黃藝寧

(漳州職業(yè)技術學院，福建 漳州 363000)

毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)屬木耳目(Auriculariales)木耳科(Auriculariaceae)木耳屬(Auricularia)[1-3]，其質(zhì)地脆滑，清新爽口，食藥兼用，素有“樹上海蜇皮”之美稱，是熱帶和亞熱帶地區(qū)主要食用菌之一[4-5]。

長期以來，毛木耳栽培品種以43系列為主，品種比較單一，已滿足不了多元化的市場需求。此外，經(jīng)過多年的使用，栽培品種已出現(xiàn)不同程度的老化退化現(xiàn)象，產(chǎn)量、質(zhì)量均下降，導致毛木耳市場價格低迷，嚴重影響耳農(nóng)種植的積極性，制約毛木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，選育新品種是毛木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。毛木耳新品種的選育是以現(xiàn)有栽培菌株為基礎的，然而目前毛木耳栽培菌株混雜，不利于雜交育種工作的開展，迫切需要對引進的毛木耳菌株進行鑒定分類。傳統(tǒng)的食用菌鑒定方法主要是利用子實體的形態(tài)特征，需要出菇進行鑒定，不僅鑒定周期長，而且容易受到環(huán)境的影響。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記已經(jīng)廣泛應用在食用菌種質(zhì)資源鑒定評價方面。秦蓮花等[6]將ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))與ISSR(簡單重復序列間擴增)技術結(jié)合，作為香菇生產(chǎn)菌株鑒別的方法。張介馳等[7]采用ISSR鑒別27個東北地區(qū)黑木耳生產(chǎn)菌株。王守現(xiàn)等[8]采用酯酶同工酶聚類分析的方法，將6個灰樹花菌株分為三大類，RAPD(隨機擴增多態(tài)性)和ISSR共同驗證結(jié)果與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。楊軍等[9]采用ISSR和RAPD對供試的40株灰樹花菌株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用2種分子標記比單獨使用1種分子標記鑒定的結(jié)果更準確，菌株類別劃分更精細。在毛木耳種質(zhì)資源鑒定評價方面，張丹等[10]利用ISSR標記將55個供試毛木耳菌株分為5大類群，張丹等[11]利用22個RAPD引物對56個不同的木耳菌株進行分析鑒定，杜萍等[12]建立和優(yōu)化了野生毛木耳ISSR-PCR的反應體系。但結(jié)合ISSR和RAPD對毛木耳菌株進行鑒定和遺傳多樣性分析的研究卻鮮見報道。鑒于此，采用RAPD、ISSR 2種分子標記對10個不同來源的毛木耳菌株進行鑒定，研究其遺傳多樣性和親緣關系，為今后毛木耳雜交育種親本的選配及種質(zhì)資源的有效利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的10個毛木耳菌株具體信息見表1。

1.2 生化試劑

Taq酶、dNTPs、10×Buffer緩沖液、Mg2+等均購自TaKaRa公司(大連)；RAPD隨機引物、ISSR引物為Sangon產(chǎn)品。

表1 供試毛木耳菌株及其來源Tab.1 Tested strains of Auricularia cornea Ehrenb and their sources

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌株DNA提取 采用改良的CTAB法[13]提取DNA。

1.3.2 RAPD、ISSR多態(tài)性分析

1.3.2.1 PCR反應擴增體系 PCR反應擴增體系具體見表2，其中RAPD、ISSR反應體系的DNA模板使用量均為10 ng。

表2 PCR反應擴增體系Tab.2 PCR reaction system μL

1.3.2.2 PCR擴增條件及電泳 RAPD及ISSR反應程序參考文獻[14-15]。RAPD-PCR反應程序:起始94 ℃預變性7 min，94 ℃變性1 min，34 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)數(shù)35個，最后延伸72 ℃10 min。ISSR-PCR反應程序:起始94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，44～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 循環(huán)數(shù)35個，最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測：取擴增產(chǎn)物7 μL，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/mL GoldViewTM DNA 染料)，160 V恒壓1.5 h，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計DNA條帶，構建“0-1”矩陣表，輸入Excel軟件，利用公式計算多態(tài)性比率(P)[16]，P=k/n×100%，式中：k為多態(tài)性位點數(shù)，n為位點總數(shù)。

利用DPS統(tǒng)計軟件，采用Jaccard聚類距離中的類平均法(UPGMA)進行聚類分析，并形成供試菌株的遺傳聚類圖。

1.5 綜合RAPD、ISSR聚類分析

綜合RAPD和ISSR擴增條帶的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行相似系數(shù)計算和UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛木耳菌株的RAPD分析結(jié)果

2.1.1 多態(tài)性分析結(jié)果 利用3個RAPD引物對供試菌株進行PCR擴增(圖1—3、表3)。擴增條帶大小分布在0.30～2.50 kb。每個引物擴增的條帶數(shù)有差異，為8～11條，每個引物平均擴增9.3條條帶，共獲得28個擴增條帶，多態(tài)性比率為100%。說明這3個RAPD引物擴增毛木耳多態(tài)性強、穩(wěn)定，供試菌株多態(tài)性豐富。

2.1.2 聚類分析結(jié)果 由圖4可以看出，供試菌株間相異距離為0.25～0.89，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時，所有供試菌株被分為5個群體，包括2個復合群體和3個單一群體。菌株781、大光、白背毛木耳、黃背木耳、臺耳134為一個群體；43、43-28為另一個群體；99豐、43-1、川毛10號為3個單獨群體。其中，43、43-28相異距離為0.34，說明這2個菌株遺傳距離較近。川毛10號與2個復合群體的相異距離為0.80。99豐、43-1與其他菌株相異距離為0.89，說明這2個菌株與其他菌株的遺傳距離遠，親緣關系遠。在供試菌株中遺傳距離最近的為白背毛木耳、黃背木耳，相異距離為0.25。

圖1 引物S33對10個毛木耳菌株擴增的RAPD分子標記圖譜Fig.1 Amplification RAPD map of primer S33 for 10 tested strains

圖2 引物S1508對10個毛木耳菌株擴增的RAPD分子標記圖譜Fig.2 Amplification RAPD map of primer S1508 for 10 tested strains

圖3 引物S2058對10個毛木耳菌株擴增的RAPD分子標記圖譜Fig.3 Amplification RAPD map of primer S2058 for 10 tested strains

表3 RAPD標記所用的PCR引物序列及擴增結(jié)果Tab.3 PCR primer sequences and amplification results used in RAPD

2.2 毛木耳菌株的ISSR分析結(jié)果

2.2.1 多態(tài)性分析結(jié)果 利用4個ISSR引物對供試菌株進行PCR擴增(圖5、表4)。擴增條帶大小分布在0.25～1.90 kb。每個引物擴增的條帶數(shù)量有差異，為7～9條，平均擴增8條條帶。共獲得32條擴增條帶，其中，多態(tài)性條帶為30條，多態(tài)性比率為93.75%，每個引物平均擴增7.5條多態(tài)性條帶。說明這4個ISSR引物擴增毛木耳多態(tài)性強、穩(wěn)定，供試菌株多態(tài)性豐富。

2.2.2 聚類分析結(jié)果 由圖6可以看出，供試菌株間相異距離為0.10～0.85。在相異距離為0.60時，所有供試菌株被分為4個群體，包括1個復合群體和3個單一群體。99豐、川毛10號、43為3個單獨群體，其他菌株聚為一類。99豐與其他菌株的相異距離為0.85，說明99豐遺傳距離最遠。在相異距離為0.15時，菌株781、黃背木耳、白背毛木耳聚為一類，說明這3個菌株的遺傳距離較近。

圖4 10個毛木耳菌株基于RAPD的遺傳聚類結(jié)果Fig.4 Genetic clustering map of 10 test strains based on RAPD

圖5 引物ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、ISSR18(d)對10個毛木耳菌株擴增的ISSR分子標記圖譜Fig.5 Amplification ISSR map of primer ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、 ISSR18(d) for 10 tested strains

表4 ISSR標記所用引物序列及擴增結(jié)果Tab.4 PCR primer sequences and amplification results used by ISSR

2.3 綜合RAPD、ISSR的聚類分析結(jié)果

由圖7可以看出，供試菌株間相異距離在0.13～0.87，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時，所有供試菌株被分為5個群體，包括2個復合群體和3個單一群體。菌株43、43-28為一個群體，相異距離為0.48，說明這2個菌株遺傳距離較近。大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺耳134這5個菌株為另一大的群體，相異距離為0.40，遺傳距離較近。川毛10號、99豐、43-1為3個單獨群體。99豐、川毛10號、43-1與其他菌株的相異距離分別為0.87、0.77、0.70，遺傳距離較遠。在綜合聚類分析時，在相異距離為0.87時，99豐與43-1聚在一起，而利用RAPD單獨分析時，在相異距離為0.80時，99豐與43-1聚為一類。

圖6 10個毛木耳菌株基于ISSR的遺傳聚類結(jié)果Fig.6 Genetic clustering results of 10 test strains based on ISSR

圖7 供試菌株基于RAPD、ISSR的遺傳聚類結(jié)果Fig.7 Genetic clustering results of test strain based on RAPD and ISSR

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源是品種選育的物質(zhì)基礎[17]。種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究是評價種質(zhì)資源的主要手段，可以為種質(zhì)資源的有效、合理利用提供重要的遺傳信息。傳統(tǒng)的食用菌鑒定方法鑒定周期長且容易受到環(huán)境的影響。目前,分子標記已經(jīng)廣泛應用于食用菌種質(zhì)資源的鑒定評價。近幾年來，基于PCR的分子標記技術如RAPD、ISSR、序列相關擴增多態(tài)性(SRAP)等被應用于食用菌的品種鑒定、親緣關系和遺傳多樣性、進化關系等方面的研究[18-23]。RAPD分子標記技術原理是對基因組DNA進行隨機擴增，操作簡單，而且可以檢測整個基因組，檢測效率高[24]，具有通用性[25]，多態(tài)性好，但存在重復性差等問題。ISSR是基于SSR發(fā)展的分子標記技術，不同材料的SSR數(shù)目、間隔長短不同，使得特定結(jié)合位點相應變化[26]，因此，可以分析不同樣品的多態(tài)性。ISSR更加穩(wěn)定、可靠，試驗重復性好，可以較好地克服RAPD的缺點[27]。由于每種分子標記擴增的基因組DNA位置不同，利用多種分子標記相結(jié)合進行遺傳分類、多樣性分析，比單獨使用一種分子標記分析的結(jié)果更準確[28]。

本研究引進湖南、四川、貴州、湖北、江蘇、福建等地的毛木耳菌株。采用RAPD、ISSR 2種分子標記技術對供試菌株進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試菌株多態(tài)性較為豐富，RAPD、ISSR分子標記的多態(tài)性比率分別為100%、93.75%。說明RAPD、ISSR可以檢測到供試菌株豐富的遺傳多態(tài)性，能夠?qū)┰嚲赀M行有效的區(qū)分。

供試菌株間相異距離為0.13～0.87，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時，基于RAPD分子標記的聚類分析，供試菌株被分為5個群體，菌株781、大光、白背毛木耳、黃背木耳、臺耳134為一個群體；43、43-28為另一個群體；99豐、43-1、川毛10號為3個單獨群體?；贗SSR分子標記的聚類分析，所有供試菌株被分為4個群體，99豐、川毛10號、43為3個單獨群體，其他菌株聚為一類?；诓煌姆肿訕擞洠┰嚲昃垲愑邢嗨频牡胤?。如基于RAPD的聚類分析，菌株白背毛木耳與黃背木耳相異距離為0.25?；贗SSR的聚類分析，菌株白背毛木耳與黃背木耳相異距離為0.15。RAPD、ISSR分子標記相互印證說明這2個菌株遺傳距離比較近，遺傳背景較一致。試驗也發(fā)現(xiàn)基于不同分子標記的聚類分析有一定的差異。如基于RAPD的聚類分析，43-1為單獨一類，與其他菌株的遺傳距離遠，相異距離為0.80，說明43-1與其他菌株親緣關系遠。而基于ISSR的聚類分析，在相異距離為0.50時，43-1與大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺耳134這5個菌株聚在一起，說明43-1與這5個菌株遺傳距離較近。再比如，基于RAPD的聚類分析，菌株43與43-28的相異距離為0.34，說明這2個菌株遺傳距離較近。而基于ISSR的聚類分析，菌株43與43-28的相異距離為0.68，說明這2個菌株遺傳距離比較遠。表明這2種分子標記各自的分析結(jié)果有一定的差異，所以單獨使用一種分子標記進行遺傳多樣性分析有一定的局限性，這與江玉姬等[28]的結(jié)論一致。綜合RAPD、ISSR 2種分子標記的多態(tài)性位點進行聚類分析，所有供試菌株被分為5個群體，菌株43、43-28為一個群體，菌株43、43-28的相異距離為0.48，說明2個菌株的遺傳距離較近。結(jié)合這2個菌株的來源分析，43-28是從43選育而來的，兩者具有較相似的遺傳背景，遺傳距離近。這也印證了綜合RAPD、ISSR進行遺傳分析較為準確。毛木耳包括黃背毛木耳、白背毛木耳兩大栽培種類。由于43-28為漳州主栽白背毛木耳品種，43為老的白背毛木耳品種，分析這個群體為白背毛木耳種類。大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺耳134這5個菌株為另一大的群體，菌株781為漳州90年代的主栽種，是黃背毛木耳品種。大光、黃背木耳分別來源于福建省三明真菌研究所、四川省農(nóng)業(yè)科學院，均是黃背毛木耳種類，因此推測這個大類群為黃背毛木耳種類，但在這個類群中，出現(xiàn)來自華中農(nóng)業(yè)大學的白背毛木耳，這個菌株與黃背木耳的相異距離為0.25，2個菌株遺傳距離較近，遺傳背景相似。理論上這個菌株也是屬于黃背毛木耳的范疇。但從菌株名稱來看，白背毛木耳屬于白背毛木耳種類的范疇。推測白背毛木耳菌株為名稱混淆，結(jié)果有待于進一步驗證。99豐、川毛10號、43-1為3個單獨群體。99豐、川毛10號、43-1與其他菌株的相異距離分別為0.87、0.77、0.70，遺傳距離遠，親緣關系遠。根據(jù)本試驗結(jié)果，3個單一群體、2個復合群體之間的菌株遺傳距離較遠，可作為育種親本的備選菌株。本研究主要從分子水平上對供試菌株進行鑒定，今后的試驗可再結(jié)合菌株菌絲、子實體形態(tài)特征及其生理生化特征，實現(xiàn)毛木耳菌株更加全面、準確的鑒定分析，為其育種提供性狀互補、遺傳距離遠的優(yōu)良親本。