許 蓉,鄭 淋,趙謀明

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510641)

膠原蛋白是一種白色、無異味的纖維蛋白,是動物體內(nèi)含量最多的蛋白,約占總蛋白的30%,也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,主要存在于動物的皮、軟骨、肌腱、血管、角膜等結(jié)締組織中[1]。其中,II型膠原蛋白與一些蛋白多糖結(jié)合,主要分布于軟骨、玻璃體、髓核、胚胎角膜、視網(wǎng)神經(jīng)膜等組織中,是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分之一。它能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化,增進(jìn)骨骼健康,口服II型膠原蛋白還可誘導(dǎo)自身免疫耐受,抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[2-6]。雞胸軟骨作為雞肉加工中的廢棄物,不但造成極大的浪費(fèi)而且污染環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)雞胸軟骨中II型膠原蛋白的含量高達(dá)50%以上,因此可作為提取II型膠原蛋白的優(yōu)質(zhì)原料。

雖然II型膠原蛋白對關(guān)節(jié)炎有明顯改善作用,但它的三螺旋結(jié)構(gòu)極易被破壞,并且可能伴隨生物活性的喪失[7-8]。而II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的維持依賴于分子間和分子內(nèi)各種作用的協(xié)同效應(yīng),如氫鍵、范德華力、水合作用及二硫鍵在維持其分子結(jié)構(gòu)上共同發(fā)揮作用,疏水作用和離子作用提供了分子間作用力,因此,II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性受到眾多因素的影響,包括內(nèi)因和外因。內(nèi)因主要有蛋白質(zhì)來源、氨基酸組成、氨基酸序列和翻譯后修飾等,而外因主要有pH值、離子濃度、溶劑、溫度等[9-11]。由于II型膠原蛋白在生產(chǎn)加工過程中,所處環(huán)境的pH值和溫度可能發(fā)生變化,這會對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物活性的發(fā)揮產(chǎn)生影響,從而探究溫度和pH值對II型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)的影響是目前亟待解決的問題之一。茹度是II型膠原蛋白的一個(gè)重要特性,且II型膠原蛋白的茹度與維系三螺旋結(jié)構(gòu)的分子間和分子內(nèi)的靜電作用和氫鍵有著密切的聯(lián)系[12-13],從而在一定程度上可以通過茹度的變化推測其結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)性質(zhì)的變化。雖然II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)和茹度特性己有相關(guān)研究,但其茹度的變化與結(jié)構(gòu)的改變及熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系鮮見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過研究溫度和pH值對II型膠原蛋白結(jié)構(gòu)、茹度的影響,并探討茹度變化、結(jié)構(gòu)改變及熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系,以期為II型膠原蛋白的生產(chǎn)加工及其在胃腸道發(fā)揮生物活性機(jī)理的探究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸軟骨非變性II型膠原蛋白 廣東華肽生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、冰乙酸、鹽酸 廣州精科化玻儀器公司;溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R250、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺美國Geniview公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3E pH計(jì) 北京雷磁儀器有限公司;CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司;JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)儀 德國Bruker公司;圓二色光譜(circular dichroism,CD)儀英國Applied Photophysics公司;ME 204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;HAAKE MARS III旋轉(zhuǎn)流變儀美國Thermo Scientific公司;A300全自動氨基酸分析儀德國曼默博爾公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

電泳條件:分離膠體積分?jǐn)?shù)7.5%,濃縮膠體積分?jǐn)?shù)5%。稱取一定質(zhì)量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品,溶于還原型上樣緩沖液中,配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液,于沸水浴中煮沸5 min,10 000 r/min離心10 min,收集上清液用于電泳分析,上樣量為10 μL。染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液,脫色液為10%冰醋酸+10%甲醇+80%蒸餾水混合。電流30 mA,電泳時(shí)間約2 h。

1.3.2 氨基酸組成測定

精確稱取10 mg雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品于水解管中,加入5 mL濃度為6 mol/L鹽酸密封,110 ℃水解24 h。待水解液冷卻至室溫,過濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃脫酸處理,將殘留物用0.1 mol/L鹽酸定容至25 mL。取0.1 mL待測液放入氨基酸自動分析儀中,測定總氨基酸組成。

1.3.3 FTIR分析

取適量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品和溴化鉀,置于瑪瑙研缽中,研磨成粉,裝樣壓片,用FTIR儀對樣品在400～4 000 cm-1區(qū)間進(jìn)行掃描,繪制光譜曲線。

1.3.4 CD分析

稱取一定質(zhì)量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L醋酸溶液中,配成0.15 mg/mL的II型膠原蛋白溶液。

1.3.4.1 不同pH值下的結(jié)構(gòu)分析

將配好的II型膠原蛋白溶液用2 mol/L鹽酸和2 mol/L氫氧化鈉溶液節(jié)pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10,加入1 mm比色皿中,放入CD儀中于28 ℃(低于雞胸軟骨II型膠原蛋白的最低變性溫度)進(jìn)行光譜掃描,繪制各光譜曲線。

1.3.4.2 pH值對熱穩(wěn)定性的影響

取上述pH 2、3、5、7的II型膠原蛋白溶液,分別加入1 mm比色皿中,放入CD儀中于28、30、32、34、36、38、40、42 ℃進(jìn)行光譜掃描,繪制各光譜曲線,并在其正吸收峰波長處,繪制不同溫度下橢圓率的變化曲線。

1.3.5 茹度測定

稱取一定質(zhì)量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L醋酸溶液中,配成10 mg/mL的II型膠原蛋白溶液。

1.3.5.1 pH值對茹度的影響

將配好的II型膠原蛋白溶液用2 mol/L鹽酸和2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10,用哈克旋轉(zhuǎn)流變儀于28 ℃測定其茹度。

1.3.5.2 溫度對茹度的影響

取上述pH 2、3、5、7的II型膠原蛋白溶液,用哈克旋轉(zhuǎn)流變儀分別于28、32、34、36、38、42 ℃條件下測定其茹度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸軟骨非變性II型膠原蛋白的表征

2.1.1 SDS-PAGE分析

由圖1可看出,條帶中分子質(zhì)量為130 kDa的α1鏈顏色較深,含量較高,在200 kDa左右含有少量的β二聚體[14],幾乎不含α2鏈,故II型膠原蛋白純度較高[1,15-16]。

圖1 II型膠原蛋白電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of type II collagen

2.1.2 氨基酸組成分析

表1 雞胸軟骨II型膠原蛋白的總氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of type II collagen

由表1可以看出,該雞胸軟骨II型膠原蛋白的甘氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸和脯氨酸含量最高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別約為23%、14%、12%和11%。亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為24%,其在維持膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用,一般亞氨基酸含量越高,膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,因?yàn)閬啺被嶂械倪量┉h(huán)有助于形成三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的非共價(jià)鍵[2,9],且羥脯氨酸中羥基形成的氫鍵有助于維持膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[17],而組氨酸和酪氨酸含量較低,與前人研究結(jié)果一致[1-2,18]。

2.1.3 FTIR分析

FTIR圖中,酰胺A帶是由N—H的伸縮振動產(chǎn)生的,酰胺B帶是由—CH2非對稱和對稱伸縮振動產(chǎn)生的,酰胺I、II和III帶與II型膠原蛋白的分子序列及三螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān),酰胺I帶是C＝O的伸縮振動和N—H的彎曲振動產(chǎn)生的,酰胺II帶是N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動產(chǎn)生的,為β-折疊和無規(guī)卷曲疊加產(chǎn)生的吸收帶,酰胺III帶是由蛋白酰胺鍵的C—N伸縮振動和N—H變形及甘氨酸中—CH2基團(tuán)和脯氨酸側(cè)鏈的搖擺振動共同產(chǎn)生[3]。1 200～1 400 cm-1為N—H的伸縮振動峰和COO—的對稱收縮振動峰,可能是由于II型膠原蛋白的甘氨酸和羥脯氨酸及脯氨酸的含量較高,使得膠原蛋白在1 200～1 400 cm-1光譜范圍內(nèi)具有其他蛋白質(zhì)所沒有的紅外光譜特征[17,19]。

由圖2可知,該雞胸軟骨II型膠原蛋白有5 個(gè)吸收峰,即酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II和酰胺Ⅲ帶,分別位于3 448、2 937、1 642、1 560、1 243 cm-1處,與研究中報(bào)道的II型膠原吸收峰的位置基本一致[17,20-23],且酰胺III帶與1 450 cm-1處吸收峰比值大于1,說明所提取的II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整[24-26]。

圖2 II型膠原蛋白的FTIR圖譜Fig. 2 FTIR spectrum of type II collagen

2.1.4 CD分析

圖3為該雞胸軟骨II型膠原蛋白在pH 3.0和28 ℃條件下的CD圖,可以看出214 nm波長處橢圓率為0,222 nm波長處有一正吸收峰,這是左旋聚脯氨酸構(gòu)型肽鏈CD的典型特征;200 nm波長處有一強(qiáng)的負(fù)吸收峰,這是II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲的典型特征,與文獻(xiàn)[16,27]中報(bào)道的結(jié)果相似。且正吸收峰的強(qiáng)度可反映II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性,當(dāng)II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞時(shí),正吸收峰會完全消失,負(fù)吸收峰會明顯紅移,而部分變性的蛋白質(zhì)正吸收峰會紅移,強(qiáng)度明顯下降[2,28-29]。

CD法是常用的檢測蛋白二級結(jié)構(gòu)的方法,且由上述結(jié)果可知,該方法能較快速準(zhǔn)確地檢測出II型膠原蛋白在不同條件下的三螺旋結(jié)構(gòu),因此本實(shí)驗(yàn)采用此法來測定不同pH值和溫度下II型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化是可行的。

圖3 II型膠原蛋白的CD圖譜Fig. 3 CD spectrum of type II collagen

2.2 pH值對II型膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖4 pH對II型膠原蛋白的CD圖譜和橢圓率的影響Fig. 4 Effect of pH on the CD spectrum and ellipticity of type II collagen

由圖4可知,pH值對II型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)影響較大。在pH 2.0～9.0范圍內(nèi),隨著pH值的升高,CD的正吸收峰和負(fù)吸收峰均發(fā)生明顯紅移,且吸收強(qiáng)度也有所降低,依據(jù)橢圓率的變化可知,II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)部分解旋(28%～57%),即II型膠原蛋白發(fā)生輕微變性;當(dāng)pH值升高到10.0時(shí),正負(fù)吸收峰又出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象且強(qiáng)度增強(qiáng),解旋程度降為7%,表明II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。因此,在pH 2.0～4.0的酸性條件下,II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)最完整;pH 5.0～9.0的弱酸至弱堿性條件下,II型膠原蛋白有28%～57%發(fā)生變性;pH 10.0時(shí),僅7% II型膠原蛋白發(fā)生變性。

2.3 pH值對II型膠原蛋白熱穩(wěn)定性的影響

圖5 溫度對II型膠原蛋白CD圖譜及橢圓率變化的影響Fig. 5 Effect of temperature on the CD spectrum and ellipticity of type II collagen

由圖5a～d可知,隨溫度升高,不同pH值II型膠原蛋白正吸收峰處橢圓率均逐漸減小,表明其三螺旋結(jié)構(gòu)逐漸解旋而發(fā)生變性,因此可根據(jù)橢圓率的變化情況來推測不同pH值條件下II型膠原蛋白的變性溫度,從而判斷其熱穩(wěn)定性。由圖5e可知,pH 2.0時(shí),II型膠原蛋白的變性溫度約為37 ℃(即1/2橢圓率時(shí)的溫度),完全變性溫度約為39 ℃(正吸收峰消失點(diǎn),即曲線與x軸的交點(diǎn));pH 3.0時(shí),II型膠原蛋白的變性溫度約為39 ℃,完全變性溫度約為42 ℃;pH 5.0時(shí),II型膠原蛋白的變性溫度約為40 ℃,完全變性溫度約為46 ℃;pH 7.0時(shí),II型膠原蛋白的變性溫度約為43 ℃,完全變性溫度約為48 ℃。因此,pH 2.0～4.0時(shí),變性溫度在37～39 ℃之間,熱穩(wěn)定性較低;pH 5.0～7.0時(shí),變性溫度在40～43 ℃之間,且完全變性溫度為46～48 ℃,熱穩(wěn)定性高。即pH值越低,II型膠原蛋白熱穩(wěn)定性也越低,弱酸性至中性范圍內(nèi)較酸性條件下熱穩(wěn)定性高。

2.4 pH值對II型膠原蛋白茹度的影響

圖6 pH值對II型膠原蛋白的黏度的影響Fig. 6 Effect of pH on the viscosity of type II collagen

由圖6可知,pH值對II型膠原蛋白茹度有很大影響。pH 2.0～5.0之間,II型膠原蛋白的茹度先增大后減小,且在pH 3.0時(shí)茹度達(dá)到最大值;pH 5.0～9.0之間茹度最小,且基本保持不變;pH 10.0時(shí)茹度又增大。由于pH 2.0時(shí)酸性較強(qiáng),II型膠原蛋白溶解度大,分子溶脹伸展,氫鍵等引起的分子間作用力小,因此茹度較小;pH 3.0時(shí),II型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)完整,且分子上帶較多正電荷,電荷相互排斥導(dǎo)致分子運(yùn)動阻力增大,表觀茹度增大;pH 5.0～9.0的弱酸性至弱堿性范圍,接近II型膠原蛋白的等電點(diǎn),膨脹度及溶解度小,整個(gè)分子趨向于蜷曲狀態(tài),三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變,且分子上帶電荷較少,電荷相互排斥作用弱,從而分子間運(yùn)動阻力減小,故茹度較小[30-31];pH 10.0與pH 3.0的原理相似,由于分子上的凈負(fù)電荷增多,電荷間較強(qiáng)烈的排斥作用,使得分子運(yùn)動阻力增大,導(dǎo)致茹度增加。結(jié)合2.2節(jié)CD分析結(jié)果知,茹度大小與三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性、溶液中正負(fù)電荷間靜電作用力及分子間氫鍵有關(guān),因此,pH值變化引起II型膠原蛋白茹度大小的變化,一定程度上能夠反映其三螺旋結(jié)構(gòu)的改變,即在pH 3.0～9.0范圍內(nèi),pH值升高,茹度降低,三螺旋結(jié)構(gòu)解旋程度增大。

2.5 溫度和pH值對II型膠原蛋白茹度的影響

由于pH值對雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度變化影響較大,因此為了進(jìn)一步考察其茹度隨溫度的變化,選取pH 2.0、3.0、5.0、7.0條件下具有不同茹度特性的II型膠原蛋白,測定其在28～42 ℃的茹度。由圖7可知,在不同pH值下,雞胸軟骨II型膠原蛋白的茹度均隨溫度的升高而降低,與胡建平[31]不同骨膠原的茹度研究結(jié)果一致。因溫度越高,II型膠原蛋白變性程度越大,分子內(nèi)各種次級鍵被破壞,高度有序的三螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變,因此物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致茹度下降[9]。pH 2.0時(shí),茹度隨溫度變化在34～38 ℃之間存在一個(gè)突變,這是因?yàn)镮I型膠原蛋白發(fā)生了嚴(yán)重變性,導(dǎo)致茹度突然下降,pH 3.0時(shí)茹度隨溫度變化突變區(qū)在38～40 ℃之間,而pH 5.0和pH 7.0均不存在茹度下降突變區(qū),說明此時(shí)II型膠原蛋白未發(fā)生明顯變性,熱穩(wěn)定性高,因此,弱酸性至中性條件較酸性條件下熱穩(wěn)定性高。上述結(jié)果與2.3節(jié)CD分析所得的結(jié)果一致,從而得知,相同pH值下,溫度升高可導(dǎo)致II型膠原蛋白茹度減小,表明II型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖7 pH值和溫度對II型膠原蛋白的黏度的影響Fig. 7 Effect of pH and temperature on the viscosity of type II collagen

2.6 結(jié)構(gòu)和茹度的相關(guān)性分析

由2.5節(jié)結(jié)果可知,隨著溫度和pH值升高,雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度的變化與CD正吸收峰處橢圓率的變化有相似的趨勢。為了更清晰地看出雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度變化與結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系,對II型膠原蛋白在不同溫度以及不同pH值下的茹度和CD吸收峰橢圓率之間進(jìn)行相關(guān)性分析。

表2 II型膠原蛋白黏度和橢圓率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between viscosity and structure of type II collagen

由表2可知,pH 2.0時(shí),II型膠原蛋白的茹度和橢圓率隨溫度的變化在0.000水平上具有強(qiáng)相關(guān)性;pH 3.0和pH 7.0時(shí),二者在0.010水平上具有強(qiáng)相關(guān)性;pH 5.0時(shí)二者相關(guān)性較弱,且相關(guān)性不顯著。在相同溫度下,II型膠原蛋白茹度和橢圓率隨pH值變化在0.003水平上具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.854。因此,II型膠原蛋白在不同溫度下的茹度變化與結(jié)構(gòu)改變之間具有相關(guān)性,溫度越高,其茹度則越低,三螺旋結(jié)構(gòu)解旋程度也越大;II型膠原蛋白在不同pH值條件下的茹度變化與其結(jié)構(gòu)改變也具有相關(guān)性,一定范圍內(nèi),pH值升高,分子上的靜電作用力減小,三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變,茹度降低,而當(dāng)pH升高到一定值時(shí),靜電作用力增大,三螺旋結(jié)構(gòu)又有所恢復(fù),茹度也因此增大。

3 結(jié) 論

雞胸軟骨II型膠原蛋白的三螺旋在pH 2.0～4.0之間較為完整,在pH 5.0～9.0的弱酸至弱堿性范圍內(nèi)輕微解旋(28%～57%),pH 10.0時(shí)僅7%發(fā)生解旋。茹度在pH 2.0～5.0之間先增大后減小,且pH 3.0～4.0時(shí)達(dá)到最大值;在pH 5.0～9.0之間最小且基本保持不變;pH 10.0時(shí)又增大。pH 2.0～4.0時(shí),變性溫度在37～39 ℃之間,熱穩(wěn)定性較低;pH 5.0～7.0時(shí),變性溫度在40～43 ℃之間,且完全變性溫度為46～48 ℃,熱穩(wěn)定性很高。茹度和結(jié)構(gòu)隨溫度變化具有顯著的強(qiáng)相關(guān)性(P＜0.05),溫度越高,茹度越低,三螺旋結(jié)構(gòu)解旋程度越大;在pH 3.0～9.0范圍內(nèi),pH值升高,分子上的靜電作用力減弱,溶液茹度降低,三螺旋結(jié)構(gòu)解旋程度也增大(P＜0.01)。