羅 偉，杜俊威，林秋鳳，鄭耀林，鄢 蕓

(東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523000)

涼茶源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，以中草藥熬制的能消除暑氣及內(nèi)熱而得名[1]。隨著涼茶的開發(fā)應(yīng)用，逐漸開發(fā)出了能舒緩感冒咳嗽、消炎鎮(zhèn)痛的品種。在兩廣(廣東、廣西)地區(qū)流傳著“沒什么問題是一杯涼茶不能解決的”說法，可見民眾對(duì)涼茶的喜愛。涼茶的配方及術(shù)語中蘊(yùn)含了嶺南人民的智慧和深厚文化底蘊(yùn)，早在2006年被納入國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)目錄[2]。

隨著“王老吉”和“加多寶”涼茶品牌的知名度越來越高，涼茶的市場(chǎng)也得到了極大拓展。在兩廣地區(qū)，散裝涼茶鋪隨處可見，并形成了一些知名品牌。但是近年來，部分涼茶商家為了提高品牌的知名度和涼茶的功效，向自制涼茶中非法添加多類化學(xué)藥物的新聞報(bào)道不斷，如中山市涼茶抽檢中發(fā)現(xiàn)對(duì)乙酰氨基酚含量高達(dá)1 679.2 μg/mL。涼茶的非法添加，藥物劑量隨意，多種混合，亦不注意配伍禁忌；銷售時(shí)既無專業(yè)藥師指導(dǎo)使用，又無用量限制。消費(fèi)者在不知情的情況下，大量或長(zhǎng)期飲用，可能會(huì)出現(xiàn)重復(fù)或過量用藥的情況，易發(fā)生嚴(yán)重的藥品不良反應(yīng)，如致過敏樣反應(yīng)，肝、腎損傷等[3-4]。

目前，因涼茶的地域性，市售散裝涼茶中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)仍沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。涼茶樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中所含的黃酮、多糖、有機(jī)酸和生物堿等，易干擾檢測(cè)，非法添加分析難度較大[5-6]。采用應(yīng)用于保健品或中成藥檢測(cè)的薄層色譜法或高效液相法，靈敏度和準(zhǔn)確性不高[7]。檢出陽性樣品，仍需用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)確證[8-9]。

為了調(diào)研東莞市售涼茶的非法添加情況，于東莞各鎮(zhèn)區(qū)共購買了200份不同品牌、不同功效的涼茶，主要有治療風(fēng)寒及風(fēng)熱感冒、清熱祛濕、消炎止痛、止咳平喘等類別。對(duì)乙酰氨基酚、酮洛芬、異丙安替比林和萘普生有解熱鎮(zhèn)痛功效，馬來酸氯苯那敏和鹽酸苯海拉明抗組胺藥物，多用于治療過敏性鼻炎，磺胺甲噁唑、甲氧芐啶協(xié)同具有抑菌和殺菌作用，起到抗炎的效果[10]。張科明等[11]已采用LC-MS/MS測(cè)定涼茶中止咳平喘或解熱鎮(zhèn)痛類的化學(xué)藥物。本研究針對(duì)20種化學(xué)藥物，探索建立一種適用于各種功效的涼茶，便捷準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：LC-20AD高效液相色譜儀(島津公司)，3200 QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)，電子天平(Sartorius公司)，渦旋儀(Vortex公司)，超聲提取儀(Branson公司)。

化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：馬來酸氯苯那敏(99.7%，批號(hào)：100047-200606)、地塞米松(99.6%，100129-201105)、對(duì)乙酰氨基酚(100%，批號(hào)：100018-200408)、潑尼松(100%，批號(hào)：100012-200706)、萘普生(100%，100198-201205)、磺胺甲噁唑(100%，100025-200904)、氨基比林(100%，100503-200301)、非那西丁(100%，100095-198904)、氫化可的松(100，100152-200206)、吡羅昔康(100%，100177-200603)、舒林酸(100%，100335-200001)、酮洛芬(100%，100337-0001)、萘丁美酮(100%，101003-200801)、異丙安替比林(100%，100525-200301)、甲氧芐啶(99.0%，批號(hào)：100031-200304)、枸櫞酸噴托維林(100%，100432-200401)、鹽酸苯海拉明(100%，100066-200807)、磷酸苯丙哌林(100%，100237-199701)、醋酸地塞米松(99.6%，100122-200805)均購自中檢所，甲基潑尼松龍(99.4%，G168078)購自德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司。

試劑：乙腈(批號(hào)：SHBK0734)、甲酸(批號(hào)：K3123 0964239)和甲醇(批號(hào)：I0945607812 )均為德國(guó)MERCK公司的色譜純?cè)噭?/p>

樣品：涼茶樣品購自東莞市各區(qū)，同品牌同功效涼茶采集1份樣品，包括癍沙、熱感咳茶、特效口腔茶、清開靈茶、感冒茶、止咳化痰茶等市面常見品牌、品種，及少數(shù)涼茶店自配方自命名的涼茶樣品200份。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 20種化學(xué)藥物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別按照說明書要求進(jìn)行烘干等前處理，準(zhǔn)確稱取約10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈(1∶1，v/v)溶解后定容，制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取儲(chǔ)備液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，配成10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于-18 ℃環(huán)境中。

臨用時(shí)，取恢復(fù)至室溫的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-甲醇(1∶1)及色譜的流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成500 ng/mL、250 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、30 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于考察方法的靈敏度，各化學(xué)成分的線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品處理 樣品制備：市面上購買的涼茶樣品，貯于4 ℃，測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確吸取恢復(fù)至常溫的涼茶樣品10 mL于50 mL容量瓶，加30 mL甲醇-乙腈(1∶1)，超聲30 min后定容。準(zhǔn)確吸取上述溶液5mL至10 mL容量瓶中，流動(dòng)相B定容，搖勻，0.22 μm濾膜濾過后上機(jī)。

空白試驗(yàn)，除不加試樣外，均按供試品的制備步驟進(jìn)行。

1.2.3 色譜條件 用Waters Atlantic T3柱(2 mm×100 mm，3 μm)進(jìn)行分析，洗脫條件見表1。柱溫35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離子噴霧正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣(GS1)50 psi，輔助氣(GS2)50 psi，電離電壓 5.5kV，離子源500 ℃。各化合物的采集參數(shù)見表2。

表2 20種化學(xué)藥物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)及保留時(shí)間

50 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液檢測(cè)結(jié)果見圖1。各組分的分離度、信號(hào)響應(yīng)均比較高。

圖1 20種化學(xué)藥的總離子流

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理及色譜條件優(yōu)化

2.1.1 預(yù)處理方法選擇 涼茶以中草藥為基礎(chǔ)原料，在熬制過程中溶解出多糖、鞣質(zhì)、色素、氨基酸、生物堿及黃酮等復(fù)雜混合成分[12]。先鹽析脫水，再加入C18粉末，PSA做吸附劑進(jìn)行分散固相萃取，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。因20種化學(xué)藥物品類不同，極性及機(jī)構(gòu)差異大，經(jīng)固相萃取部分目標(biāo)成分含量損失較大。本方法針對(duì)的目標(biāo)成分比較多，使用類極性質(zhì)子溶劑和級(jí)性非質(zhì)子溶劑乙腈-甲醇(1∶1，v/v)稀釋樣品。經(jīng)測(cè)試多品牌不同品種的涼茶樣品，目標(biāo)峰處未見干擾，回收率得到了提高，極大精簡(jiǎn)了前處理步驟和耗材，檢驗(yàn)周期短，經(jīng)濟(jì)便捷，專屬性強(qiáng)，可根據(jù)出峰時(shí)間及離子對(duì)比例，定性非法添加物質(zhì)。

各類中成藥、保健品及功能性食品為達(dá)到宣稱的療效，其中非法添加外源性化學(xué)藥物的含量，通常添加量較高[13]，如對(duì)乙酰氨基酚，一次服用量達(dá)到300～600 mg，才能起退燒作用。所添加的外源化學(xué)藥物的起效劑量，經(jīng)以上步驟稀釋后，濃度能落在液相-質(zhì)譜(LC-MS)定量的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)。方法的檢出限能滿足涼茶非法添加外源性化學(xué)藥物的檢測(cè)需求。

2.1.2 加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn) 流動(dòng)相的優(yōu)化：為縮短檢測(cè)時(shí)間，優(yōu)化峰形，提高分離度，對(duì)比了各類常用流動(dòng)相體系，0.1%甲酸水、0.1%乙酸水、0.02 mol /L乙酸銨溶液，分別組合乙腈、甲醇，上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)使用甲醇有機(jī)相的流動(dòng)相體系會(huì)使對(duì)乙酰氨基酚色譜峰形前延及變寬，氨基比林峰形鈍；水相含有甲酸、乙酸的流動(dòng)相中甲氧芐啶洗脫不完全，對(duì)乙酰氨基酚峰形無改善，其他組分峰形出峰時(shí)間延長(zhǎng)。0.02 mol /L乙酸銨溶液(pH=4.2)能有效改善目標(biāo)成分峰的分叉及拖尾狀況，配合乙腈，分離度及峰形改善。實(shí)現(xiàn)了16 min內(nèi)20種目標(biāo)成分良好分離。

色譜柱的選擇：分別用相同粒徑的Luna C18及Waters Atlantic T3柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)20種目標(biāo)成分的分離效果。發(fā)現(xiàn)Luna柱的基線噪音大，目標(biāo)峰峰形寬、響應(yīng)低的狀況。Atlantic waters T3柱的分離度、峰形及響應(yīng)較好。

2.2 方法的線性、靈敏度、回收率和精密度試驗(yàn)

2.2.1 檢測(cè)方法的線性及靈敏度試驗(yàn) 取按“2.2.1”步驟制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜的條件進(jìn)樣測(cè)定。以各組分的上機(jī)濃度為橫坐標(biāo)，表2中定量離子對(duì)的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各類組分的響應(yīng)高低不同，檢出限 1～30 mg/mL，定量限5～50 mg/mL。線性依據(jù)其定量限的高低進(jìn)行確定，結(jié)果20種化學(xué)藥物在各自的線性范圍內(nèi)，峰面積與測(cè)得濃度線性良好，相關(guān)系數(shù)在 0.996 2～1.000 0之間。線性范圍、曲線和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 20種化學(xué)藥物的線性范圍、校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

2.2.2 回收率和精密度試驗(yàn) 陰性涼茶樣品高、中、低水平添加，各濃度制備6份平行的陽性樣品，按步驟處理，考察回收率和精密度，結(jié)果見表 4。樣品中各化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率在88.13%～114.60%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.18%～9.00%之間。

2.3 涼茶樣品的測(cè)定

測(cè)定從東莞市各鎮(zhèn)區(qū)涼茶店及市場(chǎng)購買的各品牌不同功效的散裝涼茶共200份的添加情況。所有樣品中均未檢出以上20種化學(xué)藥物。

3 結(jié)論及討論

本項(xiàng)目主要研究涼茶中非法添加各類化學(xué)藥物測(cè)定的方法，并對(duì)本市市售涼茶的非法添加情況進(jìn)行摸底。優(yōu)化預(yù)處理方法、色譜、質(zhì)譜條件，完善針對(duì)20種可能非法添加于涼茶的具功效的化學(xué)藥物的定性定量檢測(cè)方法。預(yù)處理樣品過程中，比較了多種固相萃取的填料和方法，但目標(biāo)成分損失大、回收率低，無法兼顧各類目標(biāo)化學(xué)物。已有報(bào)道的非法添加含量高，質(zhì)譜的方法檢出限較低，回歸了最直接的溶解稀釋方法，能滿足監(jiān)管的分析需求。

表4 陰性涼茶樣品中20種化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

此分析測(cè)定方法的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合涼茶樣品的分析要求。涼茶樣品只需要經(jīng)簡(jiǎn)單的稀釋過濾兩步前處理步驟，即可上機(jī)定性定量，簡(jiǎn)化了分散固相萃取及固相小柱凈化的繁瑣步驟，節(jié)約了固相萃取的耗材及有機(jī)試劑的使用。方法應(yīng)用性廣、分析周期短。研究過程中應(yīng)用此方法實(shí)際檢測(cè)200份不同種類的涼茶樣品，測(cè)定的目標(biāo)成分種類多、范圍廣，可應(yīng)用于市售散裝涼茶中非法添加的化學(xué)藥物的快速篩查和測(cè)定，為市售涼茶的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

涼茶樣品的購樣測(cè)定結(jié)果顯示，本市區(qū)域的品牌涼茶店的涼茶中，非法添加狀況較少。2013年本市出臺(tái)了《涼茶店管理暫行辦法》，暫行辦法的有效期至2017年10月31日，暫行辦法中強(qiáng)調(diào)了對(duì)全市涼茶店的監(jiān)管，并規(guī)定涼茶需要當(dāng)天制作和銷售。但是市售涼茶，特別是路邊及流動(dòng)攤販，在銷售時(shí)，可能存在針對(duì)消費(fèi)者描述癥狀，臨時(shí)添加化學(xué)藥的情況。

促進(jìn)涼茶文化的發(fā)揚(yáng)光大，需要保障涼茶的質(zhì)量安全，可通過以下方式：散裝涼茶應(yīng)要求涼茶銷售商家注明涼茶的原料，并提示涼茶為食品，不能代替藥品，使消費(fèi)者獲取更多的商品信息；加強(qiáng)消費(fèi)者的意識(shí)，開展群眾監(jiān)督，引導(dǎo)消費(fèi)者維護(hù)自身合法權(quán)益；在涼茶銷售的旺季，如夏季，進(jìn)行市售涼茶的專項(xiàng)檢查，控制食品衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)；各涼茶生產(chǎn)、銷售單位需建立詳細(xì)臺(tái)賬和人員管理制度，對(duì)涼茶原料進(jìn)行有效溯源和控制，保留從具備合法經(jīng)營(yíng)資質(zhì)的單位購買原材料的購買憑證和供應(yīng)方證照，并配備食品安全管理人員；完善市售涼茶備案制度，涼茶生產(chǎn)單位對(duì)涼茶種類及配方進(jìn)行備案，不添加未經(jīng)批準(zhǔn)為藥食同源的中草藥及涼茶目錄之外的原料，不生產(chǎn)經(jīng)許可的目錄之外的產(chǎn)品；通過擴(kuò)大覆蓋面、突擊抽檢等方式進(jìn)行有效監(jiān)管。