李新蕊，司明東，謝振元，溫子帥，馬東來，鄭玉光

(河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的干燥根皮，地骨皮入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，春初或秋后采挖根部，洗凈，剝?nèi)「?，曬干。味甘，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)。具有涼血除蒸、清肺降火之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明地骨皮中含有多種化學(xué)成分，主要包括生物堿類、有機(jī)酸及其酯類、蒽醌類等，現(xiàn)代藥理研究表明地骨皮具有解熱鎮(zhèn)痛、降血糖、降血壓、降血脂、抗菌以及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]。

從地骨皮中分離得到的生物堿類化合物對(duì)糖尿病、高血壓等疾病有明顯的抑制作用[3]，其中地骨皮甲素具有抑制糖尿病相關(guān)的淀粉樣蛋白聚集作用[4]，地骨皮乙素可通過其與脂多糖結(jié)合抑制脂多糖誘導(dǎo)的感染性小鼠肝臟炎癥反應(yīng)[5]；甜菜堿具有降低TGF-β1和TNF-α水平的作用，從而在糖尿病腎病微血管炎癥過程中起到延緩或抑制作用[6]。

響應(yīng)面法(Response surface methodology)具有簡(jiǎn)便、預(yù)測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、制藥等多個(gè)領(lǐng)域，是一種以統(tǒng)計(jì)學(xué)原理為基礎(chǔ)，用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化的分析方法，通過建立體系的響應(yīng)值與多個(gè)因素間的函數(shù)關(guān)系，評(píng)價(jià)各因素間的交互作用，更好地確定實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用微波法提取地骨皮中總生物堿，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定地骨皮中總生物堿含量，通過Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝條件，為地骨皮中總生物堿資源綜合開發(fā)利用提供參考。

1 儀器、試劑與藥材

UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)，Biotage Initiator+微波合成儀(Biotage Sweden AB)，鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(LOT：Y31J9H67024)購(gòu)自上海源葉生物有限公司，冰乙酸、溴百里香酚藍(lán)、三氯甲烷均購(gòu)自天津市百世化工有限公司。

30批地骨皮藥材分別購(gòu)自河北安國(guó)、安徽亳州、成都荷花池藥材市場(chǎng)，具體產(chǎn)地見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取鹽酸小檗堿2.5 mg，用甲醇定容到25 mL的容量瓶中，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于分液漏斗中，加入pH=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL、0.3%溴百里香芬蘭溶液6 mL、氯仿20 mL，混勻，靜置10 min后，分出氯仿層，加少許無(wú)水硫酸鈉干燥，濾液定容于50 mL容量瓶中，于417 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，擬合得回歸方程Y=37.249X-0.241 1，相關(guān)系數(shù)r值為0.996 5。

表1 地骨皮產(chǎn)地信息

2.2 供試品的制備

取0.5 g地骨皮S1樣品加入12.5 mL的60%乙醇放于反應(yīng)釜中，溫度70 ℃，微波提取30 min，過濾，取3 mL濾液置于分液漏斗中，按“2.1”項(xiàng)下方法處理，在417 nm處測(cè)定吸光度。

2.3 方法學(xué)考察

在精密度試驗(yàn)中，精密量取同一濃度對(duì)照品溶液適量，于417 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.02%，表明儀器精密度良好；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，精密稱取S1號(hào)樣品0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別于室溫下放置10、20、30、40、50、60 min后于417 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD值為1.82%，結(jié)果表明供試品溶液60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好；在重復(fù)性試驗(yàn)中，精密稱取S1號(hào)樣品0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，于417 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD值為2.27%，說明該方法重復(fù)性良好；在加樣回收率試驗(yàn)中，精密稱取已知總生物堿含量的S1號(hào)樣品0.5 g，共6份，均加入適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于417 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD值為2.78%，說明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化地骨皮總生物堿的微波提取工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，選取液料比(A)、乙醇濃度(B)、微波溫度(C)、微波提取時(shí)間(D)為自變量，總生物堿提取率作為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken-設(shè)計(jì)方案，在4因素3水平的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化地骨皮中總生物堿的最佳提取工藝，因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 設(shè)計(jì)因素編碼與水平

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)并分析處理結(jié)果如表3所示。對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型，擬合回歸方程為Y= 3.41 + 0.76A+0.25B+0.050C+0.27D+0.19AC-0.46CD- 0.64A2- 0.15B2- 0.36C2- 0.26D2。

表4 回歸方程的方差分析

2.4.3 響應(yīng)面分析 利用 Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析，得出影響地骨皮中總生物堿提取率的各因素交互作用的相應(yīng)響應(yīng)面圖，各因素對(duì)地骨皮中總生物堿提取率的影響見圖1。從圖1三維立體圖中可以看出，a、b、c的曲面均陡峭，提示乙醇濃度與液料比之間、微波溫度與液料比之間、微波時(shí)間與液料比之間交互作用均達(dá)到顯著水平；d、e的曲面均不陡峭，提示微波溫度與乙醇濃度之間、微波時(shí)間與乙醇濃度之間交互作用均未達(dá)到顯著水平，但均存在極大值點(diǎn)[9]；圖1f曲面較陡峭，提示微波時(shí)間和微波溫度交互作用對(duì)地骨皮總生物堿提取率顯著，這與方差分析結(jié)果基本一致。

由Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析得出地骨皮總生物堿最大提取率為3.86%，最佳條件為液料比27.26∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度72.62 ℃、微波提取時(shí)間22.23 min。以實(shí)際操作的方便考慮，將其修正為液料比27∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度73℃、微波提取時(shí)間22 min。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化的最佳工藝條件，取地骨皮S1樣品0.5 g進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果，總生物堿的平均提取率為3.81%，RSD為1.9%，與預(yù)測(cè)值3.86%的相對(duì)誤差為1.30%，說明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖1 各因素交互作用對(duì)總生物堿提取率之間的響應(yīng)面

3 不同批次的地骨皮總生物堿含量

按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品待測(cè)溶液，每個(gè)樣品平行三次試驗(yàn)。結(jié)果見表6。

表6 30批次地骨皮中總生物堿的含量

4 討論

地骨皮中化學(xué)成分復(fù)雜，且有效成分提取分離難度大，生物堿類是其次生代謝產(chǎn)物中較大的一類，不同批次地骨皮總生物堿含量在14.68～39.20 mg/g之間，總生物堿的提取含量影響著地骨皮的質(zhì)量[10-11]。S17號(hào)河南產(chǎn)地骨皮總生物堿含量最高為39.20 mg/g，除甘肅外同一產(chǎn)地地骨皮總生物堿含量相差不大，安徽在25.87～32.71 mg/g之間、河南在26.18～39.20 mg/g之間、河北在24.52～30.97 mg/g之間，甘肅在14.68～35.50 mg/g之間。安徽、河南、河北所產(chǎn)地骨皮質(zhì)量穩(wěn)定，甘肅所產(chǎn)質(zhì)量差異較大，因在市場(chǎng)所購(gòu)藥材，生長(zhǎng)年限存放時(shí)間不能保持一致，可能會(huì)對(duì)含量有影響，本課題組后續(xù)將對(duì)其進(jìn)行研究。

筆者在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法成功優(yōu)化了地骨皮中總生物堿的提取工藝，最優(yōu)條件為液料比27∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度73 ℃、微波提取時(shí)間22 min，且優(yōu)化后的提取工藝合理可行，可為地骨皮中總生物堿的開發(fā)與利用提供參考。