李 青 邱宏毅 王 博 顏秀娟 程 莉 王倩倩 陳勝良

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：臨床流行病學(xué)證據(jù)顯示應(yīng)激是消化不良癥狀的重要致病因素。十二指腸炎癥是消化不良癥狀產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一，而巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。目的：確定合并精神心理應(yīng)激因素的功能性消化不良(FD)患者的十二指腸炎癥狀態(tài)；通過(guò)避水應(yīng)激(WAS)動(dòng)物模型研究確認(rèn)巨噬細(xì)胞是否參與介導(dǎo)了應(yīng)激相關(guān)十二指腸炎癥的發(fā)生。方法：觀察并比較合并精神心理因素的FD患者和無(wú)癥狀健康體檢者的十二指腸炎癥特征。觀察WAS小鼠模型(每日應(yīng)激1 h，持續(xù)10 d)十二指腸炎癥的動(dòng)態(tài)變化，以及預(yù)先以氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞對(duì)十二指腸炎癥的影響。采用HE染色和免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估炎癥嚴(yán)重程度，免疫組化染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，real-time PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)。結(jié)果：與健康對(duì)照者相比，合并精神心理因素的FD患者十二指腸炎癥更為嚴(yán)重[免疫細(xì)胞計(jì)數(shù): (138.91±7.13)/HPF對(duì)(81.44±23.60)/HPF, P<0.000 1]，促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17A表達(dá)升高，抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β表達(dá)降低(P均<0.05)。WAS小鼠模型的十二指腸炎癥于應(yīng)激第5天達(dá)到峰值，之后逐漸緩解；巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況與炎癥變化趨勢(shì)一致。預(yù)先清除巨噬細(xì)胞的WAS小鼠模型，十二指腸炎癥較單純WAS小鼠顯著減輕[免疫細(xì)胞計(jì)數(shù): (75.10±4.08)/HPF對(duì)(202.43±5.18)/HPF, P<0.001]，促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8表達(dá)降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)升高(P均<0.05)。結(jié)論：應(yīng)激相關(guān)消化不良癥狀可能是通過(guò)觸發(fā)十二指腸炎癥所引起，在應(yīng)激引發(fā)十二指腸炎癥的機(jī)制中，巨噬細(xì)胞可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

功能性胃腸病(functional gastrointestinal dis-orders, FGIDs)占消化內(nèi)科門診量的40%～70%，其中半數(shù)以上為胃-十二指腸功能紊亂性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，是提升療效的“瓶頸”。既往研究已確認(rèn)十二指腸炎癥(duodenal inflammation)是十二指腸-Oddi括約肌紊亂引發(fā)和加重胃-十二指腸承納關(guān)系紊亂、膽汁反流、小腸消化吸收不良、小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)等一系列胃腸道功能性疾病的關(guān)鍵機(jī)制，可觸發(fā)消化不良、胃食管反流等癥狀[1-3]。

臨床流行病學(xué)證據(jù)顯示精神心理應(yīng)激是FGIDs的重要致病因素[3-4]，但應(yīng)激是否與十二指腸炎癥有關(guān)，以及應(yīng)激引發(fā)十二指腸炎癥的機(jī)制目前尚不明確。既往關(guān)于炎癥反應(yīng)過(guò)程的研究已確認(rèn)：巨噬細(xì)胞焦亡(macrophage pyroptosis)現(xiàn)象是炎癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的主導(dǎo)機(jī)制[5-6]。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在應(yīng)激引發(fā)十二指腸炎癥的機(jī)制中是否發(fā)揮主導(dǎo)作用，以及應(yīng)激激活巨噬細(xì)胞的神經(jīng)信號(hào)通路均有待闡明。本研究以合并精神心理因素的功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)患者和避水應(yīng)激(water avoidance stress, WAS)小鼠模型為研究對(duì)象，旨在確定合并精神心理應(yīng)激因素的FD患者的十二指腸炎癥狀態(tài)，以及巨噬細(xì)胞是否參與介導(dǎo)了應(yīng)激相關(guān)十二指腸炎癥的發(fā)生。

材料與方法

一、臨床資料

研究對(duì)象源自因消化不良癥狀于2019年1月1日—2020年1月1 日在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心接受上消化道內(nèi)鏡檢查者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合羅馬Ⅳ FD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)詢問(wèn)存在焦慮(如失眠、經(jīng)常為一件事情感到憂愁)和(或)抑郁(如早醒、開(kāi)心不起來(lái))表現(xiàn)，并通過(guò)相應(yīng)精神心理量表確認(rèn)。最終共23例合并精神心理因素的FD患者納入研究；同期17名接受上消化道內(nèi)鏡檢查的無(wú)癥狀健康體檢者作為對(duì)照組。臨床研究部分經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

入組受試者評(píng)估內(nèi)容包括人口學(xué)特征、利茲消化不良問(wèn)卷(Leeds Dyspepsia Questionnaire, LDQ)、廣泛性焦慮障礙量表GAD-7(Generalized Anxiety Disorder-7)和抑郁篩查量表PHQ-9(Patient Health Questionnaire-9)。內(nèi)鏡檢查時(shí)取十二指腸黏膜活檢2塊，1塊立即置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于real-time PCR檢測(cè)；另1塊于4%多聚甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)檢查。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模

健康雄性C57BL/6J小鼠90只，6～8周齡，體質(zhì)量18～25 g，由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。參照文獻(xiàn)所述方法建立WAS小鼠模型[7]，每日應(yīng)激1 h，持續(xù)10 d。模型小鼠每日稱重，并于1 h應(yīng)激過(guò)程中計(jì)數(shù)排便數(shù)目；另取10只小鼠不予應(yīng)激，作為對(duì)照組。分別于應(yīng)激第0(無(wú)應(yīng)激)、1、3、5、8、10天各處死10只小鼠，獲取十二指腸標(biāo)本。其余20只小鼠進(jìn)行巨噬細(xì)胞清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodronate liposomes)預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。20只小鼠隨機(jī)分為四組：假應(yīng)激(sham stress)+PBS脂質(zhì)體組(SP組)、假應(yīng)激+氯膦酸二鈉脂質(zhì)體組(SCl組)、WAS+PBS脂質(zhì)體組(WP組)和WAS+氯膦酸二鈉脂質(zhì)體組(WCl組)，每組5只。預(yù)處理步驟為在應(yīng)激前3 d予小鼠腹腔注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(100 μL/10 g)；為防止骨中的單核巨噬細(xì)胞前體重新動(dòng)員、分化為成熟巨噬細(xì)胞，于應(yīng)激第3天重復(fù)注射一次，以保證巨噬細(xì)胞在整個(gè)應(yīng)激過(guò)程中均處于清除狀態(tài)。相應(yīng)對(duì)照組于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射PBS脂質(zhì)體。氯磷酸二鈉脂質(zhì)體和對(duì)照PBS脂質(zhì)體訂購(gòu)自LIPOSOMA BV(https://www.liposoma-technology. com/)。

三、十二指腸炎癥病理學(xué)和分子生物學(xué)研究

1. HE染色和免疫細(xì)胞定量計(jì)數(shù)：十二指腸標(biāo)本4%多聚甲醛溶液固定，脫水、透明、包埋、切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。每張切片選取5個(gè)完全不重疊的高倍視野區(qū)域，計(jì)數(shù)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等)，結(jié)果取均值。

2. 巨噬細(xì)胞免疫組化染色：取十二指腸石蠟切片行巨噬細(xì)胞免疫組化染色，一抗為小鼠抗CD68單克隆抗體(1∶500; Abcam plc.)，過(guò)夜后加入兔抗小鼠IgG(1∶1 000; Abcam plc.)。免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為黃褐色，每張切片選取5個(gè)完全不重疊的高倍視野區(qū)域，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果取均值。

3. Real-time PCR檢測(cè)十二指腸組織炎癥因子表達(dá)：使用TRI試劑(Sigma-Aldrich)提取十二指腸組織總RNA，以PrimeScript RT Reagent Kit(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板，使用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)，在StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)中行PCR擴(kuò)增。人十二指腸組織以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用-ΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量；小鼠十二指腸組織以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

23例FD患者中男性9例，女性14例；17名健康體檢者中男性11名，女性6名。FD組體質(zhì)指數(shù)(BMI)低于健康對(duì)照組，抑郁篩查量表PHQ-9評(píng)分高于健康對(duì)照組，兩組間性別、年齡、焦慮情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 FD組與健康對(duì)照組一般資料比較

二、FD患者存在明顯的十二指腸炎癥

與健康對(duì)照組相比，F(xiàn)D組十二指腸組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1；圖1A)；促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17A mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β mRNA和趨化因子CCL22 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,P<0.05,P<0.001,P<0.01,P<0.01,P<0.01；圖1B)。上述結(jié)果表明，合并精神心理因素的FD患者存在明顯的十二指腸炎癥。

與健康對(duì)照(HC)組比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

三、WAS引發(fā)小鼠十二指腸炎癥

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，WAS小鼠模型體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢(P<0.05)；在每日1 h的應(yīng)激過(guò)程中，模型小鼠排便數(shù)目明顯增加并于第5天達(dá)到峰值(P<0.000 1；圖2A)。應(yīng)激第0(無(wú)應(yīng)激)、1、3、5、8、10天獲取的十二指腸標(biāo)本中，促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量從第0天至第5天逐漸升高，之后逐漸降低；在整個(gè)應(yīng)激過(guò)程中，抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量持續(xù)升高，于第10天達(dá)到峰值；趨化因子CCL5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在應(yīng)激第0天至第5天保持相對(duì)穩(wěn)定，之后逐漸降低(圖2B)。

兩組間比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

十二指腸組織HE染色和免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，WAS小鼠模型的十二指腸炎癥從應(yīng)激第0天至第5天逐漸加重(P<0.000 1)，之后逐漸緩解。此外，HE染色顯示W(wǎng)AS引起的十二指腸炎癥不只局限于黏膜層，黏膜下層和肌層也同時(shí)受累(圖3)。

與0 d比較，**P<0.01, ****P<0.000 1

四、WAS誘導(dǎo)十二指腸巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

巨噬細(xì)胞免疫組化染色顯示，與十二指腸炎癥變化趨勢(shì)一致，WAS小鼠模型應(yīng)激過(guò)程中的十二指腸巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)也呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的動(dòng)態(tài)變化，于應(yīng)激第5天達(dá)到峰值(圖4)。巨噬細(xì)胞主要浸潤(rùn)于十二指腸黏膜層，黏膜下層十二指腸腺周圍也有少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層則幾乎無(wú)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。由此推測(cè)，巨噬細(xì)胞可能在WAS引發(fā)的十二指腸炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

與0 d比較，*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1

五、氯膦酸二鈉脂質(zhì)體能有效緩解WAS引起的十二指腸炎癥

由于WAS小鼠模型十二指腸浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)目于應(yīng)激第5天達(dá)到峰值，且此時(shí)間點(diǎn)十二指腸炎癥亦最為嚴(yán)重，因此選擇5 d作為應(yīng)激時(shí)長(zhǎng)，使用巨噬細(xì)胞清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體耗竭小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體可有效清除浸潤(rùn)于十二指腸的巨噬細(xì)胞，SCl組和WCl組十二指腸區(qū)域幾乎沒(méi)有CD68陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5A)。同時(shí)，HE染色和免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明氯膦酸二鈉脂質(zhì)體能有效緩解WAS引起的十二指腸炎癥(P<0.001；圖5B)。WCl組小鼠排便數(shù)目亦較WP組明顯減少(P<0.05；圖5C)，從另一個(gè)角度反映了十二指腸炎癥程度的減輕。

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果一致，WCl組小鼠十二指腸組織促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA和趨化因子CCL5 mRNA相對(duì)表達(dá)量較WP組明顯降低(P<0.001,P<0.000 1,P<0.05,P<0.05)，抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。

兩組間比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

討 論

FD被認(rèn)為是在多種因素的作用下，由若干調(diào)控機(jī)制紊亂參與形成的胃-十二指腸功能障礙性疾病。目前較為清楚的發(fā)病機(jī)制包括胃-十二指腸運(yùn)動(dòng)紊亂、區(qū)域內(nèi)臟高敏感性、黏膜低度炎癥等。精神心理應(yīng)激、腦-腸互動(dòng)均已被證實(shí)與FD的病理生理學(xué)過(guò)程密切相關(guān)[8]。在生活節(jié)奏日益加快的現(xiàn)代社會(huì)，精神心理應(yīng)激已成為FD發(fā)病的主要原因之一。研究證實(shí)FD患者的十二指腸區(qū)域存在黏膜屏障功能受損、免疫激活和黏膜低度炎癥[9-13]。本研究探討了精神心理應(yīng)激因素在FD十二指腸炎癥中的作用及其可能的發(fā)生機(jī)制。研究結(jié)果顯示，合并精神心理因素的FD患者存在明顯的十二指腸炎癥，提示FD癥狀確與十二指腸炎癥有關(guān)，而精神心理應(yīng)激可能是十二指腸炎癥的重要誘發(fā)因素。進(jìn)一步的WAS小鼠模型研究結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)，WAS確實(shí)可引發(fā)明顯的十二指腸炎癥。

慢性應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)過(guò)度激活，導(dǎo)致血液中的糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺如腎上腺素、去甲腎上腺素水平升高。這些激素可能與胃腸道黏膜免疫炎癥細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，觸發(fā)炎癥細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而引發(fā)十二指腸炎癥。Vanheel等[11]應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)FD患者的十二指腸活檢標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒程度顯著高于健康對(duì)照者。另有研究證實(shí)，在FGIDs、食物過(guò)敏等情況下，肥大細(xì)胞激活可導(dǎo)致上皮和神經(jīng)肌肉功能障礙，引發(fā)內(nèi)臟高敏感，改變胃腸運(yùn)動(dòng)功能[12]。胃腸道是人體中最大的巨噬細(xì)胞池，巨噬細(xì)胞在腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持中起至關(guān)重要的作用[14]。作為固有免疫的重要組成部分，巨噬細(xì)胞是否參與了應(yīng)激相關(guān)十二指腸炎癥的發(fā)生機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

本研究對(duì)WAS小鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn)，WAS引起的十二指腸炎癥呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的動(dòng)態(tài)變化，應(yīng)激第0天至第5天炎癥逐漸加重，于第5天達(dá)到峰值后逐漸緩解，十二指腸區(qū)域浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化與炎癥變化情況相一致。作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡形式，細(xì)胞焦亡(又稱炎性死亡)在巨噬細(xì)胞促炎機(jī)制中的重要作用近年來(lái)備受關(guān)注[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用巨噬細(xì)胞清除劑氯膦酸二鈉脂質(zhì)體預(yù)先清除巨噬細(xì)胞能有效緩解WAS小鼠模型的十二指腸炎癥，表明巨噬細(xì)胞參與了應(yīng)激引發(fā)十二指腸炎癥的過(guò)程，而巨噬細(xì)胞焦亡現(xiàn)象可能是此過(guò)程的主導(dǎo)機(jī)制。Wehner等[15]的研究結(jié)果亦證實(shí)了巨噬細(xì)胞在腸道炎癥反應(yīng)中的作用，利用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞后，小腸切除術(shù)后大鼠的腸道炎癥明顯減輕。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激相關(guān)消化不良癥狀可能是通過(guò)觸發(fā)十二指腸炎癥所引起，在應(yīng)激引發(fā)十二指腸炎癥的機(jī)制中，巨噬細(xì)胞可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究是對(duì)巨噬細(xì)胞參與介導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)十二指腸炎癥的初步探討，未能進(jìn)一步闡明應(yīng)激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活介導(dǎo)炎癥發(fā)生、發(fā)展的分子信號(hào)通路，這是本研究理論貢獻(xiàn)中最突出的局限性。探索精神心理應(yīng)激因素引發(fā)巨噬細(xì)胞功能改變甚至巨噬細(xì)胞焦亡的分子信號(hào)通路，進(jìn)而找尋相關(guān)機(jī)制中有可干預(yù)意義的靶點(diǎn)，將是后續(xù)深入研究的方向。