關(guān)尚瑋,陳 愷,萬(wàn)紅艷,劉慧麗,范利君,王雪妃,李煥榮

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

棗(ZiziphusjujubeMill)鼠李科(Rhamnaceae)木本植物。大棗中含有豐富的黃酮類、有機(jī)酸、糖類、維生素和礦物質(zhì)元素等物質(zhì),有很高的保健作用和藥用價(jià)值[1]。紅棗除少部分鮮食外,大量被制成干棗制品進(jìn)行銷售[2],目前大棗的干制方式主要分為自然干制和熱風(fēng)干制[3],大棗熱風(fēng)干燥是一種高效、流行的果實(shí)保鮮和深加工方法[4]。不同的干制方式對(duì)大棗的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有很大的影響。有機(jī)酸作為棗果中重要的風(fēng)味指標(biāo)之一,對(duì)果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有著重要的作用[5]。大棗中的酸類物質(zhì)可以起到免疫調(diào)節(jié)作用,提高大鼠的免疫應(yīng)答,降低自身體內(nèi)的低抗體應(yīng)答[6]。大棗在不斷地發(fā)育過(guò)程中,三羧酸循環(huán)(TCAC)及糖異生作用在不斷地消耗有機(jī)酸,使有機(jī)酸在果實(shí)內(nèi)部逐漸代謝。大棗加工制品中,有機(jī)酸的含量在不同的處理方法中逐步地發(fā)生變化,從而影響大棗的品質(zhì)[7]。

目前有機(jī)酸常見(jiàn)的測(cè)定方法有滴定法、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)[8-12]等,其中氣相色譜法不適用于不揮發(fā)性物質(zhì)和對(duì)熱敏感性物質(zhì),且前處理比較繁瑣[13]。高效液相色譜法因高效快速、靈敏度較高、穩(wěn)定性好在有機(jī)酸含量的測(cè)定與分析過(guò)程中被廣泛地使用[14-17]。高效液相色譜法用于分析大棗在干制過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化研究較少,大多集中在生長(zhǎng)發(fā)育期間以及干制過(guò)后產(chǎn)品的測(cè)定[18-22]。王向紅等[23]利用HPLC測(cè)定不同種類的棗果中齊墩果酸和熊果酸的含量并進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)酸棗中有機(jī)酸的含量明顯高于其它大棗中的酸含量。劉禎妍等[24]使用高效液相色譜法對(duì)‘駿棗’的果實(shí)、葉片在生長(zhǎng)過(guò)程中有機(jī)酸的變化趨勢(shì)進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)駿棗中主要以蘋(píng)果酸、檸檬酸為主,果實(shí)與葉片中酸的總含量變化趨勢(shì)相同。但是,關(guān)于哈密大棗中有機(jī)酸含量變化方面的研究少有報(bào)道[25-26]。基于前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ),45 ℃熱風(fēng)干制[27]條件,哈密大棗有較好的果型指數(shù)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

本研究以脆熟全紅期的哈密大棗作為實(shí)驗(yàn)材料,采用自然曬干與45 ℃熱風(fēng)干制處理,對(duì)哈密大棗干燥過(guò)程中6種有機(jī)酸的含量進(jìn)行定性和定量分析,探究哈密大棗在自然曬干與熱風(fēng)干制過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化規(guī)律,為哈密大棗果實(shí)品質(zhì)的研究提供理論依據(jù),從而更好地控制大棗在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈密大棗 均產(chǎn)自新疆哈密;95%乙醇、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸等 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇(色譜純)等 上海源葉生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

HPLC(LC-20A)高效液相色譜儀 日本島津公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海市一恒科技有限公司;Q-250DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;HP-01循環(huán)水式多用真空泵 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 自然曬干:晾曬場(chǎng)地系烏魯木齊新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)工科樓,平均日照12 h,晾曬期間最高溫度27 ℃,最低氣溫7 ℃。將脆熟全紅期哈密大棗30 kg平鋪于涼席上,放置于天臺(tái)空地進(jìn)行晾曬,含水量控制在25%左右停止晾曬,在自然曬干過(guò)程中每隔2 d取一次樣,每次取樣250 g,測(cè)定大棗中有機(jī)酸的含量。

熱風(fēng)干制:干燥箱升溫至45 ℃時(shí),將哈密大棗鋪平放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行熱風(fēng)干制,在熱風(fēng)干制過(guò)程中每隔4 h取一次樣,每次取樣250 g,當(dāng)大棗的水分含量控制在25%左右時(shí)干制結(jié)束,測(cè)定項(xiàng)目同上。

1.2.2 有機(jī)酸測(cè)定方法的建立 色譜條件:WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)進(jìn)行分離，流動(dòng)相為一定濃度的KH2PO4緩沖溶液∶甲醇=9∶1；調(diào)節(jié)到一定pH；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2.1 色譜條件的優(yōu)化 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:分別對(duì)6種有機(jī)酸在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,比較各有機(jī)酸在不同波長(zhǎng)處的最大吸收峰。

流動(dòng)相濃度的選擇:將流速調(diào)整為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL,磷酸鹽緩沖溶液的濃度分別調(diào)整為0.01、0.05、0.1 mol/L?？疾觳煌瑵舛鹊牧鲃?dòng)相對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間的影響。

流動(dòng)相pH的選擇:流速調(diào)整為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL,固定磷酸鹽的濃度不變?yōu)?.05 mol/L,用1.0 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH,考察不同pH(2.1、2.3、2.5、2.7、2.9)條件下各有機(jī)酸的分離情況。

1.2.2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取適量的草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水超聲溶解,分別制成15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取草酸溶液1 mL,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸溶液各10 mL,蘋(píng)果酸溶液1 mL,富馬酸溶液1 mL,加入超純水配制成草酸溶液0.5 mg/mL、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸溶液1 mg/mL、蘋(píng)果酸溶液3 mg/mL、富馬酸0.1 mg/mL的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別過(guò)0.22 μm微孔濾膜待測(cè)。連續(xù)6次進(jìn)樣,并進(jìn)行測(cè)定。以有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.4 樣品處理 參照張麗麗等[28-30]的方法并進(jìn)行改進(jìn),準(zhǔn)確稱量棗果5.00 g,加入適量超純水,置于預(yù)冷的研缽內(nèi),將研缽放置于冰塊上研磨至勻漿,使用15 mL超純水進(jìn)行多次沖洗研缽并轉(zhuǎn)至25 mL離心管中,超聲提取20 min后,將離心管轉(zhuǎn)至4 ℃ 15000 r/min離心20 min,過(guò)濾,收集濾液,采用超純水定容至10 mL容量瓶中,通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,置于樣品瓶中進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Lab Solution工作站,色譜圖中各峰的峰面積與其保留時(shí)間對(duì)得到的物質(zhì)進(jìn)行定量與定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)6種有機(jī)酸在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,發(fā)現(xiàn)各種有機(jī)酸在210 nm波長(zhǎng)處均有較大的吸收峰,故采用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相濃度的選擇 磷酸鹽緩沖液濃度的高低影響酸存在形式的穩(wěn)定性,從而影響分離效果。將流動(dòng)相配制成不同濃度的溶液,研究流動(dòng)相濃度對(duì)各酸保留時(shí)間的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,當(dāng)流動(dòng)相的濃度為0.05 mol/L時(shí),各物質(zhì)的分離度較好。隨著流動(dòng)相濃度的繼續(xù)增加,其分離效果稍有增強(qiáng)。但由于高濃度的鹽會(huì)對(duì)泵和柱子的壽命產(chǎn)生影響,因此選擇0.05 mol/L的KH2PO4溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 流動(dòng)相濃度對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of mobile phase concentration on retention time

2.1.3 流動(dòng)相pH的選擇 通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH,可以達(dá)到抑制有機(jī)酸在水溶液中解離的作用。將流動(dòng)相調(diào)成不同pH,按照同樣的色譜條件,得到流動(dòng)相pH對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,改變流動(dòng)相的pH對(duì)草酸以及蘋(píng)果酸的保留時(shí)間影響最大,但pH的降低會(huì)增加色譜柱的損傷,當(dāng)流動(dòng)相的pH為2.3時(shí),各物質(zhì)的保留時(shí)間以及分離度較好,所以選用流動(dòng)相的pH為2.3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of mobile phase pH on retention time

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由表1可知,6種有機(jī)酸在0.0005～3 mg/mL線性范圍內(nèi),決定系數(shù)(R2)在0.9991～0.9996之間,表明6種有機(jī)酸的相關(guān)性良好,檢出限范圍在0.0002～0.0005 mg/mL之間,定量限范圍在0.0008～0.0098 mg/mL,在此條件下可測(cè)定大棗中的有機(jī)酸含量。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)Table 1 Linear parameters of standard curve of organic acid

2.3 HPLC圖譜分析

有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖3。從圖3得出,6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到基線分離。精確吸取哈密大棗溶液20 μL進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4表明,哈密大棗溶液中含有5種有機(jī)酸,且分離度較好,琥珀酸未檢出。

圖3 有機(jī)酸混標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of organic acid mixed reference

圖4 哈密大棗有機(jī)酸高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography of organic acids in hami jujube

2.4 精密度檢測(cè)結(jié)果

準(zhǔn)確吸取稀釋后的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別計(jì)算其精密度。由表2可知,各混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.99%～4.00%之間,表明該方法的精密度達(dá)到分析要求。

表2 測(cè)定方法的精密度Table 2 Precision of the method

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取哈密大棗樣品6份,按1.2.2.4方法制備樣品溶液,按照上述色譜條件進(jìn)樣20 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3得出,6次實(shí)驗(yàn)的RSD均在0.45%～4.11%之間,表明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 測(cè)定方法的重復(fù)性Table 3 Repeatability of the method

2.6 回收率結(jié)果

準(zhǔn)確稱取哈密大棗5.0 g,按照按1.2.2.4方法制備樣品提取液,準(zhǔn)備同一樣品提取液6份,將不同質(zhì)量濃度的各種有機(jī)酸標(biāo)樣加入至每份提取液中,充分混勻后,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè),平行測(cè)定6次,根據(jù)加入的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與檢出的質(zhì)量濃度計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,各有機(jī)酸的回收率在95.96%～104.35%范圍之間,說(shuō)明此方法在測(cè)定過(guò)程中的回收率良好,精確度較高。

表4 有機(jī)酸加標(biāo)回收率Table 4 Standard recovery rate of organic acids

2.7 哈密大棗有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果

由圖5得出,自然曬干整個(gè)過(guò)程中,5種有機(jī)酸含量呈先下降后上升的趨勢(shì),且在干制初期變化明顯,琥珀酸未檢出。

圖5 自然曬干過(guò)程中有機(jī)酸含量變化Fig.5 Changes of organic acid content in natural drying process注:不同字母表示差異顯著(P<0.05);圖6同。

在干制初期,隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng),大棗中的有機(jī)酸參與三羧酸循環(huán)的量逐漸增加,有機(jī)酸在不斷的代謝過(guò)程中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘?致使酸含量不斷降低。其中蘋(píng)果酸的含量在第4 d降至最低值,為(7.58±0.05) mg/g,且差異顯著(P<0.05),富馬酸含量在第6 d含量降至最低,為(0.02±0.03) mg/g,差異顯著(P<0.05)。隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng),大棗的呼吸作用不斷減弱,有機(jī)酸開(kāi)始快速積累[31]。其中草酸在干制第10 d達(dá)到(0.14±0.08) mg/g,蘋(píng)果酸、檸檬酸、富馬酸在干制第12 d分別達(dá)到(10.15±0.19)、(1.38±0.01)、(0.33±0.08) mg/g。上升幅度從大到小依次為蘋(píng)果酸>酒石酸>檸檬酸>富馬酸>草酸,至干制結(jié)束第12 d時(shí),草酸與酒石酸含量分別降至(0.08±0.09)、(3.72±0.28) mg/g。

由圖6可知,在整個(gè)熱風(fēng)干制過(guò)程中,隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng),45 ℃熱風(fēng)干制條件下,總有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),且在干制結(jié)束時(shí),干棗中有機(jī)酸含量明顯高于鮮棗,這可能與相關(guān)代謝酶活性和熱脅迫的影響有關(guān)。在干制初期,蘋(píng)果酸含量相對(duì)較高,在第12 h酸含量降至最低,為(6.62±0.58) mg/g、酒石酸在第12 h含量降至最低,為(3.02±0.09) mg/g?？赡苁且?yàn)殡S著熱風(fēng)干制時(shí)間的不斷延長(zhǎng),導(dǎo)致呼吸作用停止以及酶活性被抑制,有機(jī)酸停止消耗,致使各有機(jī)酸含量相對(duì)升高。草酸在干制第12 h酸含量降至最低,在第52 h含量升至最高。至干制結(jié)束第96 h,草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、富馬酸含量分別為(0.21±0.01)、(5.32±0.29)、(10.41±0.34)、(0.98±0.03)、(0.31±0.13) mg/g。

圖6 45 ℃干制過(guò)程中有機(jī)酸含量變化規(guī)律Fig.6 The variation rule of organic acid content in dry preparation at 45 ℃

綜上所述,哈密大棗在干制過(guò)程中主要以蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸為主,琥珀酸未檢出,表明哈密大棗屬于蘋(píng)果酸型果實(shí),這與馬倩倩等[32]的研究基本一致。王恒超等[33]研究了駿棗在干制過(guò)程中總酸的變化情況,隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng),酸含量由于呼吸作用的加強(qiáng),呈下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究與其相比,具體測(cè)定了總酸中各有機(jī)酸的含量變化,趨勢(shì)存在差異可能與棗果的品種、有機(jī)酸的提取方法以及有機(jī)酸含量的計(jì)算方式有關(guān)。大棗中的蘋(píng)果酸與檸檬酸是三羧酸循環(huán)途中的主要中間產(chǎn)物,通常情況下可能不會(huì)大量的積累,然而有機(jī)酸含量的不斷降低主要是在干燥過(guò)程中一部分有機(jī)酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘?一部分則氧化成CO2和H2O。而大棗中檸檬酸的積累,可能是在TCA過(guò)程中,上游階段檸檬酸的合成比較活躍,而下游階段的分解環(huán)節(jié)受抑制等原因造成的[34]。干燥過(guò)程中,蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸(SDH)的活性變化,均對(duì)蘋(píng)果酸的積累和降解有顯著影響[35]。45 ℃熱風(fēng)干制和自然曬干相比,在干制結(jié)束時(shí),蘋(píng)果酸、檸檬酸的含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。其中自然曬干在12 d時(shí)結(jié)束干制,45 ℃熱風(fēng)干制在96 h時(shí)結(jié)束干制,由此相對(duì)較低的感知溫度處理,可以縮短干制時(shí)間,又能保存大量的生理活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)建立了哈密大棗有機(jī)酸含量測(cè)定的高效液相色譜分析方法,并利用此方法測(cè)定了哈密大棗在自然曬干與45 ℃熱風(fēng)干制過(guò)程中5種有機(jī)酸含量的變化。研究表明,不同干制方式處理哈密大棗在干燥過(guò)程中,5種有機(jī)酸含量變化趨勢(shì)呈現(xiàn)明顯差異,琥珀酸未檢出,有機(jī)酸變化由高到低的順序依次為:蘋(píng)果酸>酒石酸>檸檬酸>富馬酸>草酸。各有機(jī)酸的含量以干基計(jì)算,消除了干燥過(guò)程中水分散失對(duì)有機(jī)酸的影響,更真實(shí)地反映了有機(jī)酸種類和含量的內(nèi)在變化形式,從而建立了一種較高效、便捷的測(cè)定大棗中有機(jī)酸含量的方法,相較傳統(tǒng)的有機(jī)酸檢測(cè)方法靈敏度高,更加方便快捷。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未測(cè)定在干制過(guò)程中影響哈密大棗有機(jī)酸的相關(guān)酶活性變化,酶活性的高低也會(huì)影響到果實(shí)中有機(jī)酸的含量。因此,對(duì)哈密大棗在干制過(guò)程中有機(jī)酸代謝的相關(guān)酶活性的測(cè)定還有待進(jìn)一步的研究。