閆姿伶，趙欣迪，黃璞祎

(東北林業(yè)大學 野生動物與自然保護地學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

魚體皮膚黏液細胞能分泌多種活性物質(zhì)，如酸性黏多糖、中性黏多糖等，這些物質(zhì)可以有效降低外物對魚體的摩擦作用，具有保護和潤滑功能，能夠保證魚體生命活動正常有序地進行[1-2]，而底棲魚類易受其所在環(huán)境中異物和病原體的侵害，因此，開展底棲魚類皮膚黏液細胞類型與分布的相關(guān)研究具有重要意義。泥鰍Misgurnusanguillicaudatus又稱真泥鰍，隸屬于鯉形目鰍科泥鰍屬，其身體鱗片細小，埋于皮下，大多鱗片已退化[3]；葛氏鱸塘鱧Perccottusglenii俗稱老頭魚，隸屬于鱸形目蝦虎魚亞目塘鱧科，其身體鱗片中等大小，頭和鰓蓋均有鱗片分布[4]。鱗片退化魚類泥鰍和鱗片正常魚類葛氏鱸塘鱧均為底棲淡水經(jīng)濟魚類，是中國北方高寒地區(qū)的特色養(yǎng)殖魚類[5-6]。目前，國內(nèi)外對泥鰍黏液細胞的研究多集中在消化道方面[7-8]，而對葛氏鱸塘鱧黏液細胞的研究幾乎未見報道，為此，本研究中通過對中國東北高寒地區(qū)常見的淡水底棲魚類泥鰍和葛氏鱸塘鱧在4個季節(jié)中皮膚黏液細胞的分布情況進行差異比較，探究淡水底棲鱗片退化魚類和鱗片正常魚類皮膚黏液細胞類型與分布的季節(jié)變化，旨在為高寒地區(qū)淡水底棲魚類養(yǎng)殖和魚病防治等方面提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國高寒地區(qū)淡水底棲魚類泥鰍和葛氏鱸塘鱧為試驗材料，于2018年4、7、9、11月分別在松花江流域哈爾濱段采集健康野生泥鰍和葛氏鱸塘鱧，每次每種魚均采集5 尾，泥鰍體質(zhì)量為(8.5±2.1)g、體長為(13.2±2.5)cm，葛氏鱸塘鱧體質(zhì)量為(14.0±3.8)g、體長為(9.7±1.2)cm。

1.2 方法

1.2.1 組織化學染色 試驗魚采集后立即處死，分別取4個季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧頭部、背部、腹部、尾部皮膚組織若干，將獲取的樣品直接浸入Bouin’s液固定，用常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，用阿利新藍(AB，pH 2.6)和過碘酸雪夫(PAS)試劑染色。

1.2.2 黏液細胞計數(shù) 利用Leica顯微鏡，在43.5 μm×32.6 μm視野下，分別于4個季節(jié)中兩種魚頭、背、腹、尾4個部位皮膚的相應切片中隨機選擇10 個視野進行拍照計數(shù)，共計320 個視野，觀察并統(tǒng)計泥鰍和葛氏鱸塘鱧在不同季節(jié)不同部位的黏液細胞類型和數(shù)目。

1.2.3 黏液細胞分類標準 參照尹苗等[9]對魚類黏液細胞類型的劃分方法，根據(jù)試驗中AB-PAS染色結(jié)果將黏液細胞劃分為以下4種類型：Ⅰ型黏液細胞為紅色，AB陰性、PAS陽性，主要含中性黏多糖；Ⅱ型黏液細胞為藍色，AB陽性、PAS陰性，主要含酸性黏多糖；Ⅲ型黏液細胞為紫紅色，AB、PAS均為陽性，主要含PAS陽性的中性黏多糖及少量AB陽性的酸性黏多糖；Ⅳ型黏液細胞為藍紫色，AB、PAS均為陽性，主要含AB陽性的酸性黏多糖及少量PAS陽性的中性黏多糖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA),用LSD法進行組間多重比較，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細胞的形態(tài)特征

兩種底棲魚類皮膚中4種類型的黏液細胞在不同季節(jié)中均存在，但隨季節(jié)變化呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征：(1)在泥鰍頭部、背部和腹部，春夏秋季皮膚黏液細胞的形態(tài)特征基本一致，藍色Ⅱ型黏液細胞體積最大且形態(tài)以囊狀為主，藍紫色Ⅳ型黏液細胞體積最小且以球狀為主，Ⅲ型黏液細胞體積較大且形狀多為不規(guī)則狀(圖1-A～C、E～G、I～K)，冬季皮膚黏液細胞中Ⅱ型黏液細胞主要以棒狀為主，Ⅳ型黏液細胞以球狀或不規(guī)則狀為主(圖1-D、H、L)；在尾部，4個季節(jié)皮膚黏液細胞中Ⅱ型黏液細胞主要呈棒狀分布，Ⅳ型黏液細胞多呈現(xiàn)不規(guī)則狀(圖1-M～P)。(2)在葛氏鱸塘鱧頭部、背部和腹部，春夏兩季皮膚黏液細胞的形態(tài)特征相似，紫紅色Ⅲ型黏液細胞和藍紫色Ⅳ型黏液細胞以圓形為主，紅色Ⅰ型黏液細胞多呈點狀不均勻分布(圖2-A、B、E、F、I、J)，秋冬兩季皮膚黏液細胞中Ⅲ型黏液細胞以橢圓狀居多，Ⅳ型黏液細胞主要呈圓形分布(圖2-C、D、G、H、K、L)；在尾部，春夏秋三季皮膚黏液細胞的形態(tài)與頭部春夏季基本相同，Ⅲ型和Ⅳ型黏液細胞均呈圓形分布(圖2-M～O)，冬季黏液細胞中Ⅲ型和Ⅳ型黏液細胞多呈現(xiàn)橢圓狀(圖2-P)。(3)泥鰍皮膚黏液細胞內(nèi)容物著色較深且夏冬兩季染色要深于春秋兩季，而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞內(nèi)容物著色較淺。

圖2 4個季節(jié)葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞的顯微鏡觀察(100×20)Fig.2 Microscopic observation of mucous cells in skin of Chinese sleeper Perccottus glenii in four seasons (100×20)

2.2 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細胞的類型分布

泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚中黏液細胞的類型分布隨季節(jié)變化存在顯著性差異(表1，表2，P<0.05)：(1)在泥鰍頭、背、腹、尾4個部位，春季和夏季皮膚黏液細胞均以Ⅳ型黏液細胞數(shù)量居多，其次為Ⅱ型黏液細胞，Ⅲ型黏液細胞數(shù)量較少，幾乎不含Ⅰ型黏液細胞；秋季皮膚中分布有大量的Ⅱ型黏液細胞，其次為Ⅲ型、Ⅳ型黏液細胞，Ⅰ型黏液細胞幾乎無分布；冬季黏液細胞同樣以Ⅱ型黏液細胞為主，其次為Ⅳ型黏液細胞，Ⅰ型和Ⅲ型黏液細胞分布極少。(2)在葛氏鱸塘鱧頭、背、腹、尾4個部位，春季、夏季和秋季皮膚黏液細胞中主要分布的是Ⅲ型黏液細胞，其次為Ⅳ型黏液細胞，Ⅰ型和Ⅱ型黏液細胞數(shù)量很少；冬季皮膚中也以Ⅲ型黏液細胞為主，依次分布的Ⅰ型、Ⅳ型黏液細胞數(shù)量基本相同，Ⅱ型黏液細胞幾乎無分布。

表2 不同季節(jié)葛氏鱸塘鱧皮膚中4種類型黏液細胞數(shù)量

表1 不同季節(jié)泥鰍皮膚中4種類型黏液細胞數(shù)量

2.3 不同季節(jié)兩種魚皮膚黏液細胞總數(shù)的分布

在不同季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧4個部位的皮膚黏液細胞總數(shù)存在顯著性差異(表3，P<0.05)：(1)泥鰍春夏季皮膚黏液細胞總數(shù)的變化范圍主要為200～350，秋冬季皮膚黏液細胞總數(shù)的變化范圍主要為50～150，泥鰍頭部和腹部皮膚黏液細胞總數(shù)的季節(jié)分布依次為春季>夏季>秋季>冬季，背部和尾部黏液細胞總數(shù)的季節(jié)分布依次為春季>夏季>冬季>秋季。(2)葛氏鱸塘鱧4個季節(jié)皮膚黏液細胞總數(shù)的變化范圍主要在10～30，葛氏鱸塘鱧頭部和背部皮膚黏液細胞總數(shù)在春季和冬季相對較多，腹部和尾部黏液細胞總數(shù)在冬季較多。(3)泥鰍皮膚黏液細胞總數(shù)遠遠多于葛氏鱸塘鱧；泥鰍在不同季節(jié)其皮膚黏液細胞總數(shù)不同，春季和夏季中皮膚黏液細胞總數(shù)明顯多于秋季和冬季；葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞在冬季分布較多。

注：箭頭示黏液細胞；Ⅰ為Ⅰ型黏液細胞；Ⅱ為Ⅱ型黏液細胞；Ⅲ為Ⅲ型黏液細胞；Ⅳ為 Ⅳ型黏液細胞;AB-PAS染色,下同Note: Arrows indicate mucous cells；Ⅰ，mucous cell Ⅰ； Ⅱ，mucous cell Ⅱ；Ⅲ，mucous cell Ⅲ；Ⅳ， mucous cell Ⅳ;AB-PAS staining，et sequentia圖1 4個季節(jié)泥鰍皮膚黏液細胞的顯微鏡觀察(100×20)Fig.1 Microscopic observation of mucous cells in skin of loach Misgurnus anguillicaudatus in four seasons (100×20)

表3 不同季節(jié)泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞總數(shù)

3 討論

3.1 泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞形態(tài)及類型的季節(jié)變化比較

本研究結(jié)果顯示，泥鰍在春夏兩季皮膚黏液細胞均以球狀Ⅳ型黏液細胞為主，在秋冬兩季均以囊狀Ⅱ型黏液細胞為主；而葛氏鱸塘鱧在4個季節(jié)中均以圓形或橢圓狀Ⅲ型黏液細胞為主，本試驗中所采集的試驗魚均來自東北高寒地區(qū)哈爾濱，因此，其所處的春夏季環(huán)境溫度明顯高于秋冬季。黃智慧等[10]研究表明，水體溫度的增加會導致水中病原微生物的活力增強，進而對魚體構(gòu)成威脅，但隨著溫度升高，魚體皮膚表面分布的Ⅱ型和Ⅳ型黏液細胞分泌的酸性黏液成分也會隨之增加，可有效防止病原菌侵入魚體。因此，春夏兩季泥鰍體表黏液細胞中Ⅳ型黏液細胞所分泌的酸性黏多糖對泥鰍皮膚起到了很好的保護作用；此外，泥鰍在秋冬兩季皮膚中主要分布的是Ⅱ型黏液細胞，且其體積遠遠大于其他3種類型的黏液細胞，這一特征與魚體的保護機制相適應。劉亞秋等[11]在關(guān)于消化道黏液細胞分布及發(fā)育的研究中也證實，在一定范圍內(nèi)黏液細胞的體積越大，其分泌黏液的能力越強，對魚體越有利。與泥鰍不同，葛氏鱸塘鱧體表黏液細胞多以Ⅲ型混合型黏液細胞為主，有資料顯示，牙鲆在最適生活溫度(21 ℃)下，其皮膚黏液抗體應答強度才能達到最大[12]，說明環(huán)境溫度過低會對皮膚黏液抗體的產(chǎn)生起到一定的消極作用，進而影響皮膚黏液細胞的類型分布，而葛氏鱸塘鱧是中國高寒地區(qū)的特色魚類，其所生活的環(huán)境多處于低溫狀態(tài)[13]，劉德明等[14]研究中也有相關(guān)報道，在魚類體表存在一個臨界溫度，當?shù)陀谶@一臨界溫度時，黏液黏度隨溫度變化不明顯，這對于皮膚黏液細胞類型的分布也會產(chǎn)生一定的影響。

此外，本試驗結(jié)果還表明，泥鰍皮膚黏液細胞中含有較多的酸性黏多糖，而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞中含有較多的中性黏多糖，這與陳楚等[15]的研究結(jié)果一致。泥鰍屬于鱗片退化魚類，其體表直接暴露于水環(huán)境中，因而容易受到水體中各種微生物的侵襲。張婷等[16]對魚類體表黏液分泌機制的研究表明，體表黏液中所含有的酸性物質(zhì)可以殺死魚類皮膚表面的寄生物，從而起到保護機體的作用；國外也有研究發(fā)現(xiàn)，黏液細胞分泌的酸性黏多糖在免疫刺激中發(fā)揮著重要作用[17]；AB染色呈陽性的黏膜細胞比PAS染色呈陽性的黏膜細胞多，可能有利于保護黏膜免受微生物侵襲[18]。因此，泥鰍皮膚黏液細胞中含有的酸性黏多糖在抵抗外物侵襲的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。而葛氏鱸塘鱧屬于有鱗魚類，其體表覆蓋鱗片，水體病原菌對其并不能構(gòu)成過多威脅，因而其皮膚黏液細胞含有較多的中性黏多糖，中性黏多糖主要具有黏著食物、促進食物乳化等功能[19]。

3.2 泥鰍和葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞總數(shù)的季節(jié)變化比較

泥鰍和葛氏鱸塘鱧不同季節(jié)黏液細胞總數(shù)的比較結(jié)果顯示，泥鰍春夏兩季皮膚中含有大量的黏液細胞，且黏液細胞總數(shù)遠遠超過秋冬兩季；而葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞在冬季分布較多。在一定范圍內(nèi)環(huán)境溫度越高，水中病原微生物的數(shù)量也會相應增加，黏液細胞的數(shù)量會受到細菌感染的影響，在不利環(huán)境條件下魚類黏液分泌的增加是魚體內(nèi)存在的一種非特異性機制[20]，因此，泥鰍在春夏兩季中黏液細胞數(shù)量遠多于秋冬兩季，吳紅松[19]通過研究也證明，在不利環(huán)境的刺激之下，魚類機體會試圖利用黏液的抗菌作用以提高其對不利環(huán)境的免疫力；秋冬兩季泥鰍皮膚黏液細胞數(shù)量較少，還可能與泥鰍在低溫環(huán)境中食物獲取量的減少有關(guān)，在對鮭魚的研究顯示，食物不足會引起魚體表皮黏液細胞的密度迅速下降[21]。與泥鰍不同，葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞在冬季時分布相對較多，這可能與其在冬季時的生活習性及黏液的生理作用有關(guān)，曲麗華等[22]對葛氏鱸塘鱧生活習性的研究發(fā)現(xiàn)，葛氏鱸塘鱧是潛伏在水底泥土或水草叢生的泡沼里進行冬眠，故其冬眠時身體周圍存在大量的耐低溫細菌和異物。陳超然[23]研究表明，黏液中有多種溶菌活性物質(zhì)存在，能夠抵御異物和病原體的侵襲，在機體防御中起著主要作用，這能夠很好地解釋冬季葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞數(shù)量較多的現(xiàn)象。

此外，本試驗結(jié)果還表明，泥鰍皮膚黏液細胞總數(shù)遠遠多于葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞總數(shù)，這可能與魚體鱗片的發(fā)達程度有關(guān)，鱗片不發(fā)達的魚類其黏液分泌量相對較大[24]。泥鰍身體上的鱗片細小，埋于皮下，鱗片大多退化[1]，而葛氏鱸塘鱧身體上的鱗片中等大小，頭和鰓蓋均有鱗片的分布[2]，因此，鱗片退化魚類泥鰍皮膚分布的黏液細胞總數(shù)要多于鱗片正常魚類葛氏鱸塘鱧，這與無鱗魚鲇及歐洲鰻鱺皮膚中含有大量的黏液細胞是相一致的[25-26]。楊淞等[27]在對無鱗魚似鲇高原鰍的研究中報道，底棲魚類長期生活在泥沙較多的水體底部，其體表分泌的大量黏液能夠使魚體保持清潔及潤滑，對于魚類體表而言十分重要，而泥鰍和葛氏鱸塘鱧同為底棲型魚類，其體表均會受到泥沙中異物的侵害，但由于葛氏鱸塘鱧皮膚表面有鱗片作為保護屏障，因而相比于泥鰍，葛氏鱸塘鱧皮膚黏液細胞總數(shù)較少。