李樹萍 彭俊超 李萌 安全 王昌濤 趙丹

摘要：對薏仁多糖的水提和發(fā)酵的提取條件進行了優(yōu)化，并研究了薏仁多糖提取液抗氧化活性和透皮吸收效果。結(jié)果表明，薏仁多糖水提的最佳條件為料液比0.11（g/mL），溫度90 ℃，時間7 h;發(fā)酵最佳條件為釀酒酵母，料液比0.1（g/mL），時間54 h，pH 4.5;薏仁多糖發(fā)酵提取率約為水提的3倍。薏仁多糖發(fā)酵液抗氧化性優(yōu)于水提液;薏仁多糖發(fā)酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2，水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。

關(guān)鍵詞：薏仁多糖;水提;發(fā)酵;抗氧化;透皮吸收

中圖分類號：TQ464.1; R284?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0174-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.035

薏仁（Coix seed）又名薏苡仁、苡米、苡仁等，在河北、陜西、河南等地區(qū)產(chǎn)量豐富，被稱為“世界禾本科植物之王”[1]。薏仁中含人體所需的亮氨酸、精氨酸等必需氨基酸以及礦物質(zhì) [2]，且薏仁中的薏八醇及β、γ兩種谷甾醇具有很高的藥用價值，這也是薏米具有防癌作用的秘密所在 [3]。薏米淀粉糊性質(zhì)穩(wěn)定，沉降速度較緩慢，較之其他淀粉類的成品不易老化[4]。薏仁不飽和脂肪酸含量較高，且含有具有抗氧化性很強的奇數(shù)碳鏈脂肪酸，具有減輕血液中超量膽固醇、加大細胞膜透性、阻遏心肌組織與動脈硬化等功能[5]。薏仁多糖是薏仁的主要有效成分之一，徐梓輝等[6]運用四氧嘧啶破壞胰島細胞，建立了糖尿病小鼠的模型，研究發(fā)現(xiàn)薏仁多糖對阻遏肝糖原分解、肌糖原酵解和抑制糖異生具有一定效用，由此達到降低血糖濃度的作用[6]。植物多糖有許多藥理作用如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤作用[7-13]，降血糖、血脂作用[14-17]，抗輻射、抗菌、抗病毒作用[18-20]，抗氧化、抗衰老作用[21-23]等。本研究旨在通過對薏仁的水提、發(fā)酵試驗，優(yōu)化薏仁多糖的提取條件，以達到對薏仁的充分利用。同時，研究其抗氧化性，并通過透皮吸收實驗，對發(fā)酵與水提多糖的透皮吸收效果進行比較，為其在人體抗衰老及透皮吸收中的應(yīng)用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

鼠皮購自北京海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠，薏仁為市售;維生素C購自國藥集團化學(xué)有限公司;Tris堿、濃HCL、硫酸、苯酚、葡萄糖、DPPH、焦性沒食子酸購自北京化工廠。

BS2202S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;RJ-TGL-16B型離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）;T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;DSHZ-300型恒溫水浴振蕩器（江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠）;HH.S21-Ni4型電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）;YT-CJ-1ND型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術(shù)公司）;HC-268型透皮擴散池（天津正通科技有限公司）;A2492型分析天平（北京福海科技技術(shù)有限公司）;HH·SY21-Ni4型恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）。

1.2?試驗方法

1.2.1?薏仁多糖提取工藝?熱水浸提法：薏仁粉碎后過40目篩，熱水浸提，以1 800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后量取上清液;微生物發(fā)酵法：取乳酸菌/酵母菌進行菌種活化，待菌種生長至對數(shù)期，取200 μL菌液進行接種，發(fā)酵提取，并在121℃下滅菌30 min，1 800 r/min離心10 min后量取上清液。

1.2.2?薏仁多糖樣品含量測定?多糖含量的測定參考文獻[24]。

1.2.3?水提薏仁多糖的單因素探究?料液比對提取率的影響：提取溫度80 ℃，時間6 h，pH?5。選 取 5個液料比梯度?0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 （g/mL），取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

溫度對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），pH 5，時間6 h，選取5個溫度梯度50、60、70、80、90 ℃。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

pH對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），提取溫度80 ℃，時間6 h，選取5 個pH梯度 4、5、6、7、8 。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

提取時間對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），提取溫度80 ℃，pH 5。選取5個時間梯度2、4、6、8、10 h。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

薏仁多糖提取率=薏仁多糖濃度×提取液總體積/薏仁干重×100%

正交試驗設(shè)計：在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進行正交試驗，采用三因素三水平法進行設(shè)計，以確定提取多糖的最佳工藝（表1）。

1.2.4?發(fā)酵法提取薏仁多糖的單因素探究?菌種對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），時間36 h。乳酸菌：溫度37 ℃，pH 6.5;酵母菌：溫度28℃，pH 5.0。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

料液比對提取率的影響：時間36 h，pH 5.0（酵母菌）和6.5（乳酸菌）。料液比梯度0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 （g/mL）。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

提取時間對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），pH 5.0（酵母菌）和6.5（乳酸菌）。時間梯度12、24、36、48、60 h。取一定量的 多糖溶液測定多 糖 量，從而得到提取率。

pH對提取率的影響：料液比0.1 g/mL，時間36 h。pH梯度4、5、6、7、8。取一定量的 多糖溶液測定多糖含 量，從而得到提取率。

薏仁多糖提取率=薏仁多糖濃度×提取液總體積/薏仁干重×100%

正交試驗設(shè)計：在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進行正交試驗，采用三因素三水平法進行設(shè)計，以確定提取薏仁多糖的最佳工藝（表2）。

1.2.5?薏仁多糖提取液抗氧化活性檢測?對DPPH自由基清除作用的測定：取3 mL薏仁多糖提取液（不同梯度：稀釋至1、2、4、8、16倍）與2×10-4?mol/L的DPPH溶液3 mL混勻，作為A1管;取3 mL的無水乙醇與濃度為2×10-4?mol/L的DPPH溶液3 mL混勻，作為A2管;取3 mL的無水乙醇與薏仁多糖提取液3 mL混勻，作為A3管;反應(yīng)30 min，在517 nm下分別測定A1、A2、A3管吸光度。清除率計算公式：清除率（%）=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

對超氧陰離子清除作用的測定（鄰苯三酚自氧化法）：取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，在25 ℃水浴中預(yù)熱20 min;加入0.1 mL不同濃度梯度的薏仁多糖提取液和0.4 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min;滴加8 mol/L 鹽酸1.0 mL，終止反應(yīng);將Tris-HCl緩沖液作參照，以0.1 mL蒸餾水代替薏仁多糖提取液作為空白對照組，在299 nm處測定吸光度，計算其清除率。取不同濃度薏仁多糖提取液各0.1 mL，加超純水5.9 mL，測量其在299 nm處的吸光度，讀數(shù)為A本底。超氧陰離子自由基清除率= （A1-A2+A本底）/A1×100%（A1為空白組平均吸光度，A2為試樣組平均吸光度）。

1.2.6?透皮吸收試驗?制備鼠皮：將豚鼠麻醉后斷頸致死，處理其腹部毛發(fā)，涂抹脫毛膏并放置5 min后刮去，生理鹽水清洗，后剝?nèi)∑涓共科つw，去除皮下脂肪并洗凈，用保鮮膜包裹，置于-20 ℃冷藏備用。將豚鼠皮膚固定于擴散池上下室之間，接受池盛取生理鹽水，樣品池（沒有多糖）則盛取5 mL薏仁多糖提取液。在32 ℃下以400 r/min不間歇攪拌，之后于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h分別吸取1 mL接受液，并補充1 mL的生理鹽水。每個樣品做3個平行試驗。

2?結(jié)果與分析

2.1?水提法單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1?料液比對提取率的影響?水提薏仁多糖的提取率受多種因素影響，料液比就是其中之一。料液比是指薏仁的質(zhì)量與作為浸提液水的體積的比（g/mL）。如圖1所示，在薏仁多糖的料液比作為變量時，可以發(fā)現(xiàn)薏仁多糖的提取率受到其影響較大。在料液比0.05～0.10 （g/mL）時，提取率急劇地上升，在0.10 （g/mL）時，其提取率達到峰值，而在0.10 （g/mL）以后，其提取率卻逐漸下降，這可能是由于薏仁溶液相對過于濃稠，導(dǎo)致其提取率下降。

2.1.2?溫度對提取率的影響?溫度的高低是影響水提薏仁多糖提取率的又一因素。如圖2所示，在薏仁多糖的提取溫度為變量時，提取率變化范圍較大，在80 ℃以前提取率不高，而在90 ℃時則急劇上升，薏仁多糖的提取率隨溫度升高而升高，這可能是因為溫度達到一定值時，其相關(guān)反應(yīng)較為劇烈。

2.1.3?pH對提取率的影響?pH對水提薏仁多糖的提取率也有影響（圖3）。pH為4～6時，提取率是緩慢上升的;當(dāng)pH為6時，其提取率達到巔峰，之后提取率有所下降?？赡苻踩识嗵菍ζ嵝缘沫h(huán)境較為適應(yīng)，故提取率較高。不過總體來說，pH對薏仁多糖提取率的影響不大。

2.1.4?提取時間對提取率的影響?提取時間的長短也會影響水提薏仁多糖的提取率。由圖4可知，薏仁多糖的提取時間為2～6 h時，薏仁多糖的提取率是逐漸升高的，其在6 h時達到峰值，6 h后其提取率逐漸下降，原因可能是隨著時間的增加薏仁多糖降解，從而導(dǎo)致其提取率降低。

2.2?發(fā)酵法提取單因素優(yōu)化結(jié)果

2.2.1?不同菌種對提取率的影響?不同的菌種對發(fā)酵法提取薏仁多糖的提取率影響不同。由圖5可知，從保加利亞乳桿菌和釀酒酵母這兩種常見菌種中選取，釀酒酵母在適宜環(huán)境下的提取率較保加利亞乳桿菌更高，因此，發(fā)酵提取的3個單因素條件的菌種選取釀酒酵母。

2.2.2?液料比對提取率的影響?在其他條件固定的情況下，以薏仁多糖的料液比作為惟一的變量時，由圖1可知，當(dāng)料液比在0.10 （g/mL）時，薏仁多糖的提取率達到峰值，之后薏仁多糖的提取率逐漸降低，這可能是由于在料液比較高時發(fā)酵不夠充分。

2.2.3?提取時間對提取率的影響?當(dāng)其他條件固定、薏仁多糖的提取時間為惟一的變量時，由圖6可知，在時間為48 h時，提取率達到峰值，在12～48 h，隨時間的增加而提取率升高，48 h后則有所下降。推測其提取率下降的原因可能是部分多糖分解，也可看出提取時間對發(fā)酵法的影響較大。

2.2.4?pH對提取率的影響?在發(fā)酵提取薏仁多糖時，若保持其他條件不變，僅pH變化時，由圖7可知，在pH 4～5時提取率是升高的，在pH 5時達到峰值，而后有所衰減，表明pH對發(fā)酵提取薏仁多糖具有一定的影響。

2.3?水提法和發(fā)酵法提取薏仁多糖的正交條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1?水提法正交試驗?由表3的極差分析可知，水提法提取薏仁多糖最佳組合為A3B2C3，即料液比0.11（g/mL）、溫度90 ℃、提取時間7 h。水提法提取薏仁多糖因素的排序為：料液比>提取溫度>提取時間。最后，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果提取薏仁多糖，提取率為3.83%。

2.3.2?發(fā)酵法正交優(yōu)化?由極差分析可知，發(fā)酵法提取薏仁多糖最佳組合為A3B2C1，即提取時間54 h、pH 4.5、料液比0.1（g/mL）。影響發(fā)酵法提取薏仁多糖因素的排序為：提取時間>pH>料液比。按照優(yōu)化結(jié)果提取薏米多糖，提取率為11.50%。

2.4?薏仁多糖抗氧化性研究試驗結(jié)果

2.4.1?DPPH清除率?由圖8可知，薏仁多糖水提液的DPPH清除效率較高，在未稀釋時可達到約68%，而在稀釋約4倍后清除率小于50%，隨著其稀釋比例增加其清除率降低較多。發(fā)酵法所得的薏仁多糖的DPPH清除率較高，其在未稀釋時可達到約74%，而在稀釋約4倍后清除率小于50%，隨著稀釋比例增加其清除率降低較多。

2.4.2?超氧陰離子清除率結(jié)果分析?超氧陰離子具有免疫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，但積累過多會對細胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機體細胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。由圖9可知，水提所得薏仁多糖的超氧陰離子清除效率較低，其在未稀釋時可達到約47%的清除率。薏仁多糖發(fā)酵液的超氧陰離子清除效率較高，其在未稀釋時可達到約66%的清除率，稀釋2倍后則清除率小于50%，其后清除率隨著稀釋比例的增加而逐漸下降。

2.5?透皮吸收試驗結(jié)果

2.5.1?水提最優(yōu)條件透皮結(jié)果?透皮吸收是指外用制劑（薏仁提取液）施于正常的皮膚表面（鼠皮）后，吸收進入全身血液循環(huán)的過程。由圖10可知，試驗時間為0～8 h時，其吸收效果迅速上升，在8 h時達到峰值，而在8 h之后其吸收則是有所衰減，直至趨于不變。薏仁多糖水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。

2.5.2?發(fā)酵最優(yōu)條件透皮結(jié)果?由圖10可知，發(fā)酵法的吸收效果比較反復(fù)，其在10 h時達到峰值，之后吸收效果則是有反復(fù)。薏仁多糖發(fā)酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2。

3?結(jié)論

通過正交優(yōu)化薏仁多糖的條件發(fā)現(xiàn)：水提薏仁多糖最佳條件為料液比0.11（g/mL），溫度90 ℃，時間7 h。水提法薏仁多糖影響因素的排序為料液比>提取溫度>提取時間。最后，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果提取薏仁多糖，提取率為3.83%。發(fā)酵法提取薏仁多糖最佳條件為釀酒酵母，料液比0.1（g/mL），時間54 h，pH 4.5，發(fā)酵法薏仁多糖影響因素的排序為提取時間>pH>料液比。最后，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果提取薏仁多糖，提取率為11.50%。發(fā)酵法提取薏仁多糖的提取率約為水提法的3倍，此結(jié)果為薏仁的充分利用提供了技術(shù)依據(jù)。根據(jù)薏仁多糖對DPPH和超氧陰離子的清除作用可知，薏仁多糖發(fā)酵液抗氧化性優(yōu)于水提液。薏仁多糖發(fā)酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2，水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。表明薏仁多糖發(fā)酵液透皮效果優(yōu)于薏仁水提液。由于小鼠存在個體吸收效果差異，同時需要3只小鼠，其生理狀況也不同，均會導(dǎo)致試驗結(jié)果受到影響。

本研究通過對薏仁提取多糖的水提法和發(fā)酵法工藝進行優(yōu)化，并對兩種多糖的抗氧化效果和透皮吸收效果進行了檢測。結(jié)果表明，發(fā)酵法提取薏仁多糖提取率更高，同時發(fā)酵法提取得到的薏仁多糖在抗氧化性和透皮吸收方面效果均優(yōu)于水提法，以上結(jié)果為發(fā)酵薏仁多糖作為潛在的抗氧化化妝品、食品的開發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)參考。

參考文獻：

[1] 汪開治. 國外科技簡訊[J]. 植物雜志，2004（1）：48-48.

[2] 趙曉紅. 薏米的營養(yǎng)、醫(yī)用價值及制作飲料的發(fā)展前景[J]. 山西食品工業(yè)，2002（3）：35-36.

[3] 劉月好. 薏米的營養(yǎng)及其在食品中的開發(fā)應(yīng)用[J]. 食品科技，2003（9）：47-49.

[4] 吳雪輝，何淑華，謝煒琴. 薏米淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究[J]. 中國糧油學(xué)報，2004，19（3）：35-37.

[5] 雷正杰，張忠義，王?鵬，等. 薏苡仁油脂肪酸組成分析[J]. 中藥材，1999 （8）：405-405.

[6] 徐梓輝，周世文，黃林清. 薏苡仁多糖的分離提取及其降血糖作用的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，22（6）：578-581.

[7] 李?毓，邱健行，熊帶水，等. 薏苡仁酯和順鉑抑制人鼻咽癌細胞增殖的協(xié)同作用[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，1999（4）：285-287.

[8] LIN G M，LIU L，SHAO W. Microcalorimetry studies on the antibacterial effect of crude monkshood polysaccharide[J]. Journal of Zhejiang university science B，2011，12（7）：563-567.

[9] WANG T，LI Y，WANG Y，et al. Lycium barbarum polysaccharide prevents focal cerebral ischemic injury by inhibiting neuronal apoptosis in mice[J]. PloS One，2014，9（3）： e90780.

[10] 付書婕，王乃平，黃仁彬. 植物多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2008，19（1）：99-101.

[11] 褚珊珊，左紹遠. 植物多糖抗腫瘤作用機制研究進展[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（24）：45-46.

[12] 張彩群，計建軍，王長江. 半夏多糖體內(nèi)抗腫瘤作用與機制研究[J]. 海峽藥學(xué)，2016，28（7）：22-24.

[13] ZHENG Y，WANG Q，ZHUANG W，et al. Cytotoxic，Antitumor and immunomodulatory effects of the water-soluble polysaccharides from lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.） seeds[J]. Molecules，2016，21（11）：1465.

[14] 羅祖友，胡筱波，吳謀成. 植物多糖的降血糖與降血脂作用[J]. 食品科學(xué)，2007，28（10）：596-600.

[15] 吳建芬，馮?磊，張春飛，等. 茶多糖降血糖機制研究[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，15（9）：10-11，13.

[16] 馮?磊，張春飛. 茶葉多糖對實驗性高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的影響[J]. 浙江中醫(yī)雜志，2003，38（5）：221-222.

[17] 曾志將，汪禮國，饒?波，等. 蜂花粉多糖對大鼠降血脂效果研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，26（3）：406-408.

[18] 駱傳環(huán)，王作華，程魯榕，等. 柴胡多糖抗輻射作用的實驗研究[J]. 中草藥，1995，26（12）：645-646.

[19] 林雄平，林彬彬，卓雄標(biāo)，等. 南五味子果實多糖和脂溶性物質(zhì)抗菌抗氧化作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（4）：119-121，168.

[20] 蔡雙璠，楊?揚，吳?蓉，等. 夏枯草多糖及凝膠抗單純皰疹病毒的藥效學(xué)研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2017，19（2）：247-253.

[21] 孫高軍，洪深求，周小兵，等. 不同產(chǎn)地?zé)熑~多糖體外抗氧化活性研究[J]. 合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，41（2）：260-265.

[22] 朗?杰，鄭玉光. 西瓜皮多糖對衰老小鼠抗衰老及降血糖作用[J]. 中國老年學(xué)雜志，2015，35（8）：2196-2198.

[23] YOSHIOKA Y，SANO T，IKEKAWA T. Studies on antitumor polysaccharides of Flammulina velutipes （Curt.ex Fr. ） Sing. I[J].?Chemical & pharmaceutical bulletin，1973，21（8）：1772-1776.

[24] 劉志明，唐彥君，吳海舟，等. 苯酚-硫酸法測定葡萄酒中總糖含量的樣品處理[J]. 中國釀造，2011（2）：158-161.