袁秀芝，唐 靜，蘇 瓊

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430077)

糖尿病是一類復(fù)雜代謝性疾病。我國是糖尿病大國，預(yù)計到2035年，中國的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到1.43億[1-2]。糖尿病血管病變是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致糖尿病病人死亡的主要原因之一。黃芪是常用中藥，研究表明黃芪總黃酮對改善糖尿病糖脂代謝有一定作用，本實驗通過在高糖環(huán)境中培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，比較了三種不同濃度的黃芪提取物對高糖損傷的HUVECs細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，并檢測ET-1、eNOS、p-eNOS水平以及mRNA和蛋白量的表達(dá)量，為黃芪的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的證據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

HUVECs(武漢普諾賽生物科技有限公司)；黃芪總黃酮提取物(自提)；葡萄糖(GLu)購自南京建成生物工程研究所，Trizol試劑購自Aidlab公司，DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司，P0013BRIPA裂解液購自碧天云生物技術(shù)公司，P0010BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧天云生物技術(shù)公司，兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司(批號：AB-P-R 001)，兔多抗ET1購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(批號：12191-1-AP)。

1.2 儀器

R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BuChi公司)；Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀(Thermo scientific)；IX51型OLYMPUS倒置顯微鏡；EDC-810型PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.3 MTT檢測黃芪提取物對HUVECs細(xì)胞活力的影響

將HUVECs細(xì)胞分為12組：①正常對照組(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)；②高糖損傷組(葡萄糖濃度為30 mmo1/L)(以下簡稱高糖組)；③高滲對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)(以下簡稱高滲組)；④黃芪總黃酮組高濃度(2 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮高)；⑤黃芪總黃酮組中濃度(1 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮中)；⑥黃芪總黃酮組低濃度(0.5 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮低)；⑦黃芪總多糖組高濃度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖高)；⑧黃芪總多糖組中濃度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖中)；⑨黃芪總多糖組低濃度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖低)；⑩黃芪總皂苷組高濃度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷高)；黃芪總皂苷組中濃度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷中)；黃芪總皂苷組低濃度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷低)。各組均在高糖處理前2 h分別加入藥物。取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，采用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至3×104/mL，接入96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，同時設(shè)空白組，37 ℃培養(yǎng)過夜(在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS)；按實驗分組處理每孔細(xì)胞，加入藥物后分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min；采用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD。

1.4 PCR檢測黃芪提取物對高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計相應(yīng)的引物(表1)，采用實時熒光定量PCR檢測，測定HUVECs細(xì)胞內(nèi)ET-1的表達(dá)。以空白組數(shù)據(jù)2-ΔΔCt作為一個基準(zhǔn)點，作為1，再將各組數(shù)據(jù)中各個點的數(shù)值和基準(zhǔn)點比較，得到數(shù)據(jù)[3](見圖4)。

表1 PCR引物序列

1.5 黃芪提取物對高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的HUVECs中總ET-1和p-eNOS蛋白表達(dá)的影響

倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞加入裂解液，充分裂解后，12 000 rpm離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?0%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，用1×TBS漂洗一次，加入含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h，分別加入一抗，4 ℃過夜，洗膜后分別加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃搖床孵育2 h，用TBST充分洗滌PVDF膜；加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)后置于曝光機(jī)上曝光，用BandScan分析膠片灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶灰度值比值作為最終結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測黃芪提取物對HUVECs細(xì)胞活力的影響

表2 黃芪提取物對HUVECs細(xì)胞活力的抑制率(%)

以實驗各組與空白對照組OD的比值作為細(xì)胞活力抑制率，通過對HUVECs細(xì)胞活力抑制率的考察發(fā)現(xiàn)，高糖組會顯著影響HUVECs細(xì)胞的活力，自給藥后12 h起，黃芪提取物各組就能對高糖引起的HUVECs細(xì)胞損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用(P<0.05))；隨著培養(yǎng)時間的延長，黃芪提取物各組對高糖損傷的保護(hù)作用不斷增強(qiáng)(P<0.05)，這說明不同濃度的黃芪提取物均能保護(hù)HUVECs細(xì)胞，并呈現(xiàn)出一定程度的濃度相關(guān)性，其中以高劑量黃芪提取物組對HUVECs細(xì)胞的保護(hù)作用最為明顯(P<0.05)。

2.2 PCR檢測黃芪提取物對高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表達(dá)

圖1 ET-1的mRNA的表達(dá)

圖2 eNOS的mRNA表達(dá)

由圖1可以看出，與正常相比，高糖組ET-1的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)過高、中、低濃度黃芪提取物干預(yù)后，ET-1的表達(dá)受到了一定程度的抑制；從上圖還可以看出，黃芪提取物對HUVECs高糖損傷保護(hù)作用呈一定的濃度相關(guān)性，且高濃度黃芪提取物(黃酮高、多糖高、皂苷高)組能明顯抑制ET-1的表達(dá)，說明高濃度黃芪提取物組對細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)。

由圖2可以看出，與正常組相比，高糖組eNOS的表達(dá)出現(xiàn)了明顯下降，經(jīng)過高、中、低濃度黃芪提取物干預(yù)后eNOS的表達(dá)量增加；高濃度提取物(黃酮高、多糖高、皂苷高)組與低濃度組相比，eNOS值增加最明顯，這也說明高濃度組對細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)。

2.3 Western blot法檢測黃芪提取物對高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的HUVECs中總ET-1和p-eNOS蛋白表達(dá)的影響

圖3 GAPDH蛋白表達(dá)

圖4 ET-1蛋白表達(dá)

圖5 eNOS蛋白表達(dá)

圖6 p-eNOS蛋白表達(dá)

表2 ET1/GAPDH、eNOS/GAPDH與p-eNOS/GAPDH灰度值比值

由表2可知，各組間 ET-l蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常對照組相比，高糖損傷組ET-1蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)；而與高糖損傷組比較，三種黃芪提取物各濃度組均可抑制高糖所致的ET-1蛋白表達(dá)升高，且呈濃度相關(guān)性(P<0.05)，以高劑量提取物組作用最為明顯(P<0.05)。

表2中，與正常組相比，高糖因素對eNOS蛋白的表達(dá)影響不明顯(P>0.05)；黃芪提取物干預(yù)后，e-NOS蛋白表達(dá)也不顯著(P>0.05)。結(jié)果提示，高糖、黃芪提取物對e-NOS蛋白表達(dá)基本無影響。

由表2可以看出，各組間 p-eNOS蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常對照組相比，高糖損傷組 p-e NOS蛋白表達(dá)較正常對照組明顯下降(P<0.05)，通過三種不同濃度的黃芪提取物干預(yù)后，各組 p-eNOS蛋白的表達(dá)量明顯增加，且在一定程度上呈現(xiàn)出濃度依賴的特點。這說明，黃芪提取物呈濃度依賴地促進(jìn)高糖HUVECs中的e NOS磷酸化激活。

3 討論

黃芪的降糖療效比較確切，對其降糖機(jī)制的研究能更好地指導(dǎo)臨床合理用藥。本研究通過HUVEC細(xì)胞建立高糖損傷模型，采用黃芪中三種主要有效成分進(jìn)行干預(yù)，從細(xì)胞學(xué)的角度，分析黃芪三種有效成分對HUVEC保護(hù)作用的機(jī)制。

近年來研究[6-7]表明，ET-1濃度與動脈粥樣硬化和血管重構(gòu)有關(guān)。ET-1是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的最有效的血管收縮因子，對血管具有強(qiáng)烈的收縮作用，ET-1分泌量增多會造成血管痙攣，引起血管平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血小板黏附、聚集，促進(jìn)血栓形成[8]。本研究證實，高糖組基因表達(dá)HUVEC中ET-1基因的表達(dá)水平明顯高于正常組，eNOS基因表達(dá)顯著低于正常組，這說明高糖會增加心血管疾病事件的發(fā)生率；黃芪提取物的干預(yù)改善了高糖HUVEC中ET-1、eNOS基因的表達(dá)。

黃芪提取物改善高糖引起的血管內(nèi)皮功能的機(jī)制較為復(fù)雜。p-eNOS作為血管中的一種保護(hù)蛋白，通過NO的產(chǎn)生減輕血流動力學(xué)壓力，從而保護(hù)動脈壁免受損傷。本研究發(fā)現(xiàn)高糖可加重血管內(nèi)皮的損傷，高糖會降低eNOS的活性，從而降低NO的生物利用度，所有這些過程都會對HUVEC產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致血管舒張功能下降和內(nèi)皮功能障礙；黃芪提取物可顯著增加p-eNOS的表達(dá)，保護(hù)了HUVEC，改善了血管內(nèi)皮功能，降低了血管疾病的發(fā)生率。

NO由內(nèi)皮NO合酶(eNOS)產(chǎn)生，其能自由地進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，是影響血管內(nèi)皮功能的重要舒張因子。ET-1除了對傳統(tǒng)的PI3K-Akt-eNOS、p38MAPK[9-11]通路產(chǎn)生影響外，還能激活RhoA，使NO介導(dǎo)的RhoA/Rock通路失活，且該通路會對血管和組織內(nèi)皮的通透性產(chǎn)生重要影響。

綜上所述，本研究從ET-1、eNOS、p-eNOS角度初步探明了黃芪提取物對高糖所致HUVECs的保護(hù)機(jī)制，但本研究的證據(jù)存在一定局限性，有待進(jìn)一步從信號通路方面對其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入挖掘。