周曉瑞 汪浩洋 朱秋民 張 煒

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科(212001)

背景：近年長鏈非編碼RNA(lncRNA)被視為新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制中的研究較為有限。目的：探討lncRNA變化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。方法：Cox分析篩選出與TCGA數(shù)據(jù)集結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA，并分析目的lncRNA與臨床病理特征的相關(guān)性。構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)LINC00327的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，以實時定量PCR法檢測基因表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果：共94個lncRNA改變頻率為5%～31%。發(fā)生mRNA表達(dá)變化的7個lncRNA(DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315)與總體生存率低密切相關(guān)；6個發(fā)生拷貝數(shù)改變(CNA)的lncRNA(LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621)與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。上述mRNA表達(dá)變化與結(jié)直腸癌患者年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；CNA與腫瘤臨床分期和血管浸潤顯著相關(guān)。LINC00327下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。結(jié)論：與結(jié)直腸癌患者預(yù)后和臨床病理特征密切相關(guān)的lncRNA或許可用于結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)測發(fā)展以及預(yù)后分析。LINC00327可能為潛在的致癌基因。

結(jié)直腸癌是全球確診患者例數(shù)第三高的腫瘤，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率有上升的趨勢，且患者預(yù)后高度依賴個人吸煙史、運動習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)、用藥情況等。早期結(jié)直腸癌幾乎沒有特異性癥狀，加上缺乏早期診斷標(biāo)志物，導(dǎo)致大多數(shù)結(jié)直腸癌患者錯過早期就診的機會，預(yù)后較差[1-2]。盡早明確結(jié)直腸癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物對改善預(yù)后具有重要意義。

近年越來越多的研究證實長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有重要的生物學(xué)效應(yīng)[3]。研究表明非編碼RNA在正常組織穩(wěn)態(tài)和病理生理條件的調(diào)節(jié)中起有重要作用，尤其是lncRNA可影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、編碼RNA加工和不同階段的信號通路[4-5]。但目前對lncRNA的了解有限[6-7]。本研究通過篩選出與結(jié)直腸癌患者總體生存率(OS)或無病生存率(DFS)密切相關(guān)的lncRNA，分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，并探討LINC00327下調(diào)后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的變化，從而證實lncRNA對結(jié)直腸癌診斷和治療的價值。

材料與方法

一、數(shù)據(jù)庫搜索

cBioPortal(www.cbioportal.org)目前提供TCGA中293項腫瘤研究的116 025個腫瘤病例樣本[8]，其中包含八組結(jié)直腸癌樣本數(shù)據(jù)集。選擇樣本容量為629例患者的數(shù)據(jù)集進(jìn)行研究。將來自HGNC(http://www.genenames.org)的共計4 790個lncRNA(更新至2020-10-20)逐一代入cBioPortal，以GISTIC突變、拷貝數(shù)改變(CNA)、mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)和磷酸蛋白豐度四種lncRNA變化方式作為參數(shù)，查詢lncRNA在各參數(shù)下的變化情況，再通過GraphPad Prism 8繪制生存曲線，從而得到lncRNA的改變頻率以及發(fā)生lncRNA變化的患者的OS或DFS的P值。

二、主要實驗方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480購自ATCC，293T細(xì)胞株購自漢恒生物科技(上海)有限公司。SW480細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均包含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2，溫度為37 ℃。

2. 慢病毒感染：構(gòu)建三質(zhì)粒(REV、GAG、VAVG)慢病毒系統(tǒng)，包裝CRISPR/Cpf1-LINC00327質(zhì)粒后，使其感染293T細(xì)胞獲取病毒液。通過病毒液感染SW480細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)LINC00327的結(jié)直腸癌細(xì)胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)。感染SW480細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，更換為含10% FBS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3. 實時定量PCR(qPCR)：RNA提取試劑盒(上海超研生物科技有限公司)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(試劑購自南京諾維贊生物科技股份有限公司)，行實時定量PCR。LINC00327引物序列正義鏈：5’-CCT GTC AGG CTA GGT TCA CA-3’，反義鏈：5’-GCC AAG GAA GCA GAT ACA CG-3’；以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列正義鏈：5’-GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’，反義鏈：5’-GTG AGG GTC TCT CTC TTC CT-3’。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗至少重復(fù)三次。

4. CCK-8法：將細(xì)胞以體積100 μL/孔接種到96孔板，密度為5 000個細(xì)胞/孔。孵育4 h后加入10 μL CCK-8試劑(南京諾維贊生物科技股份有限公司)后繼續(xù)37 ℃孵育2 h，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時應(yīng)用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處的吸光度值。實驗至少進(jìn)行三次。

5. 侵襲實驗：以密度為10 000個細(xì)胞/室添加到上部小室(侵襲小室購自美國Costar公司)，上部小室的培養(yǎng)基不含F(xiàn)BS，下部小室培養(yǎng)基含10% FBS。37 ℃孵育24 h后，用棉簽擦拭過濾器上層細(xì)胞，冷甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下隨機選擇多個區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、LncRNA搜索結(jié)果

在cBioPortal數(shù)據(jù)集中逐一搜索來自HGNC數(shù)據(jù)庫的4 790個lncRNA，共識別出4 175個有效lncRNA。94個lncRNA改變頻率為5%～31%，包括CNA、mRNA表達(dá)變化。

二、LncRNA mRNA改變與患者OS密切相關(guān)

54個lncRNA mRNA表達(dá)改變頻率≥5%。Cox模型分析結(jié)果顯示，7個lncRNA與OS密切相關(guān)，即DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315(圖1A)。上述mRNA表達(dá)的總變異率為30%，mRNA發(fā)生改變者較未發(fā)生改變者的預(yù)后更差(P<0.01)(圖1A)。LncRNA mRNA表達(dá)改變包括上調(diào)和下調(diào)(圖1B)，推測正常表達(dá)時不具有促癌作用。以GISTIC突變、CNA、mRNA表達(dá)以及蛋白質(zhì)豐度和磷酸蛋白豐度作為研究參數(shù)時，上述7個lncRNA mRNA變化與DFS無明顯相關(guān)性。

此外，DSCR4A、DSCR8、LINC00161、LINC00313、LINC00315集中于21號染色體上，分布較為密集，最小間距僅為91 bp。

三、LncRNA CNA與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)

44個lncRNA的CNA頻率≥5%。Cox模型分析結(jié)果顯示，6個lncRNA為預(yù)測復(fù)發(fā)的最佳集合，即LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621(圖2A)。CNA的總變異頻率為6%，與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P<0.05)，且大部分改變是由于基因擴(kuò)增(圖2B)。當(dāng)CNA作為唯一參數(shù)時，6個lncRNA與OS無明顯相關(guān)。

A：6種與患者DFS相關(guān)的lncRNA的生存曲線；B：6種lncRNA CNA的變化頻率

此外，6個lncRNA均位于13號染色體長臂，除LINC00424位于13q12.11外，其余均位于13q12.12。

四、LncRNA變化與臨床病理特征的關(guān)系

選取629例患者的臨床病理特征，根據(jù)7個lncRNA mRNA表達(dá)是否發(fā)生變化，將患者分為mRNA變化組和對照組。結(jié)果顯示lncRNA mRNA表達(dá)變化與結(jié)直腸癌患者的年齡(P=0.004)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)密切相關(guān)(表1)。

表1 結(jié)直腸癌中mRNA表達(dá)變化與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)6個lncRNA CNA變化，將患者分為CNA擴(kuò)增組和未擴(kuò)增組。結(jié)果顯示6個lncRNA CNA的擴(kuò)增與結(jié)直腸癌的臨床分期(P=0.02)和血管浸潤(P=0.04)相關(guān)(表2)。

表2 結(jié)直腸癌中CNA與臨床病理特征的關(guān)系

五、LINC00327是一個潛在的致癌基因

以含有CRISPR/Cpf1質(zhì)粒的慢病毒下調(diào)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中LINC00327表達(dá)，以qPCR法挑選出LINC00327表達(dá)明顯下調(diào)的兩個單克隆細(xì)胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)作為實驗組，將未進(jìn)行處理的SW480細(xì)胞作為對照組。CCK-8和Transwell實驗結(jié)果顯示，LINC00327下調(diào)后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯下降(P<0.05；圖3)。說明LINC00327可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，可能為潛在的致癌基因。

A：成功構(gòu)建LINC00327下調(diào)的SW480細(xì)胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)；B：細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)；C：細(xì)胞侵襲能力(Transwell實驗)

討 論

相較胰腺癌、胃癌等其他腫瘤而言，lncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制中的研究較為有限。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)13個與結(jié)直腸癌患者預(yù)后具有相關(guān)性的lncRNA，并以LINC00327為代表驗證對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、增殖的影響，考慮可能為潛在的致癌基因。

目前用于結(jié)直腸癌診斷的常見血清學(xué)標(biāo)志物有癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、CA12-5和血清p53抗體[9-11]，但胰腺癌、肺纖維化、肝硬化、肝癌均可能導(dǎo)致血清CA19-9升高[12]，高水平CEA也常見于肺癌等惡性疾病[13]，CA12-5為診斷和監(jiān)測卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物[14]，血清p53抗體升高也可見于乳腺癌[15]。因此，上述腫瘤標(biāo)志物對結(jié)直腸癌的診斷缺乏特異性。目前組織病理學(xué)檢查為臨床診斷癌癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法不僅是有創(chuàng)操作，更重要的是用于活檢的組織未必能準(zhǔn)確反映腫瘤組織異質(zhì)性[16]。液體活檢是指對液體中腫瘤來源的蛋白質(zhì)、游離DNA以及編碼RNA等進(jìn)行定量、定性分析的新興診斷方法[17]。LncRNA在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄控制和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)臨近編碼基因表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，具體表現(xiàn)為其通過募集染色質(zhì)重塑復(fù)合體到特定的基因組位點來修飾染色質(zhì)，實現(xiàn)表觀遺傳的變化[18]；通過增強子和啟動子轉(zhuǎn)錄后實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[19]；通過剪接、編輯、運輸、翻譯和降解實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后處理[20]。LncRNA可在細(xì)胞凋亡和壞死后通過凋亡小體或細(xì)胞外囊泡從細(xì)胞中分泌至循環(huán)系統(tǒng)并與蛋白質(zhì)結(jié)合[21]，其既具有器官和細(xì)胞特異性又可在體液中檢測到，甚至有研究表明肺癌患者痰液中發(fā)現(xiàn)可作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的lncRNA[22]；膀胱惡性腫瘤患者尿液中可檢測到與預(yù)后不良有關(guān)的lncRNA表達(dá)譜[23]。較之腫瘤標(biāo)志物、組織活檢、液體活檢的局限性，經(jīng)篩選獲得的可作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的lncRNA具有數(shù)目龐大、易于獲得、較高的組織、器官特異性等優(yōu)勢，或許可將液體檢測范圍擴(kuò)大到lncRNA，以補充完善結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物，甚至作為獨立生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，mRNA表達(dá)發(fā)生變化的7個lncRNA(DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315)與OS低密切相關(guān)；而6個發(fā)生CNA的lncRNA(LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621)與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。6個lncRNA均位于13號染色體長臂上，13號染色體長臂已被確定為密切的腫瘤相關(guān)區(qū)域，如胃腸間質(zhì)瘤的進(jìn)展與13號染色體長臂喪失有關(guān)[24]；多發(fā)性骨髓瘤與13號染色體長臂染色體的完全或部分缺失密切相關(guān)[25]。抑癌基因RB在細(xì)胞周期中起重要的負(fù)向調(diào)控作用，可明顯抑制腫瘤的發(fā)展，其位于13q14.2號染色體[26]。為確定這些lncRNA是否與RB密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)離抑癌基因RB越遠(yuǎn)的基因的CNA越小，推測該組lncRNA CNA與腫瘤發(fā)生呈正相關(guān)，且作用與RB表達(dá)產(chǎn)物相反。

盡管上述lncRNA在結(jié)直腸癌中的作用仍有待確定，但其與癌癥死亡或復(fù)發(fā)的關(guān)系可能表明其發(fā)揮了致癌作用。與患者OS密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物是由mRNA發(fā)生改變的lncRNA組成的，其變化包括mRNA上調(diào)和下調(diào)，推測正常表達(dá)的mRNA不具有腫瘤驅(qū)動的作用。與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物是由發(fā)生CNA的lncRNA組成，推測其基因擴(kuò)增與腫瘤發(fā)生呈正相關(guān)。本研究通過實驗證實CNA改變頻率最高的LINC00327上調(diào)可能發(fā)揮致癌的作用，LINC00327下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

總之，本研究通過生物信息學(xué)篩選結(jié)合體外實驗的方法，證實LINC00327可能為結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物，后續(xù)可進(jìn)一步通過結(jié)合測序和生物信息學(xué)方法揭示LINC00327對臨近編碼基因進(jìn)行調(diào)控的具體機制[27-28]，以及LINC00327所在的LINC00327-mRNA/miRNA相互作用網(wǎng)的具體作用。