董 艷,張正海,王 寧,孫宇峰,*,魏連會,宋淑敏,姬妍茹,楊慶麗,石 杰,田 媛

(1.黑龍江省科學院大慶分院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省八一農(nóng)墾大學,黑龍江 大慶 163319)

漢麻籽又稱工業(yè)大麻籽或火麻籽,屬于四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻科、大麻屬一年生草本植物大麻的果實[1]。自古以來漢麻籽一直是食品、油脂以及精神藥物的重要來源[2],也被用于中藥預(yù)防便秘[3]、降低膽固醇[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗衰老[6]、改善記憶[7]等。漢麻籽不僅含有β-谷甾醇、生育三烯酚、木質(zhì)酰胺等生物活性成分,也是良好的蛋白質(zhì)來源,非常適合人類和動物食用[8-9],但因其質(zhì)地堅硬、不易煮熟的特點,制約了加工利用。目前,發(fā)芽萌動的方法己廣泛用于南瓜籽、蘿卜籽、亞麻籽等改善加工特性和適口性、提高其營養(yǎng)價值并降低抗營養(yǎng)因子的含量等方面[10-12]。近年來,有關(guān)漢麻籽發(fā)芽的研究己有報道,Werz等[13]認為漢麻籽發(fā)芽既不會誘導(dǎo)大麻素的形成,也不會改變不飽和脂肪酸的有益特征,但可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎化合物。Frassinetti等[14]對漢麻籽發(fā)芽0、3、5 d的抗氧化作用進行了評價,發(fā)現(xiàn)漢麻籽發(fā)芽后總多酚、類黃酮和黃酮醇含量提高,抗氧化能力增強。但迄今為止,漢麻籽發(fā)芽過程的分子機制仍鮮有研究,蛋白質(zhì)組學的發(fā)展,為研究漢麻籽萌發(fā)過程中不同時期蛋白質(zhì)的差異和功能提供了有效手段。本研究以自然發(fā)芽0、12、24、36、48 h的漢麻籽為研究對象,利用非標記(Label-free)定量技術(shù)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)構(gòu)建出漢麻籽發(fā)芽過程中的表達譜,對比發(fā)芽前后漢麻籽蛋白質(zhì)組學的變化,并對各時間點鑒定出的差異蛋白進行生物學分析,研究其基因本體(gene ontology,GO)富集功能和KEGG代謝通路,旨在更好地了解漢麻籽發(fā)芽不同時期的功能蛋白,為優(yōu)化漢麻籽營養(yǎng)水平給于一定參考,為進步一開發(fā)漢麻籽萌動食品提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻1號漢麻籽采自黑龍江省科學院大慶分院東風農(nóng)場,使其自然萌發(fā),萌發(fā)時間分別為12、24、36、48 h;二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT) 比利時Acros Organics公司;BCA定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)飽和酚 美國Promega公司;胰蛋白酶、Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive質(zhì)譜儀、EASY-n1000高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 賽默飛世爾科技有限公司;5430R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

參考曹曉林等[15]報道的酚提取法對樣品總蛋白提取,冷凍干燥后,采用SDT(0.04 mg/mL SDS,1 mmol DTT,溶解于pH 7.6的Tris-HCl)溶液裂解[16],超聲破碎,離心后取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,BCA定量試劑盒對樣品定量。各組樣品采用超濾輔助樣品制備法進行胰蛋白酶酶解[17],通過C18Cartridge固相萃取柱對酶解肽段脫鹽,凍干后加入40 μL體積分數(shù)0.1%甲酸溶液復(fù)溶,測定280 nm波長處的OD值,對肽段定量[18]。

1.3.2 LC-MS/MS條件及數(shù)據(jù)分析

參考董飛等[19]方法,樣品酶解后,采用納升級液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進行LC-MS/MS分析。

色譜柱:賽默飛EASY column SC200(RP-C18,150 μm×100 mm);流動相:A為0.1%甲酸-2%乙腈溶液,B為0.1%甲酸-84%乙腈溶液;色譜柱以100%的A液平衡,樣品依次經(jīng)上樣柱和分析柱分離,流速為300 nL/min;梯度洗脫:0～85 min,100%～55%A,0%～45% B;85～87 min,55%～0% A,45%～100% B;87～90 min,100% B。

酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細管HPLC分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行ESI質(zhì)譜鑒定[20]。分析時長60 min;檢測方式:正離子;母離子掃描范圍:m/z 300～1 800;一級質(zhì)譜分辨率:70 000@ m/z 200;二級質(zhì)譜分辨率:17 500@ m/z 200;多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比按照下列方法采集:每次全掃描后采集20 個碎片圖譜,得到LC-MS/MS原始數(shù)據(jù),再用Maxquant軟件查庫鑒定并進行Lable-free定量分析[21]。

1.4 生物信息學分析

將未萌發(fā)的漢麻籽作為比較組,通過差異倍數(shù)大于1.5作為篩選標準得到差異蛋白,采用Omicsbean軟件和R verision 3.5.0軟件對目標蛋白進行GO功能注釋、KEGG通路注釋和蛋白聚類分析,生成層次聚類熱圖,基于STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中的信息查找蛋白之間的直接和間接相互作用關(guān)系,生成相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計分析結(jié)果

按照表達倍數(shù)變化1.5 倍以上的標準篩選差異表達蛋白質(zhì),表達倍數(shù)變化大于1.5 倍表現(xiàn)為上調(diào),表達倍數(shù)變化小于0.67 倍表現(xiàn)為下調(diào)。由此篩選出差異蛋白質(zhì)的結(jié)果如表1所示,漢麻籽發(fā)芽12、24、36、48 h與原點相比分別鑒定出差異蛋白86、106、135、158 種,其中發(fā)芽48 h后上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為103,占差異蛋白質(zhì)總數(shù)的65.2%。

表1 差異蛋白質(zhì)分析結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Statistics results of differential protein analysis

2.2 差異表達蛋白質(zhì)聚類分析

利用R version 3.5.0軟件分析發(fā)芽漢麻籽差異蛋白集合的定量信息,同時對樣品和蛋白質(zhì)的表達量2 個維度進行分類,根據(jù)層次聚類算法對4 個時間點的差異表達蛋白質(zhì)分別進行聚類分析。如圖1所示,顯著性上調(diào)蛋白質(zhì)主要是蛋白/S10、短鏈脫氫/還原酶、果糖二磷酸醛縮酶(酶代碼EC4.1.2.13)、11-S種子貯藏蛋白等,顯著性下調(diào)蛋白質(zhì)主要為豆莢蛋白、IQ基序、非特征蛋白質(zhì)、新生多肽相關(guān)復(fù)合物α亞單位等。

圖1 差異表達蛋白質(zhì)聚類分析結(jié)果Fig. 1 Clustering analysis of differentially expressed proteins

2.3 差異表達蛋白質(zhì)標準化分類體系功能富集分析

差異表達蛋白質(zhì)標準化分類體系,它從生物過程、細胞組分和分子功能3 個角度對蛋白質(zhì)功能進行分類[22]。利用蛋白質(zhì)組學分析軟件對鑒定的所有蛋白質(zhì)進行標準化分類體系功能注釋,如圖2所示。4 組比較組中,參與的生物學過程主要涉及代謝過程、細胞過程、單一生物過程,說明發(fā)芽過程對漢麻籽細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝影響很大。細胞組分主要分布在細胞、細胞組分、細胞器、大分子復(fù)合物、細胞器組分,差異倍數(shù)最高的為乙醛酸循環(huán)體,差異倍數(shù)為8。乙醛酸循環(huán)是油料植物種子脂類代謝的重要途徑,在發(fā)芽過程中脂肪酸經(jīng)乙醛酸循環(huán)產(chǎn)生琥珀酸,后者經(jīng)三羧酸循環(huán)進入糖異生途徑轉(zhuǎn)化為葡萄糖,為種子萌發(fā)提供更多的能量[23]。差異表達基因的分子功能主要包括催化活性和結(jié)合,此外發(fā)芽48 h與三羧酸循環(huán)相關(guān)的琥珀酰輔酶A連接酶活性、檸檬酸合成酶活性、異檸檬酸脫氫酶活性以及糖酵解中的關(guān)鍵酶6-磷酸果糖激酶活性均為原點的7 倍。

圖2 功能富集分析Fig. 2 Functional enrichment analysis

2.4 差異表達蛋白質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

圖3 通路富集分析Fig. 3 Pathway enrichment analysis

常用代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究數(shù)據(jù)庫分析差異表達蛋白質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集[24-26]。如圖3A所示,通過費希爾精確檢驗方法對比較組12 h-原點的差異表達蛋白質(zhì)進行代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析,結(jié)果顯示,氨基酸的生物合成、碳代謝、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、2-氧羧酸代謝、糖酵解/糖異生等重要通路發(fā)生了顯著變化。如圖3B所示,24 h-原點的差異表達蛋白質(zhì)中氨基酸的生物合成、碳代謝、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、三羧酸循環(huán)、蛋白酶體和2-氧羧酸代謝等重要通路發(fā)生了顯著變化。如圖3C所示,36 h-原點的差異表達蛋白質(zhì)中碳代謝、氨基酸的生物合成、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、光合作用-天線蛋白、蛋白酶體、糖酵解/糖異生和核糖體等重要通路發(fā)生了顯著變化。如圖3D所示,48 h-原點的差異表達蛋白質(zhì)中碳代謝、三羧酸循環(huán)、氨基酸的生物合成、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝和2-氧羧酸代謝等重要通路發(fā)生了顯著變化。

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

基于蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫中的信息查找目標蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系,生成相互作用網(wǎng)絡(luò)并對網(wǎng)絡(luò)進行分析。在生物體中,蛋白質(zhì)并不是獨立存在的,其功能的行使必須借助于蛋白質(zhì)間的相互作用調(diào)節(jié)和介導(dǎo)[27]。因此,研究蛋白質(zhì)相互作用形成的網(wǎng)絡(luò),對不同發(fā)芽時間與原點探索蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的分子機制具有重要意義。如圖4所示,通路節(jié)點為差異蛋白所屬的標準化分類體系/代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)條目,顏色由黃色漸變?yōu)樗{色,P值隨之增大。與蛋白關(guān)聯(lián)的線條數(shù)量越多,表明該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵,漢麻籽不同發(fā)芽時間的差異蛋白彼此間及與互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫收錄的其他蛋白間聯(lián)系緊密,主要相關(guān)通路為核糖體、碳代謝、三羧酸循環(huán)、光合生物的固碳作用、氨基酸的生物合成和糖酵解/糖異生等。

圖4 差異表達蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Differentially expressed protein interaction network diagram

3 結(jié) 論

漢麻籽發(fā)芽時蛋白質(zhì)的變化非常復(fù)雜,是影響和提高其營養(yǎng)價值的重要因素[27]。在酶的作用下,蛋白質(zhì)水解為多肽和氨基酸,這些產(chǎn)物又參與分解代謝或合成新的氨基酸,從而使蛋白質(zhì)和氨基酸含量發(fā)生變化[28-30]。本實驗基于Label-free技術(shù)和LC-MS/MS技術(shù)分析漢麻籽在不同發(fā)芽時期的差異表達蛋白質(zhì),并對分離鑒定出來的差異蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)聚類分析、標準化分類體系注釋和代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)注釋的富集分析以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。實驗共鑒定到蛋白質(zhì)為485 個,由蛋白質(zhì)層次聚類分析熱圖可以看出,本實驗得到的差異蛋白質(zhì)信息合理;經(jīng)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能注釋分類和代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)注釋的富集分析后,可以看出多數(shù)蛋白質(zhì)與碳代謝及氨基酸的生物合成有關(guān)。由蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析可以得到全面系統(tǒng)的分子層面的細胞活動模型,以便于今后對分子機制進行深入研究。由于漢麻籽的基因組十分龐大,目前還存在許多未知的基因組鑒定尚未完成,所以漢麻籽的蛋白質(zhì)組學研究將成為探索其萌發(fā)機制的重要途徑。本實驗利用蛋白組學手段確定了漢麻籽中的部分蛋白質(zhì),并完成了漢麻籽部分自身萌發(fā)的相關(guān)代謝通路及蛋白質(zhì)的差異表達,這為漢麻籽后期在食品、藥品等方面的工業(yè)化發(fā)展提供了有效的參數(shù)。