確追溯肉樣物種，同時還能準確識別肉樣個體，追溯能力強，但SSR 標記存在多態(tài)性豐富導致產出帶型復雜，不利于識別自動化與規(guī)?；热秉c。

6）單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）SNP 標記是誕生于1996 年的第3 代遺傳標記[41]，是指基因組在同一位點上包括轉換、顛換、缺失和插入的單個核苷酸的變異，多態(tài)性豐富且數(shù)量大。Stephens 等[42]在人類近720 kb 的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了3 899 個多態(tài)性位點，大約平均185 個堿基中便有1 個SNP。SNP具有多態(tài)性豐富且數(shù)量大、遺傳穩(wěn)定、檢出速度快，質量高、能實現(xiàn)自動化和規(guī)?；瘷z測等優(yōu)點，其二態(tài)性也利于基因分型，是當前追溯體系中最重要、最有效的遺傳標記技術。張小波等[43]、龍毅等[44]、Heaton 等[45]、Goffaux 等[1]利用SNP 標記在不同豬種和綿羊中進行遺傳可追溯性研究，分別篩選出6 SNPs、16 SNPs、163 SNPs、21 SNPs 可用作DNA 追溯遺傳標記，驗證分析結果顯示區(qū)分效力和準確度均大于99%。Negrini 等[46]將SNP 與貝葉斯統(tǒng)計數(shù)據(jù)結合用于牛的地理可追溯性，對來自不同國家的24 個品種牛肉產品進行鑒別，個體識別到原產地的準確率為93%，其中對4 種歐洲地標性純種高原牛肉鑒別準確率為100%。

SNP 標記非此即彼的二態(tài)性，使SNP 的基因分型結果能夠方便采用數(shù)字化、標準化表示；雖然SNP 標記多態(tài)性低于SSR 標記，但SNP 標記可以通過增加標記位點數(shù)量來彌補多態(tài)性不足的問題。綜合考慮，與其他標記相比，SNP 標記終將成為追溯體系中最熱門，也是最有效的遺傳標記。

不同DNA 分子標記在追溯體系中的比較如表1 所示。

1.2.3 SNP 芯片技術的發(fā)展及在追溯體系中的應用 高通量測序技術和計算機技術的發(fā)展使大規(guī)模獲得畜禽基因組SNP 信息的成本越來越低，測定密度也越來越高，SNP 芯片技術廣泛應用于動物遺傳追溯體系[51]。由于SNPs 在種群間基因頻率差異顯著，數(shù)量多、遺傳穩(wěn)定性高，且隨著SNP 芯片技術的應用，成為近年來篩選個體識別SNPs（Individual Identification SNPs，IISNPs）位點和祖先信息SNPs（Ancestry Informative SNPs，AISNPs）位點、分析種群遺傳結構的重要遺傳標記[52]。因此SNP 標記在追溯體系中不僅能做到物種識別和個體鑒別，還能揭示動物個體基因組品種構成（Genomic Breed Composition，GBC）、解析動物馴化、品種培育和群體遷徙事件之間的歷史關系。

王小鵬[53]對29 個中國地方豬種、2 個培育品種和4 個西方豬種共2 856 個個體進行60K SNP 芯片測序分型后進行遺傳距離、遺傳分化和種群結構分析，最后通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和構建鄰接法進化樹（Neighbor-Joining tree，NJ-tree），篩選出80、100、100、120 個SNPs 分別鑒別西方豬種與中國地方豬種、二花臉豬與其他豬種、萊蕪豬與其他豬種、蘇太豬與其他豬種，并利用驗證群體對標記應用效果進行驗證，PCA 與NJ-tree 的區(qū)分效力均達到99.0%以上，上述不同特異性SNPs 標記分別構建了中國地方豬種、二花臉豬、萊蕪豬、蘇太豬的高質量品種特異性遺傳標記，為準確鑒別和追溯中國地方豬種、二花臉豬、萊蕪豬、蘇太豬提供了一個切實可行的方法。Dimauro 等[54]使用Illumina 50K SNP 芯片對意大利的3 種種公牛（荷斯坦、布朗和西門塔爾牛）進行基因分型，最后選擇了一組48 個高判別性SNP，能準確識別3 個品種并正確追蹤個體。Ramos 等[55]使用Illumina 60K SNP 芯片對構建5 個豬種的品種特異性SNP 芯片進行實驗研究，鑒定出29 146 個可能品種特異性SNP，其中4 441 個包含在Porcine SNP60 微珠芯片中，與beadchip 檢測結果對比后，最終確認了193個SNP 具有品種特異性，在同一群體的另外490 個個體進行驗證，平均檢出率為99.2%；同時研究也表明，品種特異性遺傳標記的可追溯性具有很高的實用性，并證明了SNP 標記可用于物種鑒別和追溯動物物種起源。

表1 DNA 分子標記在追溯體系中的比較[1,47-50]

Colli 等[56]利用90K SNP 密度芯片對10 種河流型水牛與5 種沼澤型水牛進行了分子多樣性水平和種群結構分析，在純河流和純沼澤水牛群體中鑒定出3 個不同的基因庫，追溯了種群和遷徙事件之間的歷史關系，結果顯示河流型和沼澤型水牛均起源于中國、印度、巴基斯坦境內。在山羊的研究中[57]，驗證并揭示了山羊起源于土耳其和伊朗一帶，并通過不同的遷徙路線傳播到歐洲、非洲和亞洲，由于地理和生殖隔離導致了多樣性的區(qū)域子結構。該研究不僅成功追溯山羊種群及其歷史遷徙變化，并為保持山羊基因多樣性提供了科學理論依據(jù)。

同時，利用SNP芯片可估計動物個體的GBC（Genomic Breed Composition），可反映出每個品種（祖先）對于動物個體基因組的遺傳貢獻比例，即可追溯該動物所在群體的培育歷史。已經在合成品種布蘭格斯肉牛（Brangus）和牛肉王牛（Beefmaster）中驗證了它們不同祖先品種的血統(tǒng)構成，并計算了祖先品種對合成品種每個動物個體的遺傳貢獻比例[58]；同時采用SNP 子集混合模型估計牛的GBC，結果顯示，在198 頭日本紅毛和牛（Akaushi）中，5 個SNP 子集在估計GBC 方面表現(xiàn)相似，但1K SNP 子集估算GBC 的性價比最高，且還能通過減少SNP 數(shù)量達到節(jié)約成本的目的[59]。

2 結語與展望

如今，動物生產中面臨著較大的疫病風險，肉類安全問題已經威脅到生產者和消費者的切身利益，因此構建和完善動物追溯體系至關重要。良好的追溯標記作為能夠貫穿跟蹤整個動物生產鏈的主要手段，其穩(wěn)定性和唯一性直接決定追溯體系的追蹤能力。DNA 標記作為最具優(yōu)勢的新一代遺傳標記技術，就像嵌入動物體的隱形身份證，具有高度的穩(wěn)定性與唯一性，不會出現(xiàn)遺失、假冒、損壞現(xiàn)象，是解決當前動物追溯體系中標記穩(wěn)定性缺乏的最好方法。

然而DNA 標記由于多態(tài)性不同導致追溯能力存在差異。在遺傳追溯方面，PCR-RFLP、RAPD 標記由于多態(tài)性不足，僅能對不同物種或品系進行鑒別；AFLP標記雖能追溯至不同的物種與個體，但大規(guī)模使用需要多組合引物量較大，因此只能在小范圍實現(xiàn)；mt DNA由于獨特的遺傳方式，僅能用于鑒別物種家系與遺傳多樣性起源研究；SSR 和SNP 2 種標記不僅能準確鑒別不同肉樣所屬物種，且能追溯不同肉樣個體，追溯效果十分接近，但SSR 標記在追溯時無法準確鑒別動物全同胞個體，追溯能力相對低于SNP 標記。SNP 標記在遺傳追溯技術體系中的優(yōu)勢明顯，不僅能用于品種層次的遺傳標記構建，同時也能用于個體層次遺傳身份證的構建，加上SNP 芯片技術的商業(yè)化應用，利用高密度芯片篩選并構建個體或品種特異性遺傳標記，便可設計低密度芯片應用于整個追溯體系，即使同卵孿生，也可有效區(qū)分，且能在不影響準確率的同時有效降低成本。

綜上所述，隨著動物食品安全的社會需要和生物技術的發(fā)展，DNA 遺傳追溯定會成為動物食品安全追溯技術研究和發(fā)展的必然選擇。而基于基因組信息構建的遺傳身份證是動物及其產品個體鑒別和物種識別最精確且可靠的追溯技術。其中SNP 標記作為追溯標記中最具穩(wěn)定性與準確性的DNA 標記技術，早已成為國內外遺傳追溯研究的熱門標記方法，隨著SNP 芯片技術的成熟和成本的不斷降低，其實用性和應用價值也愈發(fā)高漲。因此，由SNP 芯片構建品種特異性遺傳標簽和個體遺傳身份證的遺傳追溯技術將擁有巨大的市場應用潛力。