李 鳴 詹 鵬，* 陳介南，* 王亞楠 周永財(cái)

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410004；2.國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南長(zhǎng)沙，410004；3.湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙，410004；4.湖南省木質(zhì)資源定向轉(zhuǎn)化國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙，410004）

大力發(fā)展可再生能源對(duì)于緩解化石能源緊張、改善生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。木質(zhì)纖維乙醇“不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地”，且可利用農(nóng)林業(yè)剩余物而擴(kuò)充其原料邊界，是世界可再生能源的重要發(fā)展方向之一。楊樹作為我國(guó)重要的人工速生林樹種之一[1]，是定向轉(zhuǎn)化生物乙醇的潛在重要原料，但由于楊木纖維三大組分結(jié)合非常緊密，需采用物理法、化學(xué)法、生物法等方法進(jìn)行預(yù)處理，釋放纖維素進(jìn)而進(jìn)行酶解及乙醇發(fā)酵。

選擇合適的預(yù)處理方法，不僅可以有效破壞木質(zhì)纖維各主要成分之間的結(jié)合，而且可以降解木質(zhì)素，提高纖維素的可接觸表面積，使纖維素更容易被纖維素酶酶解為還原糖，便于微生物發(fā)酵[2]。在眾多預(yù)處理方法中，采用稀磷酸預(yù)浸漬+蒸汽爆破的預(yù)處理方式可以有效提高還原糖含量和酶解效率，但同時(shí)也會(huì)促使楊木木質(zhì)纖維降解生成副產(chǎn)物，如糠醛、5-羥甲基糠醛、對(duì)苯二酚、間苯二酚等抑制劑，這些抑制劑將會(huì)對(duì)后續(xù)的酶解及發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生一定的抑制作用[3]，降低目標(biāo)產(chǎn)物的得率。

目前對(duì)抑制劑的研究大都集中在消除預(yù)處理過(guò)程中的抑制劑或是抑制劑對(duì)葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，對(duì)酶解過(guò)程的研究幾乎空白。本研究以楊木纖維為原料，研究了稀磷酸浸漬預(yù)處理（AT）加蒸汽爆破預(yù)處理（SE）技術(shù)產(chǎn)生的抑制劑對(duì)纖維素酶解糖化過(guò)程的影響[4]，探究單一抑制劑、單一種類抑制劑和復(fù)配抑制劑對(duì)纖維素酶酶解纖維素的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

楊木片，購(gòu)自湖南常德，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎得楊木屑（長(zhǎng)度0.2～0.8 cm）；磷酸、糠醛、5-羥甲基糠醛（5-HMF）、對(duì)苯二酚、間苯二酚均為分析純；微晶纖維素、羧甲基纖維素均為工業(yè)純；纖維素酶，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

QBS-80 蒸汽爆破機(jī)，鶴壁正道生物能源有限公司生產(chǎn)；GCMS-20100 Ultra 氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島律公司生產(chǎn)，安捷倫1260 高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)；UV-2450 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)；ZhWY-211C 恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器公司生產(chǎn)。

1.2 預(yù)處理

將自然風(fēng)干的楊木粉碎成楊木屑，并將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的稀磷酸按固液比1∶2.5 混勻，浸漬1 h。采用蒸汽爆破機(jī)，將預(yù)浸漬的楊木屑在爆破壓力2 MPa、保壓時(shí)間180 s的條件下進(jìn)行蒸汽爆破，收集爆破物，測(cè)定爆破液中糠醛、5-羥甲基糠醛、對(duì)苯二酚、間苯二酚及葡萄糖的含量，取樣測(cè)定含水率后，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶解優(yōu)化

1.3.1 酶解溫度對(duì)還原糖濃度的影響

在酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、pH 值5.0、酶解48 h 條件下，對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，計(jì)算酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60、65℃時(shí)的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解溫度。

1.3.2 酶液載入量對(duì)還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、固液比1∶10、pH 值5.0、酶解48 h條件下，對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，計(jì)算酶液載入量分別為15、20、25、30、35、40、45 U/mL 時(shí)的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶液載入量。

1.3.3 酶解固液比對(duì)還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、pH值5.0、酶解48 h 條件下，對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，計(jì)算酶解固液比分別為1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13 時(shí)的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解固液比。

1.3.4 酶解pH值對(duì)還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、酶解48 h 條件下，對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，計(jì)算酶解pH 值分別為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6 時(shí)的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解pH值。

1.3.5 酶解時(shí)間對(duì)還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、pH 值5.0 條件下，對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，計(jì)算酶解時(shí)間分別為12、24、36、48、60、72、84 h時(shí)的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解時(shí)間。

1.3.6 正交實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)酶解效果影響較大的4 個(gè)因素：酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝條件。

1.4 抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件，在此條件下對(duì)微晶纖維素、羧甲基纖維素進(jìn)行酶解，再分別加入一定種類和質(zhì)量的抑制劑（糠醛、5-羥甲基糠醛、對(duì)苯二酚和間苯二酚中的一種或多種），測(cè)定酶解液中葡萄糖及糠醛、5-羥甲基糠醛、對(duì)苯二酚、間苯二酚含量，明確抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響。

1.5 分析方法

采用GC/MS 分析爆破液成分[5]；采用DNS 法測(cè)定爆破液還原糖濃度[6]；采用高效液相色譜測(cè)定糠醛、5-羥甲基糠醛[7]、對(duì)苯二酚、間苯二酚的含量[8]；采用高效液相色譜儀測(cè)定纖維素酶解后的還原糖濃度[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理

有研究表明[10]，相較于純水+蒸汽爆破（水爆），采用稀磷酸浸漬+蒸汽爆破（酸爆）的預(yù)處理方式可以有效疏松木質(zhì)纖維。圖1所示為兩種預(yù)處理方式的對(duì)比。從圖1 可以看出，酸爆預(yù)處理還原糖濃度為23.61 g/L，比水爆預(yù)處理還原糖濃度13.07 g/L 高出10.54 g/L。與水爆預(yù)處理相比，酸爆預(yù)處理明顯提高了還原糖和抑制劑的含量，這些抑制劑可以通過(guò)抑制纖維素酶的酶活，降低纖維素的酶解效果，減少酶解液中還原糖含量，最終影響乙醇的發(fā)酵，為后續(xù)的酶解發(fā)酵過(guò)程提供便利。酸爆后各抑制劑濃度分別為：糠醛0.031 g/L、5-羥甲基糠醛0.029 g/L、對(duì)苯二酚1.51 g/L、間苯二酚1.242 g/L。

圖1 兩種預(yù)處理方式的對(duì)比

2.2 酶解優(yōu)化

2.2.1 單因素條件優(yōu)化

圖2～圖6所示分別為酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值、酶解時(shí)間對(duì)還原糖濃度的影響。

圖2 酶解溫度對(duì)纖維素降解率的影響

圖3 酶液載入量對(duì)纖維素降解率的影響

從圖2 可見，微晶纖維素的最優(yōu)酶解溫度為50℃，羧甲基纖維素的最優(yōu)酶解溫度為55℃；原因可能是纖維素酶主要組成是蛋白質(zhì)，酶解溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)降低纖維素酶的活性，從而使酶解效果下降[11]。從圖3 可見，最優(yōu)酶液載入量為35 U/mL，原因可能是酶對(duì)底物具有競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用，適當(dāng)增加纖維素酶用量能夠有效促進(jìn)纖維素酶與纖維素的結(jié)合，從而提高還原糖濃度[12]，但一定量纖維素與酶分子相結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)有限，如果結(jié)合點(diǎn)已經(jīng)被纖維素酶占據(jù)，繼續(xù)提高酶用量，也不能達(dá)到更高的酶解效果[13]；纖維素酶的成本較高，從生產(chǎn)成本考慮，要求盡量減少纖維素酶的載入量[14]，因此，初步確定最佳纖維素酶載入量為35 U/mL。

圖4 酶解固液比對(duì)纖維素降解率的影響

圖5 酶解pH值對(duì)纖維素降解率的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)纖維素降解率的影響

從圖4 可見，酶解液中還原糖濃度隨著酶解固液比的增大而減小，從而使酶解液中還原糖濃度下降[15]；綜合考慮，初步確定最佳酶解體系固液比為1∶10。從圖5 可見，當(dāng)pH 值=5.0 時(shí)，兩種纖維素酶液中還原糖濃度均達(dá)到最大，分別為30.32 g/L 和31.79 g/L，原因可能是過(guò)高或過(guò)低的pH 值都會(huì)影響纖維素酶的酶活力[16]，進(jìn)而影響酶解效果，由此確定pH 值為5.0 時(shí)，纖維素酶的活性最大。從圖6 可見，當(dāng)酶解反應(yīng)到48 h后，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解反應(yīng)的時(shí)間酶解效率提高緩慢[17]，酶解反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，生物乙醇的生產(chǎn)周期也就越長(zhǎng)，因此在保證能得到較好的酶解效果時(shí)，應(yīng)該盡量縮短酶解反應(yīng)時(shí)間，以此縮短生物乙醇的生產(chǎn)周期[18]。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值4 個(gè)因素作為研究對(duì)象，酶解時(shí)間選取為48 h，設(shè)計(jì)L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)楊木纖維酶解的工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化[19]。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1 所示；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 和表3所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

從表2 可以看出，影響微晶纖維素酶解的主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋久敢狠d入量＞酶解固液比＞酶解pH 值，最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH值4.8。

從表3 可以看出，影響羧甲基纖維素酶解的主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋久附夤桃罕龋久敢狠d入量＞酶解pH 值，最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值4.8。已有研究表明[20]，楊木的最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值5.0，這與纖維素的最優(yōu)酶解條件略有不同。

2.3 抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響

2.3.1 單一抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響

圖7 單一抑制劑對(duì)纖維素降解率的影響

表2 微晶纖維素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 羧甲基纖維素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7 所示為單一抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響。由圖7可見，在最優(yōu)酶解條件下對(duì)微晶纖維素和羧甲基纖維素進(jìn)行酶解時(shí)，加入預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的抑制劑，對(duì)纖維素降解產(chǎn)生最大影響的是間苯二酚，其次依次為對(duì)苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛，原因可能是酸浸加蒸汽爆破產(chǎn)生的單一酚類抑制劑含量遠(yuǎn)高于單一醛類抑制劑，所以單一的酚類抑制劑對(duì)酶解的影響高于單一醛類抑制劑[21]。由此可見，在楊木預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的抑制劑中，酚類抑制劑對(duì)酶解產(chǎn)生的影響要高于醛類抑制劑[22]。

2.3.2 酚類、醛類抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響

在酸爆預(yù)處理的過(guò)程中，不止產(chǎn)生單一的抑制劑，因此需要單獨(dú)研究酚類抑制劑和醛類抑制劑對(duì)纖維素降解的影響。圖8 和圖9 分別為酚類抑制劑和醛類抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響。

從圖8 和圖9 可見，在最優(yōu)酶解條件下，添加單一酚類抑制劑和單一醛類抑制劑后，還原糖濃度有明顯降低，且酚類抑制劑對(duì)降解率的影響較大，而將兩種酚類抑制劑和兩種醛類抑制劑復(fù)配后，纖維素的降解率下降并不明顯，由此可見抑制劑復(fù)配后對(duì)纖維素酶的酶活產(chǎn)生的影響并不是很大[23]。

圖8 酚類抑制劑對(duì)纖維素降解率的影響

圖9 醛類抑制劑對(duì)纖維素降解率的影響

圖10 4種抑制劑對(duì)纖維素降解率的影響

2.3.3 4種抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響

圖10所示為4種抑制劑對(duì)還原糖濃度的影響。從圖10 可見，在最優(yōu)酶解條件下，對(duì)苯二酚、間苯二酚、糠醛和5-羥甲基糠醛4 種抑制劑復(fù)配作用比單一抑制劑或單一種類抑制劑復(fù)配對(duì)纖維素降解影響更大，并且酚類抑制劑復(fù)配的影響作用要高于醛類抑制劑復(fù)配，而在4種抑制劑復(fù)配后，對(duì)纖維素酶解的抑制作用并不是某一單一抑制劑單獨(dú)作用的結(jié)果，且抑制結(jié)果也并非各單一抑制劑結(jié)果的簡(jiǎn)單疊加，它們之間可能還存在一定的協(xié)同作用[24]。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)楊木進(jìn)行稀酸浸漬+蒸汽爆破（酸爆）預(yù)處理，探究了爆破過(guò)程產(chǎn)生的4種抑制劑對(duì)纖維素酶酶解纖維素的影響。

3.1 酸爆預(yù)處理的楊木爆破液中，還原糖濃度與抑制劑含量都要高于采用水爆預(yù)處理的，其中，酸爆預(yù)處理的還原糖質(zhì)量濃度最高可達(dá)23.61 g/L，比水爆預(yù)處理還原糖含量13.07 g/L高出10.54 g/L。

3.2 纖維素的最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值4.8；在最優(yōu)酶解條件與單一種類的抑制劑存在下，對(duì)苯二酚、間苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛對(duì)還原糖濃度的影響逐漸降低；多種抑制劑的復(fù)配對(duì)纖維素降解的影響高于單一種類抑制劑對(duì)纖維素降解的影響。