熱衣汗·玉素甫 賈萬忠 閆鴻斌 吳耀東 吳燕濤 高佳敏李蓮瑞 石長青*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730000）

細粒棘球蚴?。‥chinococcosis）又稱包蟲病，是由細粒棘球絳蟲（Echinococcus granuloses）的中絳期幼蟲—細粒棘球蚴，寄生在人和動物的肝、肺和其他器官所導致的一種人畜共患寄生蟲病。主要引起寄生部位機械性壓迫、毒素作用和過敏反應等。該病呈世界性分布，主要在以畜牧業(yè)發(fā)展為主國家和地區(qū)流行，全球至少有100個國家存在包蟲病疫情，被OIE列為法定報告動物疾病，在我國被列為人畜共患二類動物疫病[1]。我國是包蟲病的高發(fā)國家之一，嚴重流行地區(qū)包括新疆、青海、甘肅、寧夏、內蒙古、西藏和四川等7個省和自治區(qū)，占全國面積的44%[2]。

該調查在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁地區(qū)的牛羊屠宰場采集肝肺細粒棘球蚴包囊組織，對其線粒體細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ基因（cox1）和線粒體NADH脫氫酶Ⅰ基因（nad1）的核苷酸序列進行分析，以期闡明北疆三個地區(qū)細粒棘球蚴病的流行情況和種群的遺傳與變異特征。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年4月至2019年9月，在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁三個地區(qū)牛羊定點屠宰場，對牛羊肝臟和肺臟進行細粒棘球蚴包囊采集。將采集的包囊囊液、生發(fā)層、原頭節(jié)分別裝于離心管，保存于-80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑

基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），Prime STAR HS（premix）（TAKARA，日本），Gel Red核酸染料（BIOTIUM，美國），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取

用基因組提取試劑盒按照產(chǎn)品使用說明書對處理后的包囊樣本生發(fā)層進行基因組DNA提取，提取的DNA于-20℃保存，備用。

1.3.2cox1和nad1基因PCR擴增與序列測定

以基因組為模板，用于擴增線粒體cox1和nad1基因部分序列的保守引物序列為Ohiolei等[3]實驗中使用的兩對引物。用于擴增cox1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物：5′-AAGCATGATGCAAAAGGCAAATAAACC-3′。用于擴增nad1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物5′-ATTCACAATTTACTATATCAAAGTAACC-3′。反應體系為 Prime STAR HS（premix）12.5 μl，上、下游引物各 1 μl，模板 1 μl，用去離子水補齊為 25 μl，混勻并短暫離心。PCR程序為：95℃預變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃再延伸10 min。同時，以ddH2O代替模板DNA作為空白對照。反應結束后，取5 μl PCR擴增產(chǎn)物與1 μl的點樣緩沖液混合，在1.2%瓊脂糖凝膠中，以1×TAE緩沖液電泳。電泳結束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察目的基因條帶，記錄陽性鑒定結果并拍照保存，將陽性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從成功測序的樣品選取cox1和nad1基因的1 649 bp和894 bp的核苷酸序列，通過BLAST比對判斷基因型，再使用UGENE與GenBank數(shù)據(jù)庫中的細粒棘球絳蟲G1、G3、G4、G5、G6、G7、G8基因型及多房棘球絳蟲（E.multilocularis）、少節(jié)棘球絳蟲（E.oligarthra）、石渠棘球絳蟲（E.shiquicus）、伏氏棘球絳蟲（E.vogeli）、獅棘球絳蟲（E.felidis）、泡狀帶絳蟲（Taenia.hydatigena）的參考序列進行比對。利用Dna SP分別對cox1和nad1基因序列分析單倍型，再利用MEGA5 對cox1和nad1的所有單倍型序列分別構建系統(tǒng)進化樹。利用Popart對cox1和nad1基因的所有單倍型分別構建單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結果

2.1 不同地區(qū)細粒棘球蚴感染情況

通過現(xiàn)場采集樣本，從昌吉、阿勒泰、伊犁三個地區(qū)210頭牛和2 294只綿羊分別采集24、8、24份臟器的40、13、25個疑似包囊樣本；確診宿主40例，確診包囊樣本共有62個，平均感染率為1.60%；其余包囊已鈣化，其中牛源鈣化囊占60%（3/5）、綿羊源鈣化囊占25.49%（13/51）；1頭牛和13只綿羊包囊樣本中可以分離出原頭節(jié)，為可育囊。昌吉的細粒棘感染率最高，感染率為3.85%（24/624）；其次是伊犁，感染率為0.87%（10/1 144）；阿勒泰的感染率最低，感染率為0.82%（6/736）（表1）。

表1 不同地區(qū)牛羊細粒棘球蚴感染情況

2.2 細粒棘球蚴基因型的確定

PCR產(chǎn)物電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察，共36只綿羊和4頭牛的樣本可觀察到目的條帶，其中源自37個宿主的57個包囊樣本呈現(xiàn)cox1基因擴增條帶陽性（1 800 bp處）；源自39個宿主的59個包囊樣本呈現(xiàn)nad1基因擴增條帶陽性（1 400 bp處）。經(jīng)過BLAST比對，cox1和nad1基因測序結果均為G1基因型。

2.3 細粒棘球蚴單倍型特征

將PCR擴增成功的57條cox1基因序列和59條nad1基因序列進行單倍型分析。利用Dna SP分析，本試驗中57個包囊樣本cox1基因序列歸為25個單倍型，將它們命名為Hap1至Hap25，并將它們連同其他基因型和其他蟲種一起構建系統(tǒng)進化樹（圖1）。阿勒泰地區(qū)羊肝臟（ALTY26）樣本的6個包囊樣本、昌吉地區(qū)羊肺臟（CJY34）樣本的2個包囊樣本勻歸為Hap1；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY16）樣本的10個包囊樣本歸屬4個不同的單倍型，它們分別是 Hap4（6/10）、Hap5（1/10）、Hap6（2/10）、Hap12（1/10）；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY11）樣本的4個包囊樣本都屬于單倍型Hap10；從昌吉地區(qū)羊肝、肺臟（CJY8）樣本分別采集的2個包囊樣本都歸屬于單倍型Hap21；從伊犁地區(qū)羊肝、肺臟（YNY39）樣本分別采集的2個包囊樣本分別歸為單倍型Hap13和Hap25（表 2）。

本試驗中59個包囊樣本nad1基因共有8個單倍型，命名為Hap1至Hap8，并將它們連同其他基因型和其他蟲種一起構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。阿勒泰地區(qū)羊肝臟（ALTY26）樣本的6個包囊、昌吉地區(qū)羊肺臟（CJY34）樣本的4個包囊、昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY11）樣本的3個包囊、昌吉地區(qū)羊肝、肺臟（CJY8）樣本的分別2個包囊、伊犁地區(qū)羊肝、肺臟（YNY39）樣本的分別2個包囊都歸類為單倍型Hap1；昌吉地區(qū)羊肝臟（CJY16）樣本的9個包囊分別歸屬于單倍型 Hap1（2/9）、Hap3（5/9）、Hap4（2/9）（表2）

圖1 cox1基因單倍型進化樹

圖2 nad1基因單倍型進化樹

cox1基因單倍型以Hap1為主，占26.32%（15/57），其中Hap1單倍型在阿勒泰包囊樣本中占70%（7/10），在昌吉包囊樣本中占18.91%（7/37）、在伊犁包囊樣本中占10%（1/10）；Hap2、Hap3、Hap7只發(fā)現(xiàn)于阿勒泰包囊樣本中；Hap13、Hap18、Hap23-25只發(fā)現(xiàn)于伊犁包囊樣本中；其余單倍型只發(fā)現(xiàn)于昌吉包囊樣本中（表2）。nad1基因單倍型以Hap1為主，占77.97%（46/59），其中阿勒泰包囊樣本占90%（9/10）、昌吉包囊樣本占68.42%（26/38）、伊犁包囊樣本占100%（11/11）；Hap3-8單倍型只發(fā)現(xiàn)于昌吉包囊樣本中（表2）。

表2 cox1和nad1基因序列單倍型歸屬及樣本分布

2.4 cox1和nad1基因單倍型網(wǎng)絡圖特征

根據(jù)cox1基因單倍型網(wǎng)絡圖（圖3-a）所示：Hap1是網(wǎng)絡圖中心，其他單倍型由Hap1連接；在網(wǎng)絡圖中，Hap1是最大單倍型群體，Hap12、Hap18、Hap24與Hap1遺傳距離較遠，并有相似遺傳距離，表明它們遺傳相關性很弱；與Hap12遺傳距離最近的是Hap5，因此 Hap12可能是 Hap5的分支；Hap18、Hap17與Hap23有一個突變位點位置相同，但Hap23的突變方式不同；Hap13與Hap10、Hap14有一個相同突變位點，同時Hap13與Hap9有一個相同突變位點；Hap14與Hap10遺傳距離最近，因此Hap14可能是Hap10的分支；Hap1與Hap3、Hap14、Hap17、Hap21、Hap24之間有兩個突變位點，Hap1與Hap13、Hap15之間有三個突變位點。

根據(jù)nad1基因單倍型網(wǎng)絡圖（圖3-b）所示：Hap1是網(wǎng)絡圖中心，其他單倍型由Hap1連接；在網(wǎng)絡圖中，Hap1是最大單倍型群體，Hap1與Hap5、Hap6之間有兩個突變位點，表明它們遺傳相關性較弱；單倍型Hap2、Hap3、Hap4、Hap7和Hap8與Hap1只有一個突變位點，表明它們遺傳距離較近；單倍型Hap2由2個樣本的序列組成，它們分別來自阿勒泰和昌吉地區(qū)的包囊樣本。

圖3 cox1和nad1基因單倍型網(wǎng)絡圖

3 討論

本調查結果顯示，阿勒泰、伊犁和昌吉三個地區(qū)牛羊包蟲病感染率分別為0.82%、0.87%、3.85%，明顯低于2012年呂建忠等和2014年努斯來提·依不拉音等的調查[4-5]。主要原因是近年來政府和相關部門大力宣傳，農牧民防范意識增強，包蟲病獲得有效控制。另外，棘球蚴經(jīng)過1年左右的時間才能發(fā)育為肉眼可見的包囊[6]，多數(shù)羊被感染后在發(fā)育為棘球蚴包囊之前就已經(jīng)被屠宰，這可能也是本次調查感染率低的原因。該調查采集牛、綿羊宿主（5、51）的包囊樣本，其中牛源鈣化囊占60%（3/5）、綿羊源鈣化囊占25.49%（13/51）；1頭牛和13只綿羊的包囊樣本中可以分離出原頭節(jié)，為可育囊。結果表明牛包囊鈣化率比綿羊高，綿羊可育囊比牛多，這是由于綿羊為細粒棘球絳蟲G1基因型最適宜的中間宿主，而且隨著近年來上述地區(qū)牛羊科學飼養(yǎng)的推廣，驅蟲防疫規(guī)范，牛羊體質增強，破壞了免疫逃避，免疫細胞容易侵入包囊，使其感染發(fā)育不久便開始鈣化。

本試驗中，cox1基因序列變異率高于nad1基因，且所有樣本均鑒定為G1基因型。G1基因型可根據(jù)cox1基因和nad1基因核苷酸序列變異分為不同單倍型[7]。cox1基因共有25個單倍型，Hap1是最常見的單倍型，核苷酸序列與先前報道的澳大利亞[8]、土耳其[9]、墨西哥、阿根廷、伊朗[10]等很多國家單倍型核苷酸序列相同，這表明此單倍型分布廣泛。Hap2與西班牙報道的序列相同[11]，Hap9和Hap19與意大利和巴西報道的序列相同[10]，其他單倍型目前尚未見到報道。Hap2、Hap3、Hap7僅發(fā)現(xiàn)于阿勒泰，Hap13、Hap18、Hap23-Hap25僅發(fā)現(xiàn)于伊犁，其余的單倍型僅發(fā)現(xiàn)于昌吉。nad1基因共有8個單倍型，Hap1是最常見的單倍型，核苷酸序列與先前報道的阿爾及利亞、意大利、哈薩克斯坦等國家的相同[10]；Hap2、Hap4、Hap7 與在西藏報道的序列相同[12]；Hap3、Hap5、Hap6和Hap8的序列目前尚未見到報道；Hap3-Hap8僅發(fā)現(xiàn)于昌吉。這表明同一地區(qū)的蟲株具有相似的遺傳背景，而不同地區(qū)之間的蟲株遺傳背景差異比較大。本試驗發(fā)現(xiàn)同一宿主可感染不同的單倍型，究其原因可能是其感染了不同來源的蟲體排出的蟲卵，蟲卵可能來自同一條犬感染的不同蟲體，也可能是來自不同犬感染的不同蟲體，這揭示了細粒棘球絳蟲在草原牧區(qū)生態(tài)環(huán)境下傳播的復雜性，有待進行進一步的研究。

新疆牛羊主要流行G1基因型，除了G1基因型，2019年Guo等[13]利用cox1基因分析伊犁、塔城和烏魯木齊羊源樣本中還發(fā)現(xiàn)G3基因型。本調查在阿勒泰、昌吉和伊犁所采集的樣本進行cox1和nad1基因序列分析，均鑒定為G1基因型，未發(fā)現(xiàn)G3基因型，但cox1基因多態(tài)性比Guo等鑒定15個單倍型的較豐富。結果顯示：北疆部分地區(qū)細粒棘球絳蟲G1基因型基因多態(tài)性較豐富，說明細粒棘球蚴有廣泛中間宿主適應性，在長期進化演變過程中，寄生蟲在與宿主之間互相適應中發(fā)生變異，并且在驅蟲藥及免疫預防的選擇壓力作用下，促使它們發(fā)生變異，其變異累積的進化可能導致出現(xiàn)抗原變異，進而影響對家畜包蟲病驅蟲效果、診斷檢測和免疫預防[14]。

4 結論

該調查中，北疆阿勒泰、昌吉和伊犁等三個地區(qū)所鑒定的牛羊細粒棘球蚴均為G1基因型，并且感染率比之前文獻報道的有所下降。通過包囊樣本cox1基因和nad1基因序列進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)同一宿主可感染不同的蟲卵。