趙水仙 楊旭娟 楊曉蕓 黃 茜 黃 青 孟 珂 翁雨天 李 霞 劉一丹*

1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100； 3.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；4.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500

曲札茋苷是從植物拉薩大黃根莖中提取出來(lái)的一種化合物，分子式C20H22O9，屬于羥基二苯乙烯類化合物，具有較強(qiáng)的生物活性，具有抗凝血、清除氧自由基、抑制血小板聚集、較強(qiáng)的抗氧化性、保護(hù)腦組織、抑制炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而阻斷對(duì)腦組織的損傷作用[1-2]。注射用曲札茋苷為昆藥集團(tuán)股份有限公司自主研發(fā)的創(chuàng)新藥物，主要用于治療急性缺血性腦卒中，然而對(duì)注射用曲札茋苷用于其他新適應(yīng)癥的報(bào)道鮮有，例如對(duì)呼吸系統(tǒng)性疾病的作用尚無(wú)報(bào)道。

咳嗽、哮喘是呼吸系統(tǒng)中最常見(jiàn)的兩種疾病，一般情況下，咳嗽是一種重要的防御機(jī)制，通過(guò)清除咽部、呼吸道分泌異物從而防止感染形成，但是頻繁劇烈的咳嗽可能引起多個(gè)系統(tǒng)的并發(fā)癥，給患者造成極大痛苦，嚴(yán)重影響患者的工作、生活和社會(huì)活動(dòng)，咳嗽的治療在全球的范圍內(nèi)受到高度重視。哮喘是臨床上的常見(jiàn)多發(fā)病，嚴(yán)重威脅著公眾健康和生命安全，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，哮喘患病人群基數(shù)大，患病人口數(shù)逐年上升，而我國(guó)哮喘藥物主要依賴進(jìn)口藥[3-4]，因此，研發(fā)鎮(zhèn)咳、平喘藥物具有十分重要的意義。

筆者通過(guò)濃氨水致小鼠咳嗽法、酚紅排泌法、(Lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性肺損傷、豚鼠磷酸組胺和氯化乙酰膽堿引喘法，觀察曲札茋苷有無(wú)鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘及對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究，揭示曲札茋苷在鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘及治療急性肺損傷上的效果，以期為今后曲札茋苷新適應(yīng)癥的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)，為研究防治或改善呼吸系統(tǒng)疾病的創(chuàng)新藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物、試劑與儀器

1.1.1 藥物和試劑 注射用曲札茋苷(昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20190822-2)；苯酚紅(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：121220)；碳酸氫鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：140816)；氨溴索(昆藥集團(tuán)股份有限公司，171012-1)；脂多糖(LPS)(sigma,批號(hào)：L-2880)；鹽酸地塞米松(國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)：1904206)；磷酸可待因(青海制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H63020055 )；氨茶堿(昆藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H53021194)；磷酸組胺(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150510-201313)；生理鹽水(浙江國(guó)鏡藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A170525 A1)；水合氯醛(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)：119957)。

1.1.2 儀器 電子分析天平(Mettler Toledo)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司 DHG-9245A)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek powerwave)；離心機(jī)(effendorf)；超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司 402AI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性美國(guó)癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠，體重23～25g，由昆藥集團(tuán)動(dòng)物室提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K2014-0001；使用許可證：SYXK(滇)K2014-0001；發(fā)證機(jī)關(guān)：昆明市科學(xué)技術(shù)局。豚鼠，雌雄兼?zhèn)?，昆明楚商科技有限公司?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 濃氨水鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)[5]ICR小鼠50只，雄鼠，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只：空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)；除磷酸可待因僅實(shí)驗(yàn)當(dāng)日灌胃給藥1次外，其余各組均預(yù)先每日腹腔注射1次，連續(xù)3d，空白對(duì)照組注射等容量的0.9 %氯化鈉溶液，各組給藥容積均為20 mL/(kg·bw)。末次給藥后30 min,將小鼠逐一放入蒸發(fā)皿中，用250 mL燒杯反扣于上，同時(shí)向蒸發(fā)皿中迅速推入25% 濃氨水0.04 mL。以注入濃氨水至第一次張口咳嗽的時(shí)間為動(dòng)物咳嗽的潛伏期，觀察并記錄各鼠的咳嗽潛伏期及90 s內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)。為消除系統(tǒng)誤差，實(shí)驗(yàn)采用平行操作。

2.2 磷酸組胺和氯化乙酰膽堿致豚鼠哮喘實(shí)驗(yàn)[6]豚鼠，雌雄兼?zhèn)?，于?shí)驗(yàn)前一天用0.1 %磷酸組胺和1 %氯化乙酰膽堿以1∶1混合，按每只豚鼠噴霧5 mL對(duì)其進(jìn)行篩選，以45秒內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難或抽搐者為合格。哮喘反應(yīng)分為四級(jí): Ⅰ級(jí)-呼吸加速；Ⅱ級(jí)-呼吸困難；Ⅲ級(jí)-抽搐；Ⅳ級(jí)-跌倒，2 min內(nèi)未出現(xiàn)II-IV級(jí)癥狀者不予選用。

次日將合格豚鼠按性別和體重隨機(jī)分為5組，每組10只：空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組磷酸可待因(60 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(1.25、2.5、5 mg/kg)。除磷酸可待因僅實(shí)驗(yàn)當(dāng)日灌胃給藥1次外，其余各組動(dòng)物每日按劑量腹腔注射給藥1次，連續(xù)3d，空白對(duì)照組注射等容量的0.9 %氯化鈉溶液，容積為2 mL/(kg·bw)。末次給藥后30 min，將豚鼠逐一放入玻璃干燥器內(nèi)，打開(kāi)超聲霧化器噴霧45 s，記錄開(kāi)始噴霧至出現(xiàn)II-IV級(jí)癥狀的時(shí)間為哮喘潛伏期，若6 min內(nèi)無(wú)上述癥狀則計(jì)為360 s。為消除系統(tǒng)誤差，實(shí)驗(yàn)采用平行操作。

2.3 酚紅排泌實(shí)驗(yàn)[7]

2.3.1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取苯酚紅適量于容量瓶中，加入5 %的 NaHCO3溶液溶解，配制成100 μg/ mL 苯酚紅母液，吸取適量母液，分別稀釋成含苯酚紅0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5 、10 μg /mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以5 %的 NaHCO3溶液作空白調(diào)零，于 546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以苯酚紅濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 小鼠氣管酚紅排泌量測(cè)定 ICR小鼠50只，雄鼠，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(氨溴索，15 mg/kg )、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(2.5、5、10 mg/kg)。各組動(dòng)物每日按劑量尾靜脈注射給藥1次，連續(xù) 3 d，末次給藥前 12 h 禁食不禁水，于末次給藥后1 h，各組小鼠均腹腔注射5 % 酚紅溶液20 mL/kg.bw；注射30 min 后，處死動(dòng)物，剝離氣管組織，剪下小鼠自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入預(yù)先盛有3 mL 的5 % 碳酸氫鈉溶液的試管內(nèi)，振搖混勻后，置于離心機(jī)中離心(2000 r /min) 5min ，取上清液，于546 nm 處測(cè)定吸光度值，并按公式計(jì)算酚紅排泌量(μg/mL)。為消除系統(tǒng)誤差，實(shí)驗(yàn)采用平行操作。

2.4 LPS致急性肺損傷實(shí)驗(yàn)[8-10]ICR小鼠60只，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只：空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組地塞米松(10 mg/kg)、注射用曲札茋苷低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)；于試驗(yàn)當(dāng)天造模(LPS：按5 mg/mL，30 μL/只劑量，采用氣管滴入法推入)，空白組給予同等的手術(shù)刺激。造模后1 h，按劑量尾靜脈注射給藥1次，連續(xù)5d，空白、模型組均給予同體積的0.9 %氯化鈉溶液。

2.4.1 肺指數(shù)、肺含水量測(cè)定 末次給藥后1 h處死小鼠，開(kāi)胸取肺，用吸水紙吸干表面的血液和水分，用電子天平稱量全肺濕重(wet weight，W)，以全肺濕重與動(dòng)物體重的重量百分比為肺指數(shù)(lung index，LI)，于恒溫干燥箱80℃干燥24 h后，稱量肺干重(dry weight，D)，以(肺濕重-肺干重) / 濕重比值(W- D) / W為肺含水量。

3 結(jié)果

3.1 注射用曲札茋苷對(duì)濃氨水致咳嗽模型小鼠鎮(zhèn)咳作用的影響 與模型組比較，注射用曲札茋苷低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照磷酸可待因組均能明顯減少小鼠對(duì)濃氨水致咳嗽的咳嗽次數(shù)(P<0.05)。注射用曲札茋苷中劑量和高劑量組也可減少咳嗽次數(shù)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 注射用曲札茋苷對(duì)濃氨水致咳嗽模型小鼠鎮(zhèn)咳作用的影響

3.2 注射用曲札茋苷磷酸組胺和氯化乙酰膽堿致豚鼠哮喘實(shí)驗(yàn) 與模型組比較，曲札茋苷低劑量組能顯著延長(zhǎng)豚鼠哮喘潛伏期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各組均具有延長(zhǎng)潛伏期的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別給藥途徑動(dòng)物數(shù)/只劑量哮喘潛伏期/s模型組腹腔注射9-81.22±14.71陽(yáng)性對(duì)照組(氨茶堿)灌胃1040 mg/kg139.30±79.77?注射用曲札茋苷低劑量組腹腔注射101.25 mg/kg133.90±72.01?注射用曲札茋苷中劑量組腹腔注射102.5 mg/kg100.3±42.36注射用曲札茋苷高劑量組腹腔注射105 mg/kg93.9±42.29

3.3 注射用曲札茋苷對(duì)苯酚紅排泌模型小鼠祛痰作用的影響

3.3.1 苯酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線 以5 %的碳酸氫鈉溶液作為空白對(duì)照調(diào)零，在可見(jiàn)分光光度計(jì)上 546 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，以吸光度值對(duì)溶液中酚紅的濃度作回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= 0.1059X+ 0.0504 ，R= 0.999其中Y為吸光度值，X為酚紅溶液的濃度(單位: μg/mL )。結(jié)果如圖1所示。

圖1 苯酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 注射用曲札茋苷對(duì)苯酚紅排泌模型小鼠祛痰作用的影響 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組(氨溴索)能夠顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05)；注射用曲札茋苷低、中劑量組均能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.01)。見(jiàn)表3。

組別給藥途徑動(dòng)物數(shù)/只劑量酚紅排泌量/ μg/mL 模型組靜脈注射9-1.516±0.450陽(yáng)性對(duì)照組(氨溴索)靜脈注射1015 mg/kg2.120±0.649?注射用曲札茋苷低劑量組靜脈注射102.5 mg/kg2.167±0.512??注射用曲札茋苷中劑量組靜脈注射95 mg/kg2.081±0.381??注射用曲札茋苷高劑量組靜脈注射1010 mg/kg1.690±0.492

3.4 注射用曲札茋苷對(duì)LPS致急性肺損傷模型小鼠肺水腫的保護(hù)作用 空白組與模型組比較肺系數(shù)差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明LPS致小鼠急性肺損傷模型造模成功，與模型組比較，注射用曲札茋苷低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均能降低LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后的肺指數(shù)(LI)和肺含水量(W- D)/W(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組別劑量LI(W- D) / W空白組-0.8188±0.0508??0.7787±0.0048??模型組-1.8259±0.54480.7997±0.0093陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松)10 mg/kg1.2747±0.1821?0.7840±0.0047??注射用曲札茋苷低劑量組5 mg/kg1.3751±0.4302? 0.7913±0.0075?注射用曲札茋苷中劑量組10 mg/kg1.6911±0.45940.7948±0.0070注射用曲札茋苷高劑量組20 mg/kg1.6191±0.27650.7951±0.0078

4 討論

小鼠濃氨水鎮(zhèn)咳、酚紅排泌法是一種用于篩選鎮(zhèn)咳祛痰藥物可靠的實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)藥物的鎮(zhèn)咳效果進(jìn)行評(píng)價(jià)可分為：機(jī)械刺激法、化學(xué)刺激法和抗原致敏引咳法[11]，本研究采用小鼠濃氨水引咳的化學(xué)刺激，觀察刺激后90 s內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)，有鎮(zhèn)咳作用的藥物會(huì)明顯減少咳嗽次數(shù)；痰液是由肺泡、支氣管、氣管分泌，是引起咳嗽的一個(gè)重要因素，當(dāng)痰液排泌量增多時(shí)可減少呼吸道黏膜的刺激，從而起到止咳作用，通過(guò)測(cè)定氣管段中酚紅排泌量可以判斷出藥物的祛痰效果，有祛痰作用的藥物能夠促進(jìn)酚紅排泌量。本研究結(jié)果顯示，給于小鼠注射用曲札茋苷后，其明顯減少小鼠90 s內(nèi)的咳嗽次數(shù)，增加酚紅排泌量，提示曲札茋苷可以減少呼吸道黏膜的刺激，達(dá)到鎮(zhèn)咳效果。

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)和可逆性氣道阻塞為主要體重，氣道的慢性非特異性炎癥是哮喘發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)，是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)支氣管痙攣的主要原因[12]。目前臨床上應(yīng)用最多的非特異性氣道激發(fā)實(shí)驗(yàn)為吸入組胺和乙酰膽堿。在體研究顯示，曲札茋苷低劑量組能夠顯著地延長(zhǎng)豚鼠哮喘潛伏期，表明注射用曲札茋苷有明顯的平喘作用，而它的平喘機(jī)制可能與松弛氣管平滑肌有關(guān)。

急性肺損傷(ALI)的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜,肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制涉及多方面因素。近年來(lái)，大量研究表明，急性肺損傷的本質(zhì)發(fā)病機(jī)制是肺內(nèi)失控性炎癥反應(yīng)、機(jī)體抗炎、促炎系統(tǒng)的失衡。抑制和阻斷ALI發(fā)生時(shí)肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)，改善肺泡-毛細(xì)血管膜的通透性是當(dāng)前ALI治療的主要著眼點(diǎn)之一。其死亡率高達(dá)40%～60%[13]，目前ALI藥物治療方面沒(méi)有特效藥物。曲札茋苷是從天然藥物中發(fā)現(xiàn)的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)該成分在體內(nèi)有抗炎、抗血小板及降低血液粘度作用，并具有明確的肺靶向。本研究結(jié)果顯示，給于小鼠注射用曲札茋苷后，低劑量組能降低LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后的肺指數(shù)和肺含水量，說(shuō)明曲札茋苷可能是通過(guò)抑制和阻斷ALI發(fā)生時(shí)肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到對(duì)肺損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，注射用曲札茋苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘及急性肺損傷保護(hù)作用，對(duì)于治療呼吸系統(tǒng)性疾病具有一定的臨床意義和參考價(jià)值。本研究?jī)H從注射用曲札茋苷的藥效學(xué)方面探索其鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、急性肺損傷保護(hù)的作用，對(duì)其機(jī)制的探索還有待進(jìn)一步研究。