江艷華,王聯(lián)珠,李風(fēng)鈴,曲 夢(mèng),郭瑩瑩,翟毓秀,姚 琳

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋環(huán)境和海產(chǎn)品中廣泛存在的食源性致病菌,能引起人類急性腸胃炎、傷口感染和敗血癥[1]。在世界范圍內(nèi),尤其是亞洲和美國(guó),經(jīng)常有副溶血性弧菌感染疾病爆發(fā)的報(bào)道[2]。在我國(guó),副溶血性弧菌是每年引起食物中毒發(fā)生率最高的微生物病原[3-5]。食源性致病菌控制技術(shù)一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn),副溶血性弧菌作為海產(chǎn)品特有的食源性致病菌,其控制技術(shù)也受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的食源性致病菌控制技術(shù)主要基于抗菌藥物、化學(xué)保鮮劑等化學(xué)制劑,隨著社會(huì)的發(fā)展,食品的安全性以及抗菌藥物引起的耐藥性問(wèn)題引發(fā)人們對(duì)化學(xué)制劑的擔(dān)憂,因此,開(kāi)發(fā)安全性高、高效、低廉的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體是細(xì)菌的病毒,在自然界中廣泛存在,裂解性噬菌體能專一地引起宿主細(xì)胞的裂解而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,為食源性致病菌的控制提供了一種新的手段[6]。噬菌體裂解宿主特異性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低,對(duì)人和動(dòng)物安全,不易產(chǎn)生耐受性,在致病菌的控制方面具有優(yōu)于化學(xué)制劑的特點(diǎn)[7-8]。許多食源性致病菌的噬菌體陸續(xù)被分離,并顯示出顯著的殺菌作用,其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越多[9-12]。目前,己報(bào)道的副溶血性弧菌裂解性噬菌體數(shù)量有限,為了豐富該致病菌的噬菌體庫(kù),從中篩選具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株,本實(shí)驗(yàn)對(duì)從貝類樣品中分離到的1 株裂解性副溶血性弧菌噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性分析,并探討該噬菌體對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的控制作用,旨在為其進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

宿主菌為副溶血性弧菌,購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心,編號(hào)為ATCC17802。

噬菌體VpJYP2,由本實(shí)驗(yàn)室從貝類樣品中分離得到,能裂解副溶血性弧菌ATCC17802。

1.1.2 樣品

凍生三文魚(yú)購(gòu)自青島當(dāng)?shù)爻?實(shí)驗(yàn)前采用GB 4789.7—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[13]方法測(cè)定樣品中副溶血性弧菌的污染情況,無(wú)副溶血性弧菌檢出即可用于實(shí)驗(yàn)。將樣品解凍,在低溫條件下無(wú)菌操作將樣品切成約3 cm×5 cm的片狀(約10 g),備用。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京陸橋生物技術(shù)有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯中添加0.75%瓊脂配制而成;弧菌顯色培養(yǎng)基 法國(guó)科瑪嘉公司;聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)8000、平衡酚 北京索萊寶科技有限公司;DNase I、RNase A、蛋白酶K、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 寶生物工程(大連)有限公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氯化銫(CsCl) 生工生物工程(上海)有限公司;SM緩沖液(每升溶液含5.8 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、50 mL 1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl、5 mL 2%明膠溶液,121 ℃高壓滅菌20 min,4 ℃保存)。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海智城分析儀器制造有限公司;生物安全柜 美國(guó)Nuaire公司;JEM-1200EX型透射電鏡 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體的分離純化和效價(jià)測(cè)定

采用雙層平板法進(jìn)行噬菌體的分離純化和效價(jià)測(cè)定[14]。將宿主菌接種于3% NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯中活化,36 ℃培養(yǎng)至約108～109CFU/mL。將采集的貝類樣品勻漿,取10 g樣品加入90 mL 3% NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯中,同時(shí)加入5 mL上述宿主菌懸液,36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,將培養(yǎng)液8 500 r/min離心10 min,收集上清液,用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌,收集到的濾液即為噬菌體懸液。用SM緩沖液對(duì)噬菌體懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,取適宜稀釋度各100 μL與200 μL培養(yǎng)過(guò)夜的宿主菌懸液混合,加入5 mL 3% NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基(溶解后在46～50 ℃保溫),充分混勻后倒于預(yù)先制備好的3% NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體平板上,待其凝固后于36 ℃培養(yǎng)24 h,觀察平板上噬菌斑情況,挑取直徑大、生長(zhǎng)均勻的單斑于SM緩沖液中,適當(dāng)稀釋后按以上分離操作進(jìn)行純化,重復(fù)3～4 次后即得到純化的噬菌體,命名為VpJYP2。采用相同的操作,對(duì)適宜稀釋度的噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù),經(jīng)計(jì)算后獲得噬菌體效價(jià)。

1.3.2 噬菌體顆粒的濃縮和純化

參考文獻(xiàn)[15]方法。將宿主菌培養(yǎng)至濃度約109CFU/mL,以最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)加入噬菌體懸液,培養(yǎng)至細(xì)菌完全裂解。在裂解液中加入DNase I和RNase A至終質(zhì)量濃度為l mg/L,室溫放置30 min。加入NaCl至終濃度為1 mol/L,攪拌使其溶解,冰浴1 h。4 ℃、8 500 r/min離心15 min去除其中的細(xì)菌碎片,收集上清液,加入終質(zhì)量濃度為10 g/100 mL的PEG 8000,緩慢攪拌溶解,冰浴1 h以上,使噬菌體顆粒沉淀。4 ℃、8 500 r/min離心30 min,棄盡上清液,將沉淀懸于適量SM溶液中。加入等體積的氯仿抽提,溫和振蕩30 s,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,回收含噬菌體顆粒的水相。采用CsCl平衡梯度等密度離心,收集純化的噬菌體顆粒,透析,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 噬菌體的生物學(xué)特性分析

1.3.3.1 噬菌體的形態(tài)學(xué)鑒定

取銅網(wǎng)浸入純化的噬菌體懸液中,待其作用5 min,用濾紙吸去多余的液體,用2%的磷鎢酸染色5 min,自然干燥后采用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.3.2 噬菌體核酸的提取和全基因組測(cè)序

參考文獻(xiàn)[15]方法。在純化的噬菌體懸液中加入DNase I至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL、RNase A至終質(zhì)量濃度為5 μg/mL,37 ℃溫育1 h。加入pH 8.0 EDTA至終濃度為20 mmol/mL,滅活DNase I。加蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL、SDS至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,混勻,56 ℃溫育1 h,然后冷卻至室溫。用等量平衡酚抽提,12 000 r/min離心5 min,收集水相,用等量平衡酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,V/V)抽提,12 000 r/min離心5 min,收集水相,再用氯仿-異戊醇(24∶1,V/V)抽提,12 000 r/min離心5 min,取上層水相2 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀噬菌體核酸,12 000 r/min離心5 min,再用70%乙醇溶液洗滌沉淀2 次,用TE緩沖液溶解沉淀核酸。依托生工生物工程(上海)股份有限公司的MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序,采用SPAdes軟件(http://cab.spbu.ru/software/spades)對(duì)序列進(jìn)行拼接,全基因組使用RAST(http://rast.nmpdr.org)進(jìn)行在線注釋,使用在線BLASTp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對(duì)注釋蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1.3.3.3 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[16]的方法,取效價(jià)約108PFU/mL的噬菌體懸液1.0 mL于無(wú)菌EP管中,分別于40、50、60、70 ℃的水浴中作用10、20、30、40、50、60 min,待作用時(shí)間結(jié)束后取出并立即置于冰浴中冷卻,測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.3.3.4 pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[16]的方法,取效價(jià)約109PFU/mL的噬菌體懸液0.1 mL于無(wú)菌EP管中,分別加入0.9 mL pH值不同的3% NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯,36 ℃水浴作用1 h,取出后測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.3.3.5 最佳MOI的測(cè)定

按文獻(xiàn)[16]的方法,將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,調(diào)麥?zhǔn)蠞舛葹?.5,即相當(dāng)于約1×108CFU/mL。按照MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1的比例加入噬菌體和宿主菌,36 ℃、150 r/min培養(yǎng)3.5 h后,12 000 r/min離心10 min,收集上清液測(cè)定噬菌體效價(jià)。以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)的MOI為最佳MOI。

1.3.3.6 一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按文獻(xiàn)[16]的方法稍作改動(dòng),將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,調(diào)菌液麥?zhǔn)蠞舛葹?.5,然后以最佳MOI的比例加入噬菌體液,與宿主菌液混合后36 ℃孵育15 min,然后12 000 r/min離心30 s,棄上清液,用3% NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯洗滌菌體沉淀2 次。加入5 mL 36 ℃預(yù)熱的3% NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯懸浮沉淀并充分混勻,迅速置于36 ℃振蕩培養(yǎng),同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),在0、5 min和之后每隔10 min取樣一次,12 000 r/min離心30 s,取上清液測(cè)定噬菌體在每一時(shí)間段的效價(jià)。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)、噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo),繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 噬菌體對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的減菌作用

1.3.4.1 樣品處理

按1.3.2節(jié)方法獲得高濃度噬菌體懸液(約1011PFU/mL),然后稀釋成適宜的使用濃度。每片生三文魚(yú)表面接種100 μL 1×106CFU/mL的副溶血性弧菌懸液(終濃度為104CFU/g),低溫放置2 h讓其充分吸附到樣品上。取200 μL不同濃度噬菌體懸液(MOI分別為0、1、10、100、1 000、10 000)添加至人工污染了副溶血性弧菌的三文魚(yú)片表面。將處理好樣品置于無(wú)菌封口袋中,于4、15 ℃和25 ℃貯藏2 h,測(cè)定副溶血性弧菌數(shù),確定噬菌體最佳添加量。另取樣品,按以上方法人工污染副溶血性弧菌,然后添加最佳濃度的噬菌體,將處理好樣品置于無(wú)菌封口袋中,分別在4、15 ℃和25 ℃貯藏一定時(shí)間,測(cè)定副溶血性弧菌數(shù)。

1.3.4.2 副溶血性弧菌的計(jì)數(shù)

將10 g樣品加入90 mL磷酸鹽緩沖液中,均質(zhì),制成1∶10樣品勻液。為避免噬菌體對(duì)副溶血性弧菌的干擾,取10 mL樣品勻液,8 000 r/min離心10 min,沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中,取100 μL涂布弧菌顯色培養(yǎng)基平板;對(duì)于菌濃度極低樣品,將10 mL勻液沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中,涂布3 塊平板(檢出限為1 CFU/g)。在36 ℃培養(yǎng)18～24 h,計(jì)數(shù)平板上典型副溶血性弧菌菌落數(shù),從而計(jì)算樣品中副溶血性弧菌含量[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的生物學(xué)特性

2.1.1 噬菌體的形態(tài)鑒定

噬菌體VpJYP2在雙層平板上形成圓形、透明、邊緣整齊的噬菌斑,直徑約為1～2 mm,周圍有暈圈,呈現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬菌斑特征(圖1)。純化的噬菌體VpJYP2經(jīng)透射電鏡觀察,頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu),直徑約64 nm,噬菌體的尾部長(zhǎng)約70 nm,帶收縮性尾鞘,寬約20 nm(圖2)。根據(jù)《國(guó)際病毒分類委員會(huì)第9次報(bào)告》提出的噬菌體分類與命名標(biāo)準(zhǔn),噬菌體VpJYP2屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)肌尾病毒科(Myoviridae)[18]。

圖1 噬菌體VpJYP2的噬菌斑Fig. 1 Plaques of phage VpJYP2

圖2 噬菌體VpJYP2的透射電鏡圖Fig. 2 Transmittance electron micrograph of phage VpJYP2

2.1.2 噬菌體的基因組特性

表1 噬菌體VpJYP2部分ORF功能預(yù)測(cè)Table 1 Functional prediction of some ORF of phage VpJYP2

噬菌體VpJYP2的核酸為雙鏈DNA,基因組全長(zhǎng)為25 363 bp,G+C含量為39.56%。通過(guò)全基因組RAST在線注釋和BLASTp分析,預(yù)測(cè)到該基因組含有45 個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORF),核酸序列長(zhǎng)度在114～1 134 bp之間,對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在37～377 aa之間。其中推定為己知功能的僅有13 個(gè)序列,其余為未知功能的假定蛋白序列,其中16 個(gè)序列未找到具有同源性的序列。表1列出了13 個(gè)預(yù)測(cè)的功能蛋白序列,主要包含DNA復(fù)制和調(diào)控相關(guān)蛋白、噬菌體包裝蛋白、噬菌體頭部和頸部相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白等。ORF1編碼噬菌體核酸外切酶,ORF2編碼噬菌體必需重組功能蛋白,ORF4編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白,ORF43編碼ATP結(jié)合蛋白,為DNA復(fù)制和調(diào)控的相關(guān)基因。ORF23和ORF29編碼噬菌體末端酶,在噬菌體包裝時(shí)起重要作用。ORF17～20編碼噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白,其中ORF17、ORF19和ORF20編碼噬菌體頭部蛋白,ORF18編碼噬菌體頸部蛋白。ORF33和ORF41編碼卷曲螺旋蛋白,通常為結(jié)構(gòu)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的低聚結(jié)構(gòu)域。未預(yù)測(cè)到與己知序列同源的裂解酶和穿孔蛋白基因。

2.1.3 噬菌體的熱穩(wěn)定性

圖3 噬菌體VpJYP2的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of phage VpJYP2

如圖3所示,噬菌體VpJYP2在40 ℃和50 ℃作用1 h后,效價(jià)基本不變,表明其活性不受溫度影響;當(dāng)溫度為60 ℃時(shí),VpJYP2效價(jià)下降緩慢,60 min后降低了1.5(lg(PFU/mL)),VpJYP2保持了較高的活性;當(dāng)溫度高于70 ℃,VpJYP2效價(jià)迅速下降,作用10 min效價(jià)下降了4.5(lg(PFU/mL)),作用20 min后下降了5.6(lg(PFU/mL)),作用30 min后降至檢測(cè)水平以下。結(jié)果表明,高溫會(huì)破壞噬菌體VpJYP2的活性。

2.1.4 噬菌體的pH值穩(wěn)定性

圖4 噬菌體VpJYP2的最適pH值Fig. 4 pH stability of phage VpJYP2

如圖4所示,噬菌體VpJYP2在pH 4～11時(shí),效價(jià)與初始效價(jià)無(wú)顯著性差異,維持良好的裂解活性,說(shuō)明該噬菌體對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較廣;當(dāng)pH值為3時(shí),效價(jià)降低4.2(lg(PFU/mL));當(dāng)pH≤2和pH≥12時(shí),噬菌體基本喪失活性。

2.1.5 噬菌體的最佳MOI

如表2所示,當(dāng)MOI為0.01時(shí),噬菌體VpJYP2感染宿主產(chǎn)生子代噬菌體效價(jià)為3.9×109PFU/mL,在6 個(gè)MOI中最高。因此,該噬菌體的最佳MOI為0.01。

表2 噬菌體VpJYP2的最佳MOITable 2 Optimal multiplicity of infection of phage VpJYP2

2.1.6 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

圖5 噬菌體VpJYP2的一步生長(zhǎng)曲線Fig. 5 One-step growth curve of VpJYP2

如圖5所示,噬菌體VpJYP2感染宿主菌后的5 min內(nèi)效價(jià)沒(méi)有明顯變化,表明其潛伏期約為5 min,從5 min后效價(jià)開(kāi)始上升,一直持續(xù)到60 min,之后效價(jià)趨于穩(wěn)定,說(shuō)明噬菌體裂解期約為55 min。根據(jù)裂解量=裂解末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度計(jì)算得到,噬菌體VpJYP2裂解量=4.5×109/1.0×108=45。

2.2 噬菌體對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的減菌作用

2.2.1 噬菌體的最佳添加量

圖6 不同濃度噬菌體VpJYP2對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的減菌作用Fig. 6 Effect of different concentrations of phage VpJYP2 on reduction of V. parahaemolyticus counts on raw salmon fillets

由圖6可以看出,在4、15 ℃和25 ℃條件下,隨著MOI的增加,樣品中副溶血性弧菌數(shù)逐漸降低。當(dāng)MOI為10 000,即噬菌體添加量為108PFU/g時(shí),在4、15 ℃和25 ℃貯藏2 h后副溶血性弧菌數(shù)降低最多,分別降低了1.4、2.2(lg(CFU/g))和3.4(lg(CFU/g))。表明噬菌體添加量越高,減菌效果越好?？紤]到制備更高濃度的噬菌體會(huì)增加實(shí)驗(yàn)操作的難度和成本,選擇噬菌體的最佳添加量為108PFU/g。

2.2.2 不同貯藏溫度下噬菌體的減菌作用

在生三文魚(yú)樣品中添加108PFU/g的噬菌體,在不同溫度下貯藏時(shí),副溶血性弧菌的變化結(jié)果如圖7所示。在4 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,到7 d降至約1.2(lg(CFU/g));而添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌在8 h即可降至檢測(cè)限以下,此后一直未檢出。在15 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增加,添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)先降低后增加,在8 h時(shí)降至最低,與初始菌數(shù)相比降低了3.4(lg(CFU/g))。在25 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加,添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)迅速降低,在4 h降至檢測(cè)限以下,而后逐漸升高。3 個(gè)溫度下,所有添加噬菌體的實(shí)驗(yàn)組副溶血性弧菌數(shù)均顯著低于未添加噬菌體的對(duì)照組(P＜0.05)。

圖7 不同溫度貯藏條件下噬菌體VpJYP2對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的減菌作用Fig. 7 Effect of phage VpJYP2 on reduction of V. parahaemolyticus counts on raw salmon fillets during storage at different temperatures

3 討 論

噬菌體在環(huán)境中分布極廣,凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所,就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。據(jù)估計(jì),噬菌體豐度是原核生物的5～10 倍左右,是自然界最豐富的生物體[19],因此,自然界提供了豐富的噬菌體庫(kù)。然而,現(xiàn)階段分離到的噬菌體還較少,對(duì)噬菌體的基因信息和應(yīng)用的挖掘也極其有限。副溶血性弧菌作為一種重要的食源性致病菌,對(duì)其噬菌體的研究和該病原菌的重要性很不匹配。

目前分離的副溶血性弧菌噬菌體主要分屬于長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)[20-22]、短尾病毒科(Podoviridae)[16,23-25]、肌尾病毒科[21,26-28]和蓋病毒科(Tectiviridae)[22,29],均為二十面體結(jié)構(gòu),但大小不同,生物學(xué)特性、基因組大小也不同。其中以副溶血性弧菌ATCC17802為宿主菌的噬菌體有qdvp001、VPMS1、VPp1、VPp2和VPp3。噬菌體VPMS1屬于短尾病毒科,頭部直徑60 nm,尾部長(zhǎng)10 nm,基因組大小為42.3 kb[23];噬菌體qdvp001屬于肌尾病毒科,頭部直徑79 nm,尾長(zhǎng)118 nm,基因組大小為35 kb,耐受溫度40～60 ℃,最適pH值為4～10,最佳MOI為0.001[26];VPp2屬于肌尾病毒科,頭部直徑64 nm,尾部長(zhǎng)114 nm,基因組大小為2 kb,最佳MOI為0.000 01,潛伏期為5 min,裂解量為11.1[28];VPp3屬于肌尾病毒科,頭部直徑89 nm,尾部長(zhǎng)106 nm,基因組大小為2 kb,最佳MOI為0.001,潛伏期為25 min,裂解量為45.3[28];VPp1屬于蓋噬菌體科,頭部直徑為44 nm,無(wú)尾,基因組大小為15 kb,最佳MOI為0.000 1,潛伏期為10 min,裂解量為90.3[29]?？梢钥闯?本實(shí)驗(yàn)分離到的噬菌體VpJYP2和這幾株菌在形態(tài)、基因組大小和生物學(xué)特性方面均不同。從VpJYP2的生物學(xué)特性看,該菌株耐受60 ℃以下的溫度,最適pH值范圍較寬,在pH 4～11都能保持很高的活性,最佳MOI低,潛伏期短,裂解量較高,這些特性都賦予該菌株較高的裂解效率和應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序儀對(duì)噬菌體VpJYP2進(jìn)行了全基因組測(cè)序,利用BLASTp進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該噬菌體有16 個(gè)ORF未找到相似序列,而其他ORF與相似序列的同源性也很低。在ORF分析中,未找到裂解酶基因序列和穿孔蛋白基因序列,這增加了挖掘該噬菌體功能基因的難度。后期希望通過(guò)其他方式找到相關(guān)裂解基因,挖掘基因的功能與應(yīng)用。

利用噬菌體控制副溶血性弧菌有少量報(bào)道,這些研究顯示噬菌體可降低海產(chǎn)食品或養(yǎng)殖海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的含量。噬菌體SHOU24在常溫條件下對(duì)即食對(duì)蝦中副溶血性弧菌的生長(zhǎng)具有良好抑制作用,能使副溶血性弧菌數(shù)下降1(lg(CFU/g))[21];此外,采用不同劑量的混合噬菌體VppMIX處理污染的黃魚(yú)片,在25 ℃保藏12 h后,能使樣品中副溶血性弧菌數(shù)比對(duì)照組低1.41～4.98(lg(CFU/g))[22]。噬菌體qdvp001能使養(yǎng)殖牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌數(shù)下降3 個(gè)數(shù)量級(jí)[26];噬菌體VPp1能使實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖規(guī)模下的牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌數(shù)降低2.35～2.76(lg(CFU/g)),能使工廠化養(yǎng)殖規(guī)模下的牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌降低1.11(lg(CFU/g))[30-31];噬菌體pVp-1采用浸浴的方式作用72 h后能使牡蠣食品中副溶血性弧菌由8.9×106CFU/g降低至14 CFU/g,采用噴淋的方式處理12 h后能使副溶血性弧菌由1.44×106CFU/g降低至1.94 CFU/g[32]。這些報(bào)道表明,噬菌體在副溶血性弧菌的控制方面效果顯著。本實(shí)驗(yàn)探討了噬菌體VpJYP2對(duì)生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的減菌作用,結(jié)果顯示,該噬菌體能顯著殺滅生三文魚(yú)片中的副溶血性弧菌,溫度越低,對(duì)樣品中副溶血性弧菌的控制效果越明顯。推測(cè)可能是低溫抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng),并使菌量逐漸減少,噬菌體作用于副溶血性弧菌表面的相對(duì)數(shù)量則會(huì)增加,從而裂解效率升高,導(dǎo)致樣品中殘留的菌數(shù)降低;當(dāng)溫度較高時(shí),副溶血性弧菌生長(zhǎng)速度較快,如果噬菌體作用不到樣品中的副溶血性弧菌,殘余菌會(huì)快速增殖,在樣品中含量升高,同時(shí)噬菌體作用于副溶血性弧菌表面的相對(duì)數(shù)量則會(huì)減少,從而導(dǎo)致裂解效率降低。然而,使用噬菌體處理樣品后,在所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)副溶血性弧菌的含量都顯著低于未用噬菌體處理的對(duì)照組,因此,噬菌體VpJYP2具有一定的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)1 株副溶血性弧菌裂解性噬菌體VpJYP2進(jìn)行生物學(xué)特性分析和在水產(chǎn)品中應(yīng)用。結(jié)果表明:1)噬菌體VpJYP2的噬菌斑清晰,為裂解性噬菌體,其頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu),直徑約64 nm,尾部長(zhǎng)約70 nm,尾鞘帶寬約20 nm,屬于肌尾病毒科(Myoviridae);2)VpJYP2基因組全長(zhǎng)25 363 bp,含有45 個(gè)ORF,推定為己知功能的有13 個(gè),未找到相似序列的有16 個(gè),未發(fā)現(xiàn)裂解酶基因和穿孔蛋白基因序列;3)VpJYP2在40～50 ℃穩(wěn)定,在pH 4～11穩(wěn)定,最佳MOI為0.01,感染宿主菌的潛伏期約為5 min,裂解期約為55 min,裂解量約為45;4)VpJYP2能顯著降低生三文魚(yú)片中副溶血性弧菌的含量,噬菌體濃度越高,殺菌效果越明顯,結(jié)合低溫處理,VpJYP2對(duì)樣品中副溶血性弧菌的控制效果更好。結(jié)果表明,VpJYP2具有作為副溶血性弧菌生物殺菌劑的應(yīng)用潛力。