曹發(fā)昊,張潔花,王艷萍

(1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系,山西運(yùn)城 044000; 2.山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院,山西運(yùn)城 044000)

桑葉是桑科植物桑樹(MornsalbaL.)的葉子,是一類藥食同源的植物資源。我國桑樹資源豐富,桑葉富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì),具有天然無毒、藥理作用廣泛等優(yōu)點(diǎn),引起了國內(nèi)外學(xué)者研究開發(fā)的關(guān)注[1-4]。生物堿是桑葉中一種重要的活性成分,其中哌啶類生物堿是其主要成分,特別是1-脫氧野尻霉素是桑葉的標(biāo)志性生物堿,具有降血糖、抗氧化、降血脂等功效[5-8]。前期研究工作發(fā)現(xiàn),桑葉生物堿提取過程中,色素等一些物質(zhì)在溶劑或儀器的作用下會(huì)同時(shí)溶出,加深提取液的顏色,影響后續(xù)的含量檢測分離和純化工作,因此有必要對(duì)提取液進(jìn)行脫色處理。目前,活性成分提取中常用的脫色方法有活性炭法、雙氧水法和大孔樹脂法。雙氧水法是化學(xué)脫色方法,利用其氧化性破壞色素結(jié)構(gòu)進(jìn)行脫色,但同時(shí)活性成分也可能被破壞。大孔樹脂脫色法成本相對(duì)較高,后續(xù)處理工藝較復(fù)雜?；钚蕴渴且环N常用的物理吸附劑,原料便宜,工藝易操作,脫色吸附效果較好,不會(huì)影響目標(biāo)提取物的活性,廣泛用于不同物質(zhì)的脫色處理,但活性炭在除去色素的同時(shí),可能會(huì)吸附一些活性成分,造成活性成分得率下降,這也是脫色工藝優(yōu)化中要考慮的[9-10]。目前有關(guān)桑葉生物堿脫色的相關(guān)研究較少。

目前,臨床用于治療糖尿病的藥物一大類就是作用于糖苷酶的抑制劑[11]。桑葉生物堿是多羥基含氮的生物堿,是一種重要的天然糖苷酶抑制劑,其分子結(jié)構(gòu)類似葡萄糖,其中的氮元素能增強(qiáng)其取代二糖(或低聚糖)與糖苷酶結(jié)合,從而競爭性抑制糖苷酶活性[12]。采用4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)底物,在糖苷酶作用下可以水解為葡萄糖和對(duì)硝基苯酚,對(duì)硝基苯酚在400 nm左右有最大吸收峰,當(dāng)有糖苷酶抑制劑時(shí),就會(huì)減弱酶促反應(yīng),產(chǎn)物濃度下降,吸光度下降,在一定濃度范圍其下降程度和抑制劑活性呈正比關(guān)系,基于該作用原理,可以評(píng)價(jià)桑葉生物堿對(duì)糖苷酶的抑制作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)在前期桑葉生物堿提取研究工作的基礎(chǔ)上,通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化桑葉生物堿的活性炭脫色工藝,并對(duì)脫色后生物堿抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行研究,以期為桑葉生物堿的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯桑桑葉 2018年9月采集于山西省蠶業(yè)科學(xué)院蠶?；?4-羥基哌啶 武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司;顆?；钚蕴?唐山華能活性炭有限公司;吐溫-80、雷氏鹽 上海研域化學(xué)試劑有限公司;4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-葡萄糖苷酶(10萬U/g) 上海寶曼生物科技有限公司;阿卡波糖 上海贏瑞生物醫(yī)藥科技有限公司。

VS22-600C數(shù)控超聲清洗器 無錫沃信儀器制造有限公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;UV-5200紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;HHS21-6恒溫水浴鍋 常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司;BJ-800A中藥粉碎機(jī) 江陰市海鑫藥化機(jī)械制造有限公司;WD-2102A全自動(dòng)酶標(biāo)儀 上海茸研儀器有限公司;RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉生物堿的提取 陰干的桑葉粉碎過60目篩,將桑葉粉和酸性乙醇(30%乙醇-0.05 mol/L HCl)按照料液比1∶30 g/mL混合,加入吐溫-80(4 mg/mL)置于水浴溫度60 ℃、功率700 W超聲器中處理30 min后過濾,保留濾液,濾渣按照前述步驟再次提取1次,合并濾液即得桑葉生物堿提取液。

1.2.2 生物堿含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 本研究選取4-羥基哌啶作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用雷氏鹽比色法建立測定生物堿的的標(biāo)準(zhǔn)曲線[14-15]。將4-羥基哌啶標(biāo)準(zhǔn)品2.0200 g溶于0.05 mol/L鹽酸溶液中,得到0.04 mol/L標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別準(zhǔn)確移取2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL不同體積標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL容量瓶中,用0.05 mol/L鹽酸溶液稀釋定容得到濃度為0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028 mol/L待測標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2 mL待測標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入3 mL 2%雷氏鹽溶液,混勻后冰浴1.5 h,抽濾得到沉淀,蒸餾水沖洗抽濾沉淀,然后用70%丙酮溶解定容至10 mL,于523 nm測定吸光度值A(chǔ)[16-17]。

1.2.2.2 桑葉生物堿含量測定 取2 mL桑葉生物堿提取液,按“1.2.2.1”所述方法測定樣品的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中生物堿含量。

1.2.3 桑葉生物堿提取液活性炭脫色工藝 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究了活性炭和雙氧水對(duì)桑葉生物堿提取液的脫色效果,發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿提取液中加入10%雙氧水,在60 ℃恒溫水浴中45 min,其脫色率為41.50%,保留率為42.56%;而桑葉生物堿提取液經(jīng)活性炭處理后,其脫色率和保留率可以達(dá)到70%以上,綜合考慮,選用活性炭進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 活性炭處理 活性炭浸泡于5%氫氧化鈉溶液,煮沸20～30 min后過濾,去離子水沖洗至呈中性;然后浸泡于6 mol/L鹽酸溶液中,煮沸20～30 min后過濾,去離子水沖洗至中性,120 ℃烘干備用。

1.2.3.2 桑葉生物堿提取液的活性炭脫色方法 移取生物堿提取液于錐形瓶中,加入一定量活性炭,置于速度180 r/min水浴恒溫振蕩器中,在一定溫度下振蕩處理適當(dāng)時(shí)間后,抽濾2次,除去活性炭,保留濾液。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 按照“1.2.3.2”所述方法,通過單因素實(shí)驗(yàn)考察四個(gè)因素(活性炭用量、脫色時(shí)間、水浴溫度和脫色次數(shù))對(duì)活性炭脫色效果的影響,測定脫色率和保留率,以Z值(脫色率和保留率加權(quán)歸一化值)為考察指標(biāo)。單因素試驗(yàn)條件為:固定水浴溫度為50 ℃,脫色時(shí)間為20 min,脫色次數(shù)為1次,分別加入不同活性炭用量(2%、3%、4%、5%、6%)對(duì)提取液進(jìn)行脫色;固定活性炭用量為4%,水浴溫度為50 ℃,脫色次數(shù)為1次,分別按不同脫色時(shí)間(10、15、20、25、30 min)對(duì)提取液進(jìn)行脫色;固定活性炭用量為4%,脫色時(shí)間為20 min,脫色次數(shù)為1次,分別在不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)提取液進(jìn)行脫色;固定活性炭用量為4%,脫色時(shí)間為20 min,水浴溫度為50 ℃,分別對(duì)提取液進(jìn)行不同次數(shù)(1、2、3、4、5次)的脫色。

1.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定了四個(gè)因素的最佳取值范圍,利用L9(34)正交表進(jìn)一步優(yōu)化活性炭的最佳脫色條件,每個(gè)因素和水平設(shè)計(jì)見表1,測定脫色率和保留率,以Z為考察指標(biāo)。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of L9(34)orthogonal experiment

1.2.6 脫色效果評(píng)價(jià) 分別取脫色前和脫色后的提取液于分光光度計(jì)波長523 nm處,測定其吸光度值,按照“1.2.2.2”所述方法測定相應(yīng)的生物堿含量,利用下面兩個(gè)公式計(jì)算脫色率和保留率。

以指標(biāo)所測的最大值為參照將所得數(shù)據(jù)(脫色率和保留率)進(jìn)行歸一化為Z值,利用Z值評(píng)價(jià)活性炭的脫色效果[18]。利用綜合加權(quán)評(píng)分法[19],考慮兩個(gè)指標(biāo)對(duì)脫色效果的貢獻(xiàn),賦予兩個(gè)所測指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均為0.5,將每個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)除以該指標(biāo)的最大值再乘以100打分結(jié)果分別記為X1和X2,按照加權(quán)評(píng)分方法計(jì)算Z=0.5×(X1+X2)。

1.2.7α-葡萄糖苷酶活性測定 將脫色的和未脫色的桑葉提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速180 r/min,水浴溫度60 ℃)濃縮,得到浸膏,然后用0.1 mol/mL pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)溶解得到待測樣品溶液。在文獻(xiàn)[20]方法基礎(chǔ)上改進(jìn):在120 μL不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)的樣品溶液中分別加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL),混合后37 ℃孵育10 min,然后加入50 μL反應(yīng)底物PNPG溶液(5 mmol/L),37 ℃孵育30 min后,加入100 μL碳酸鈉溶液(0.2 mol/L),反應(yīng)停止后于405 nm測定吸光度A。陰性對(duì)照組不加樣品溶液,空白對(duì)照組不加樣品溶液和酶液,背景對(duì)照組不加酶液,陽性對(duì)照組用阿卡波糖替換樣品溶液。每孔溶液體積一樣,不足者用PBS溶液補(bǔ)充。計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50。

抑制率(%)=[(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)-(A樣品實(shí)驗(yàn)組-A背景對(duì)照組)]/(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。WPS軟件處理圖和表,SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性檢驗(yàn),P<0.05和P<0.01分別表示數(shù)據(jù)間差異顯著和極其顯著。Graphpad prism 7.0軟件計(jì)算桑葉生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo),以4-羥基哌啶溶液濃度C(mol/L)為橫坐標(biāo),所得測定生物堿濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=33.829C-0.0316(r=0.9996),在0.008～0.028 mol/L線性關(guān)系好。

2.2 桑葉生物堿提取液活性炭脫色單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 活性炭用量的影響 桑葉生物堿提取液加入活性炭,在50 ℃脫色20 min、脫色1次,活性炭用量對(duì)脫色率和保留率的影響見圖2。總體上隨著活性炭用量的增加,脫色率逐漸變大,生物堿保留率逐漸減小。當(dāng)活性炭用量小于4%時(shí),脫色率增幅趨勢較大,這可能是由于活性炭對(duì)不同物質(zhì)吸附性不一樣,提取液中色素含量可能高于生物堿,色素吸附作用較強(qiáng);當(dāng)活性炭用量大于4%,脫色率增幅趨勢平緩,保留率持續(xù)下降,可能由于活性炭對(duì)色素的吸附和解吸達(dá)到平衡,生物堿的吸附作用增強(qiáng)[21-22]。利用Z值評(píng)價(jià)活性炭用量的脫色效果見圖3。活性炭用量2%～4%內(nèi)Z值逐漸變大,4%～6%內(nèi)Z值逐漸減小,選取3%～5%用于正交試驗(yàn)。

圖2 活性炭用量對(duì)脫色率和保留率的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on decolorization rate and retention rate

圖3 活性炭用量對(duì)Z值的影響Fig.3 Effect of activated carbon dosage on Z value

2.2.2 脫色時(shí)間的影響 桑葉生物堿提取液加入4%活性炭,在50 ℃脫色1次,脫色時(shí)間對(duì)脫色率和保留率的影響見圖4?？傮w上隨著時(shí)間增加,脫色率逐漸變大,保留率逐漸減小。當(dāng)脫色時(shí)間小于20 min時(shí),脫色率增大幅度較大;當(dāng)脫色時(shí)間大于20 min后,脫色率變化較平緩,而保留率繼續(xù)減小,活性炭主要通過物理吸附發(fā)揮作用,存在吸附和解析的動(dòng)態(tài)平衡,在20 min之前,活性炭對(duì)色素的競爭性吸附作用強(qiáng)于生物堿,故脫色率增加幅度較大,20 min之后,活性炭對(duì)色素吸附逐漸處于動(dòng)態(tài)平衡,而對(duì)生物堿的吸附尚未達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)向吸附生物堿的作用逐漸增強(qiáng)[23-24]。利用Z值評(píng)價(jià)脫色時(shí)間的脫色效果見圖5。總體上隨著脫色時(shí)間延長,Z值先增加后減小,其中脫色時(shí)間20 min的Z值較大,選取15、20、25 min用于正交試驗(yàn)。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)脫色率和保留率的影響Fig.4 Effect of decolorization time on decolorization rate and retention rate

圖5 脫色時(shí)間對(duì)Z值的影響Fig.5 Effect of decolorization time on Z value

2.2.3 水浴溫度的影響 桑葉生物堿提取液加入4%活性炭,脫色20 min,脫色1次,水浴溫度對(duì)脫色率和保留率的影響見圖6?？傮w上隨著溫度升高,脫色率先變大后減小,保留率持續(xù)下降,其中30～50 ℃內(nèi)脫色率逐漸增加,50～70 ℃內(nèi)脫色率逐漸下降,可能由于溫度越高,溶液粘度下降,分子運(yùn)動(dòng)加快,有利于活性炭吸附,但是溫度太高,就會(huì)造成活性炭的解吸作用大于吸附作用,另外高溫可能影響生物堿的穩(wěn)定性,使保留率下降[25]。利用Z值評(píng)價(jià)水浴溫度的脫色效果見圖7?？傮w上隨著水浴溫度升高,Z值先變大后減小,其中50 ℃的Z值最大,選取40、50、60 ℃用于正交試驗(yàn)。

圖6 水浴溫度對(duì)脫色率和保留率的影響Fig.6 Effect of water bath temperature on decolorization rate and retention rate

圖7 水浴溫度對(duì)Z值的影響Fig.7 Effect of water bath temperature on Z value

2.2.4 脫色次數(shù)的影響 桑葉生物堿提取液加入4%活性炭,在50 ℃脫色20 min,脫色次數(shù)對(duì)脫色率和保留率的影響見圖8。隨著脫色次數(shù)增加,脫色率增加幅度不大,但保留率持續(xù)減小?；钚蕴繉?duì)色素和生物堿的吸附可能存在競爭性,隨著脫色次數(shù)增加,活性炭對(duì)色素的吸附先逐漸達(dá)到飽和,而后逐漸增強(qiáng)了對(duì)生物堿的吸附作用,導(dǎo)致保留率下降,另外,由于活性炭顆粒較小,超過3次處理后,發(fā)現(xiàn)部分微小活性炭顆粒進(jìn)入提取液中,反而引起溶液顏色變暗,會(huì)影響脫色效果[26]。脫色1次的Z值大于脫色2次和3次的,但是三者間沒有顯著性差異(P>0.05),選取1、2、3次用于正交試驗(yàn)。

圖8 脫色次數(shù)對(duì)脫色率和保留率的影響Fig.8 Effect of decolorization frequency on decolorization rate and retention rate

圖9 脫色次數(shù)對(duì)Z值的影響Fig.9 Effect of decolorization frequency on Z value

2.3 桑葉生物堿提取液活性炭脫色正交試驗(yàn)

以Z值為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化活性炭脫色結(jié)果見表2。通過對(duì)比各因素R值,確定四個(gè)因素對(duì)脫色效果的影響順序依次是:脫色次數(shù)>活性炭用量>脫色時(shí)間>水浴溫度,優(yōu)化出活性炭最佳脫色條件的組合為A2B3C3D2,即桑葉生物堿提取液用4%活性炭在60 ℃脫色25 min,脫色2次。通過3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證,所得脫色率為79.80%±5.08%,保留率為78.52%±4.75%,驗(yàn)證試驗(yàn)所得Z值為100,實(shí)驗(yàn)結(jié)果高于正交試驗(yàn)的其他組合,表明A2B3C3D2可以作為活性炭脫色的最佳工藝條件,桑葉提取液在此條件下脫色后,其生物堿含量由28.02%提高到47.39%。

表2 活性炭脫色正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of activated carbon decolorization

2.4 脫色處理對(duì)桑葉生物堿α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

桑葉生物堿提取液經(jīng)優(yōu)化脫色條件處理后,對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用見圖10。在0.5～8.0 mg/mL內(nèi),脫色前、后的生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著濃度的增加而變大,且呈劑量依賴性,兩者的最大抑制率分別為51.37%±4.58%和63.06%±5.38%,其中濃度2.0～8.0 mg/mL脫色后生物堿的抑制率顯著高于相同濃度脫色前生物堿(P<0.05);通過處理濃度和抑制率的關(guān)系,阿卡波糖、脫色前、后的生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度IC50分別為1.72、7.75和4.27 mg/mL,表明脫色后生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強(qiáng)于脫色前。

圖10 脫色前、后的桑葉生物堿 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.10 The inhibition rate of decolorized and non-decolorized alkaloids from mulberry leaf on the α-glucosidase activity注:相同濃度條件下抑制率比較,不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極其顯著(P<0.01)。

3 討論和結(jié)論

劉率男等[27]研究了生物堿含量53.4%的桑葉生物堿體外對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。本研究桑葉生物堿提取液用4%活性炭在60 ℃脫色25 min,脫色2次,其生物堿含量由脫色前的28.02%提高到脫色后的47.39%,并且脫色后生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度IC50(4.27 mg/mL)小于脫色前的(7.75 mg/mL),后續(xù)工作有必要進(jìn)一步對(duì)桑葉生物堿進(jìn)行加工處理,并研究其單體化學(xué)成分組成。

本研究采用超聲波加表面活性劑法提取桑葉生物堿,通過在提取液中加入4%活性炭在60 ℃脫色25 min,脫色2次取得較好的脫色效果,其脫色率和保留率分別為79.80%和78.52%,其Z值可達(dá)100;濃度2.0～8.0 mg/mL脫色后桑葉生物堿的抑制率顯著高于相同濃度脫色前生物堿(P<0.05),脫色前、后桑葉生物堿的最大抑制率分別為51.37%和63.06%,脫色前、后生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50分別為7.75和4.27 mg/mL,脫色可以提高桑葉生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,為桑葉生物堿提取和純化提供了理論支持。