劉 鵬,劉瑜倩,蘭太進(jìn),黃攢詩,羅榮將,陸安揚(yáng),張遠(yuǎn)鴻,林 江

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧 530200)

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii),又名合浦珠母貝(Pinctadafucata),隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamelli branchia)、珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada),為我國南方生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類,主要分布于我國廣西、廣東、海南[1-2]。合浦珍珠盛產(chǎn)于廣西北海合浦,是我國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[3-4]。珍珠粉自古藥食同源,千百年來一直被奉為純天然養(yǎng)顏美容、功能性食品,是具有價(jià)值的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)的來源[5-6]。研究表明,合浦珍珠的化學(xué)成分包括無機(jī)物質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)和水。無機(jī)物質(zhì)主要是碳酸鈣[7-9];有機(jī)物質(zhì)主要是小分子活性多肽、多糖、核酸、8種人體必需氨基酸以及十多種與人體新陳代謝相關(guān)的氨基酸,且包含一些具有特殊生理活性的非蛋白氨基酸,如?；撬岬?另外還含有銅、鐵、鎂、錳、鈉、鋅、鍶等微量元素,種類齊全,且比例組合形式符合人體需要[10-11]。

合浦珍珠作為傳統(tǒng)名貴的道地藥材,歷代中醫(yī)典籍對(duì)合浦珍珠的性味功效皆有明確記載,如明朝李時(shí)珍所著的《本草綱目》寫道:“珍珠味咸,甘寒無毒。鎮(zhèn)心點(diǎn)目。涂面,令人潤澤好顏色。涂手足,去皮膚逆臚,墜痰,除面斑,止泄。除小兒驚熱,安魂魄。止遺精白濁,解痘療毒”[12];現(xiàn)代典籍《中華人民共和國藥典》及《中藥大辭典》亦記有:“珍珠具有安神定驚、明目去翳、解毒生肌、潤澤肌膚”的功效[13]。合浦珍珠粉因功效顯著且無毒副作用等特點(diǎn),常出現(xiàn)在各類方劑、保健食品中[14]。如Knijnenburg等[15]報(bào)道,納米珍珠粉在健康成人中顯示出良好的鈣吸收和保留性能,可以提高骨骼和血清鈣水平,增加股骨重量和長度;另珍珠粉被臺(tái)灣婦女廣泛用作孕期和產(chǎn)后的健康補(bǔ)充劑[16-17];珍珠粉含有豐富的氨基酸、有機(jī)鈣、硒、鋅等微量元素,能在短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充機(jī)體鈣質(zhì),并提供一些微量金屬元素,從而改善免疫系統(tǒng),可用作高級(jí)保健食品的原料[18];珍珠粉具有良好的抗氧化性能,Yang等[19]證實(shí)珍珠粉能抑制2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞氧化溶血、脂質(zhì)過氧化和紅細(xì)胞膜蛋白的氧化損傷;珍珠粉含有豐富的蛋白質(zhì),Chiu等[20]以秀麗隱桿線蟲為模型,通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),證實(shí)珍珠粉蛋白提取物是一種有效的抗氧化劑,能延長線蟲壽命,表明珍珠粉可以作為功能性食品開發(fā),用于一些年齡相關(guān)性退行性疾病的保健養(yǎng)生。很多天然物質(zhì)具有良好的抗菌性能,常被開發(fā)為食品或添加劑[21],而合浦珍珠粉作為一種無毒的天然海洋活性物質(zhì),關(guān)于其抗菌性能的研究目前國內(nèi)外尚鮮少報(bào)道。

本研究以合浦珍珠粉為原材料,采用超聲-酸解-加熱聯(lián)合處理法制備合浦珍珠提取物,以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌,采用牛津杯法、二倍梯度稀釋法等評(píng)價(jià)合浦珍珠提取物的體外抑菌效果,并探討其抑菌活性的穩(wěn)定性,旨在為綜合利用合浦珍珠這一珍稀藥食兼用海洋生物資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

合浦珍珠粉 北海市寶珠林海洋科技有限公司;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923、胰蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、瓊脂粉等常規(guī)試劑 北京索萊寶科技有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá);Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀 美國BioTek;THZ-300C型恒溫?fù)u床(可制冷) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;XY-SH-150-Ⅲ型智能生化培養(yǎng)箱、XY-JH-11C型個(gè)人型單面超凈臺(tái) 上海昕儀儀器儀表有限公司;SCIENTZ-12N型普通型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;YXQ-LS-100A型內(nèi)循環(huán)立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;RH basic 2型經(jīng)濟(jì)型加熱磁力攪拌器 德國IKA(艾卡)公司;牛津杯(內(nèi)徑(6±0.1) mm,外徑(7.8±0.1) mm,高(10±0.1) mm) 江蘇三愛思科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合浦珍珠提取物的制備 參考Yang等[22]方法并進(jìn)行一定修改。準(zhǔn)確稱取5.0 g合浦珍珠粉末,按1∶40 g/mL比例加入5%醋酸溶液,室溫下超聲破碎,破碎條件:功率250 W,工作時(shí)間5 s,間歇時(shí)間5 s,全程30 min;隨后室溫下繼續(xù)磁力攪拌6 h,調(diào)節(jié)pH為7.0,再轉(zhuǎn)移至40 ℃的恒溫箱中磁力攪拌過夜,結(jié)束后于沸水中保持15 min,冷卻后4 ℃ 5000 r/min離心15 min,取上清,用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,凍干成粉,室溫保存。

1.2.2 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性試驗(yàn) 采用牛津杯法檢測(cè)合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性。從LB固體平板上挑取金黃色葡萄球菌單菌落,接種到5 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)4 h至生長對(duì)數(shù)期,稀釋到1×106CFU·mL-1。移液器移取200 μL菌懸液,均勻涂布于LB固體平板上,用無菌鑷子將滅菌干燥后的牛津杯置于平板表面,輕輕按壓固定,吸取200 μL濃度為200 mg·mL-1的合浦珍珠提取物(pH=7.0)加到牛津杯中,陰性對(duì)照組為200 μL無菌水,每組設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),4 ℃擴(kuò)散3 h后,正置于37 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h觀察抑菌圈的形成,并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小[23]。

1.2.3 最小抑菌濃度MIC的測(cè)定 采用二倍梯度稀釋法測(cè)量合浦珍珠提取物的最小抑菌濃度[24]。方法同上制備金黃色葡萄球菌1×106CFU·mL-1菌懸液。使用無菌96孔板進(jìn)行最小抑菌濃度檢測(cè),在每孔中加入100 μL稀釋后的菌懸液,隨后加入100 μL不同濃度的無菌水稀釋的合浦珍珠提取物,各組濃度如下:240.00、120.00、60.00、30.00、15.00、7.50、3.75、1.88、0.94、0.47和0.24 mg·mL-1,陰性對(duì)照組為無菌水,以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培養(yǎng)液作為空白對(duì)照,每組平行3個(gè)孔,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,隨后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600,測(cè)定合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。

1.2.4 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響 同1.2.2方法,制備金黃色葡萄球菌濃度為1×106CFU·mL-1的菌懸液。對(duì)照組為無菌水,實(shí)驗(yàn)組為0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC和128×MIC,迅速混勻置于37 ℃靜置培養(yǎng)。合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的生長影響實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)選擇0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51 h 18個(gè)時(shí)間點(diǎn),以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培養(yǎng)液作為空白對(duì)照,每組設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),采用96孔法檢測(cè)合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響。

1.2.5 溫度對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1濃度的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將其分別在-80、-20、4、25、37、60、80和100 ℃下處理30 min,以金黃色葡萄球菌為指示菌,設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),采用96孔法分別檢測(cè)不同溫度對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.6 反復(fù)凍融對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將其置于-20 ℃冷凍,隨后室溫下快速解凍,凍融次數(shù)分別為0、1、2、3、4、5和6次,以添加等體積的無菌水作為對(duì)照,設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),采用96孔法分別檢測(cè)反復(fù)凍融對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.7 pH對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 將120 mg·mL-1合浦珍珠提取物分別與pH為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的無菌水以1∶1的比例混合,置于4 ℃ 24 h,再將所有組別pH調(diào)至7.0,且用無菌水分別將其體積調(diào)為一致確保合浦珍珠提取物的濃度一致,最終采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用96孔法分析不同pH對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.8 紫外線照射對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將其敞開放置在20 W紫外燈光下,分別照射0、5、10、15、20、25和30 min,以金黃色葡萄球菌為指示菌,設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),采用96孔法檢測(cè)紫外線對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.9 金屬離子對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使用15 mg·mL-1的合浦珍珠提取物分別與不同濃度0、25、50、100和200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2溶液等體積混合,設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),置于37 ℃處理1 h,隨后采用96孔法分析不同離子強(qiáng)度對(duì)合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響。

1.2.10 胰蛋白酶與胃蛋白酶對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 將胰蛋白酶加入pH為7.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,胃蛋白酶加入pH為2.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,酶的終濃度均為1.0 mg·mL-1,37 ℃處理1 h,再用100 ℃處理5 min,終止酶反應(yīng),室溫12 000 r/min離心5 min,收集上清,調(diào)節(jié)pH為7.0,過濾除菌,使用7.5 mg·mL-1濃度的合浦珍珠提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),未經(jīng)酶處理的合浦珍珠提取物作為對(duì)照,設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),采用96孔法分析蛋白酶對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 6.0分析合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用,SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05,表明具有顯著性差異,P<0.01,表明具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 合浦珍珠提取物的制備及對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

本實(shí)驗(yàn)采用超聲破碎聯(lián)用酸解法制備合浦珍珠提取物,凍干成粉(如圖1A),使用無菌去離子水溶解為240.00 mg·mL-1,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用牛津杯法檢測(cè)合浦珍珠提取物抑菌活性,根據(jù)是否有抑菌活性判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:抑菌圈直徑大于6 mm判斷為有抑菌活性,小于等于6 mm為無抑菌活性;3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均達(dá)到有抑菌活性結(jié)果者判為合格。陰性對(duì)照組應(yīng)無抑菌圈,否則實(shí)驗(yàn)視為無效[25]。其中抑菌圈直徑大于6 mm小于10 mm視為低度敏感;大于10 mm小于15 mm視為中度敏感;大于15 mm視為高度敏感[26]。結(jié)果顯示,提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑菌活性,抑菌圈直徑為(17.861±0.948) mm(如圖1B),高度敏感。

圖1 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)Fig.1 Antibacterial activity of Hepu pearl extracts against S. aureus注:A:合浦珍珠提取物凍干粉;B:合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈實(shí)驗(yàn),1:陰性對(duì)照;2～4:合浦珍珠提取物240.00 mg·mL-1。

2.2 合浦珍珠提取物最小抑菌濃度的測(cè)定

采用96孔法檢測(cè)合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度,結(jié)果顯示,37 ℃培養(yǎng)24 h后,空白組無細(xì)菌生長,其他各組均有細(xì)菌生長。通過組間單因素方差分析,與陰性對(duì)照組比較,0.94～240.00 mg·mL-1的合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長抑制具有極顯著性差異(F=34.909,P<0.01),最低抑菌濃度為0.94 mg·mL-1,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈一定的劑量依賴關(guān)系(如表1)。

表1 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)Table 1 Experiment on the MIC of Hepu pearl extract on S. aureus

2.3 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長影響

如圖2所示,在LB培養(yǎng)基中加入濃度為0.5×MIC的合浦珍珠提取物,金黃色葡萄球菌的生長基本不受影響,隨著提取物濃度的增大,對(duì)金黃色葡萄球菌生長的抑制作用越明顯,且當(dāng)添加的合浦珍珠提取物濃度≥2×MIC時(shí),金黃色葡萄球菌的生長受到顯著(P<0.05)抑制,與陰性對(duì)照相比,其延緩期明顯延長。

圖2 合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長影響Fig.2 Effects of Hepu pearl extract on the growth of S. aureus

2.4 溫度對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖3 所示,以金黃色葡萄球菌的OD600值為指標(biāo)探討提取物抑菌活性[27],-80～80 ℃處理30 min,與4 ℃處理組相比抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定,但與100 ℃處理30 min抑菌活性相比有所下降,大約為4 ℃的68%,但與對(duì)照組相比,所有處理組仍具有極顯著(P<0.01)的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度對(duì)合浦珍珠提取物抗菌活性的影響Fig.3 Effect of different temperature on the antibacterial activity of Hepu pearl extracts注:“**”表示與對(duì)照相比,P<0.01,差異極顯著;圖4～8相同。

2.5 反復(fù)凍融對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖4所示,-20 ℃反復(fù)凍融提取物1～6次,其抑菌活性與未凍融組相比無顯著變化,且與對(duì)照組相比,仍有顯著的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中抑菌活性物質(zhì)在反復(fù)凍融的情況下仍具有穩(wěn)定的抑菌活性。

圖4 反復(fù)凍融對(duì)合浦珍珠提取物抗菌活性的影響Fig.4 Effect of repeated freezing-thawing on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.6 pH對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖5所示,合浦珍珠提取物在pH3.0～9.0范圍內(nèi)的抑菌活性保持穩(wěn)定,但在pH11.0時(shí)略有下降,相比pH7.0提取物抑菌活性保留約70%,但總體上與對(duì)照相比菌仍有極顯著(P<0.01)抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中的活性物質(zhì)具有良好的酸堿穩(wěn)定性,在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下仍具有抑菌活性。

圖5 pH對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of pH on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.7 紫外線對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖6所示,合浦珍珠提取物經(jīng)20 W紫外線處理5～30 min后,與未經(jīng)紫外線處理組相比,抑菌活性無顯著變化。說明合浦珍珠提取物中的活性物質(zhì)能夠?qū)棺贤饩€的破壞,保證其在自然環(huán)境中也能發(fā)揮較好的抑菌活性。

圖6 紫外線對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.6 Effect of ultraviolet ray on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.8 金屬離子對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖7所示,合浦珍珠提取物在25～200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2條件下,抑菌活性基本不受影響,但在25～200 mmol·L-1MgCl2條件下,抑菌活性逐漸降低,在200 mmol·L-1MgCl2條件下時(shí),抑菌活性相比未添加金屬離子組保留約40%;但與對(duì)照相比仍有顯著抑菌活性,分析可能是高濃度的Mg2+與提取物中的活性物質(zhì)結(jié)合,對(duì)其結(jié)構(gòu)有一定的影響,從而使其抗菌活性略有降低[28]。

圖7 金屬離子對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.7 Effects of metal ions on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.9 胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖8所示,與未經(jīng)處理的提取物組相比,胰蛋白酶處理1 h后的合浦珍珠提取物抑菌活性有所下降,相對(duì)抑菌活性保留約70%,但相比對(duì)照組仍有極顯著(P<0.01)抑菌活性;而經(jīng)胃蛋白酶處理后的提取物,抑菌活性喪失。表明合浦珍珠提取物對(duì)胰蛋白酶具有一定的耐受性,但對(duì)胃蛋白酶較為敏感。

圖8 胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.8 Effect of trypsin and pepsin on antibacterial activity of Hepu pearl extract

3 結(jié)論

本研究采用超聲-酸-加熱聯(lián)合法制備合浦珍珠提取物,以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗(yàn)菌,探討合浦珍珠提取物的體外抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性。牛津杯實(shí)驗(yàn)表明合浦珍珠提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性,最小抑菌濃度為0.94 mg·mL-1,且呈一定的劑量依賴效應(yīng);并且≥2×MIC的合浦珍珠提取物能顯著(P<0.05)抑制金黃色葡萄球菌的生長;合浦珍珠提取物表現(xiàn)出良好的抑菌穩(wěn)定性,對(duì)溫度不敏感,耐酸堿,對(duì)紫外線和反復(fù)凍融和金屬離子其抑菌活性比較穩(wěn)定,對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定,但對(duì)胃蛋白酶比較敏感,總體上合浦珍珠提取物表現(xiàn)出了良好體外抑菌活性和穩(wěn)定性。在后續(xù)研究中,課題組擬將結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討其抑菌作用和安全性評(píng)價(jià),分析其對(duì)其他細(xì)菌、真菌的抑菌活性,后續(xù)將對(duì)提取物進(jìn)行分離鑒定,獲得具體活性單體物質(zhì),從而為推廣合浦珍珠資源綜合利用和精深加工奠定一定基礎(chǔ)。