文鵬程,曹 磊,馬瑞娟,朱妍麗,楊 敏,張忠明,張衛(wèi)兵,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

牦牛曲拉,又稱奶渣,是將牦牛乳脫脂后,在自然條件下進行發(fā)酵使酪蛋白凝結(jié)、干燥后制成的一種發(fā)酵乳制品[1-2]。曲拉不僅是藏區(qū)牧民儲藏食品蛋白的重要手段,而且也是制作酸奶的發(fā)酵劑[3]。由于曲拉加工環(huán)境相對開放,因此多種微生物參與了發(fā)酵過程[4]。

目前,國內(nèi)外對于乳及制品中乳酸菌的分離鑒定有一定的研究,但對于牦牛曲拉中乳酸菌的分離研究較少。我國是最早應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵的國家之一,累積了大量的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,并且各族人民都有自己獨特的發(fā)酵制作方式,因此保留了各種各樣的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品。并且在不同類型的發(fā)酵乳制品中富含了許多優(yōu)良的益生菌[5-6]。與其他地域特征相比,中國藏區(qū)的高原牧區(qū)普遍具有海拔較高、氣溫低及晝夜溫差大的特殊生態(tài)環(huán)境。在這種相對惡劣的環(huán)境條件下,這些地區(qū)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌依然能夠存活并繁衍下來,其生物學(xué)性能得到優(yōu)化,因此,從其中分離出性狀優(yōu)良的菌株,為開發(fā)具有優(yōu)良性能的乳酸菌發(fā)酵劑具有重要的應(yīng)用價值[7]。

本研究采用采自于甘肅省甘南藏族自治州牧民家庭傳統(tǒng)方法制作的曲拉樣品中分離乳酸菌菌株,并利用形態(tài)學(xué)分析結(jié)合分子生物學(xué)16S rDNA序列同源性分析,確定分離乳酸菌的分類地位,并研究乳酸菌的發(fā)酵性能。研究可為青藏高原極端環(huán)境條件下的傳統(tǒng)牦牛曲拉中乳酸菌種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論支撐,對乳酸菌的工業(yè)化應(yīng)用及乳酸菌發(fā)酵劑制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氫氧化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠;過氧化氫 天津市大茂化學(xué)試劑廠;酚酞 北京中科百奧生物技術(shù)公司;氯化鈉 北京中科百奧生物技術(shù)公司;革蘭氏染色劑 青島海博生物技術(shù)有限公司;MRS agar培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 購自青島海博生物技術(shù)有限公司;脫脂乳粉 黑龍江完達山乳業(yè)。

SW-CJH-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YX-280A型高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;HG303-4型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Primo Star型顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;754PC型紫外可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司;AL204型分析天平 上海Mettler-Toledo公司;LVDV-1型轉(zhuǎn)式數(shù)顯黏度計 上海萬磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 曲拉樣品的采集 曲拉樣品于2016年10月采自于甘肅省甘南藏族自治州合作市那吾鄉(xiāng)瑪崗村、卡四河村和紹瑪村三個村莊的9個不同牧民家庭。將所有樣品置于自封袋中編號,并置于冰盒中運輸至實驗室以備試驗。

1.2.2 乳酸菌菌株的分離純化 參照張蓓[4]的方法。稱取10 g曲拉樣品于90 mL生理鹽水中按照10倍梯度稀釋,取適宜稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)。挑取具有乳酸菌典型特征的菌落,反復(fù)劃線培養(yǎng)直至鏡檢為純菌株。然后進行H2O2酶試驗和革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.3 菌種的保藏 選擇革蘭氏陽性,H2O2酶試驗陰性的菌株于-80 ℃下保藏(MRS液體培養(yǎng)基菌懸液+15%甘油),作為供試菌株。

1.2.4 初篩

1.2.4.1 菌株遺傳穩(wěn)定性的測定 參照張?zhí)m威[8]的方法測定。將菌株活化后以3%接種量接種于12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng),記錄凝乳時間,并觀察凝乳狀態(tài)是否良好。連續(xù)傳代20次,淘汰活力差及凝乳性狀不穩(wěn)定的菌株。

1.2.4.2 凝乳時間的測定 將菌株活化后以3%接種量接種于12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng),記錄凝乳時間。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.2.4.3 各菌株凝乳酸度的測定 將菌株活化后以3%接種量接種于12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng),待凝乳后立刻置于4 ℃冷藏24 h后測定酸度,酸度參考國標(biāo):GB/T 5009. 239-2016《食品酸度的測定》的方法測定,用吉爾涅爾度(°T)表示。重復(fù)3次試驗取平均值。

1.2.4.4 保水率的測定 參照Riener等[9]的方法測定。將菌株活化后以3%接種量接種于12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng),待凝乳后立刻置于4 ℃冷藏24 h后測定。取10 mL樣品裝入離心管中,在13200 r/min、4 ℃的條件下離心20 min傾去上清液,按公式計算保水率。重復(fù)3次試驗取平均值。

式中:M為空離心管質(zhì)量,g;M1為裝入樣品后離心管質(zhì)量,g;M2為傾去上清液后離心管質(zhì)量,g。

1.2.4.5 感官評價 參照生慶海等[10]的方法。將凝乳后的脫脂乳冷藏24 h,由感官評價小組成員對其進行評價,感官評價成員均受過專業(yè)感官培訓(xùn),共7人。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 發(fā)酵乳感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for sensory evaluation of fermented milk

1.2.5 菌株分子生物學(xué)鑒定 將篩選菌株的鑒定工作委托甘肅金博研生物科技有限公司完成。采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。再PCR擴增其16S rDNA片段,反應(yīng)體系共50 μL,PCR反應(yīng)過程為:預(yù)變性95 ℃ 5 min;再95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,共35個循環(huán),終延伸72 ℃ 5 min。完成后用瓊脂糖凝膠電泳檢測,并使用凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物進行DNA測序。將測定的16S rDNA序列登錄NCBI進行BLAST比對,并運用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 乳酸菌菌株性能研究

1.2.6.1 乳酸菌菌株生長特性研究 參照周德慶[11]的方法測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。在24 h內(nèi)每隔2 h取樣,測定菌株的OD600 nm值,以未接種的MRS液體培養(yǎng)基做空白對照。重復(fù)三次試驗取平均值。

1.2.6.2 乳酸菌酸化能力的測定 參照Franciosi等[12]的方法測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種于12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng)。在24 h內(nèi)每隔2 h測定其滴定酸度。重復(fù)三次試驗取平均值。

1.2.6.3 乳酸菌后酸化能力的測定 參照Franciosi等[12]的方法測定。將乳酸菌活化后以3%接種量接種到12%(W/V)滅菌脫脂乳中37 ℃培養(yǎng),待凝乳后立刻放入4 ℃冷藏,測定冷藏期1、5、10、15、20和25 d時的滴定酸度。重復(fù)三次試驗取平均值。

1.2.6.4 冷藏期黏度的變化 參照Celik等[13]的方法測定。對4 ℃冷藏1、5、10、15、20和25 d的樣品測定黏度。重復(fù)三次試驗取平均值。

1.2.6.5 冷藏期乳酸菌活菌數(shù)的變化 參照Ng等[14]的方法測定。對4 ℃冷藏1、5、10、15、20和25 d的樣品以平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。重復(fù)三次試驗取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0(SPSS Inc.,USA)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析,采用ANOVA進行方差分析,用Duncan’s法進行多重顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SE)計算,利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化及初篩結(jié)果

從9份牦牛曲拉樣品中共分離出97株G+、H2O2試驗陰性菌株,暫定為乳酸菌。將所分離菌株連續(xù)傳代20次后,確定菌株的遺傳穩(wěn)定性,在剔除遺傳不穩(wěn)定菌株后從中選擇凝乳時間在8 h之內(nèi)、滴定酸度大于70 °T的菌株。并通過初步篩選,得到6株發(fā)酵性能較好的菌株,將菌株重新進行編號分別為G1、G2、G3、G4、Q1、Q2,結(jié)果見表2。由表2可以看出,這6株菌的凝乳時間較短,在4～7 h之間,凝乳后4 ℃冷藏24 h的滴定酸度在73.42～89.38 °T之間;6株菌的保水率在78.13%～82.63%之間,發(fā)酵乳感官評價評分在75.66～85.71分之間,說明這6株菌發(fā)酵乳的總體感官狀態(tài)良好。篩選結(jié)果表明,這6株菌初步具有制備發(fā)酵劑的潛力。

表2 初篩結(jié)果Table 2 Results of preliminary screening

2.2 菌株16S rRNA序列分析

將篩選出的6株菌進行分子生物學(xué)鑒定。將所有菌株分別進行PCR擴增后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。從圖1可以看出,6條目的片段都在1500 bp左右,且條帶清晰。

圖1 菌株16S rRNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The PCR-production of 16S rRNA gene注:1：G1;2:G2;3:G3;4:G4;5:Q1;6:Q2。

將擴增產(chǎn)物測定所得序列,通過BLAST,同GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列比對,用MEGA 6.0軟件進行序列分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖2所示。對菌株G1、G2、G3和G4的序列分析,其序列長度為1766 bp,與瑞士乳桿菌LactobacillushelveticusIMAU60208相符且在同一個分支上,其相似度和同源性均為100%,可將其鑒定為瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus);菌株Q1的序列長度為1383 bp,與嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusM4相符且在同一個分支上,其相似度和同源性均為100%,可將其鑒定為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus);菌株Q2的序列長度為1209 bp,與耐久腸球菌EnterococcusduransNBRC 100479(T)相符,其相似度和同源性均為100%,可將其鑒定為耐久腸球菌(Enterococcusdurans)。

圖2 試驗菌株與其他乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of test strains and other lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌性能研究

2.3.1 菌株生長特性研究 乳酸菌需要具有穩(wěn)定的遺傳特性,對乳酸菌生長曲線測定,主要是測定菌體細(xì)胞數(shù)的增加量,用菌體進入穩(wěn)定期的時間長短來確定菌體生長速率[15]。生長曲線可提供菌體的最佳收獲時間,即在OD值最大處收集菌體,能獲得高數(shù)量和活力的菌體。

6株乳酸菌的生長特性如圖3所示。由圖3可以看出,所有菌株經(jīng)過較短的適應(yīng)期后進入對數(shù)期,并經(jīng)過一段時間后進入穩(wěn)定期,符合微生物生長周期。在生長的前2 h內(nèi),各菌株的OD值增幅較平緩;然后進入對數(shù)生長期,生長加快,達到生長穩(wěn)定期時OD值達到最大值并保持相對穩(wěn)定狀態(tài),乳酸菌開始累積次級代謝產(chǎn)物。其中,菌株G2和G4在液體培養(yǎng)基中生長速率較快,在10～12 h左右進入穩(wěn)定期達生長高峰,菌株G1在12～14 h達到生長穩(wěn)定期,菌株G3和Q1在液體培養(yǎng)基中生長比較緩慢,在14 h左右達到生長穩(wěn)定期,菌株Q2在液體培養(yǎng)基中生長緩慢,在14～16 h才達到生長高峰進入穩(wěn)定期。

圖3 菌株在液體培養(yǎng)基中的生長曲線(OD值)Fig.3 Growth curve of strains in culture medium(OD value)

2.3.2 菌株酸化能力測定 乳酸菌的產(chǎn)酸能力強弱對發(fā)酵乳的生產(chǎn)制作具有很大的影響。若菌株發(fā)酵產(chǎn)酸太快,導(dǎo)致凝乳時間短,酸乳凝膠形成過快,會影響酸乳的組織狀態(tài)及風(fēng)味物質(zhì)的形成[16-17];若菌株的產(chǎn)酸能力太弱,導(dǎo)致凝乳時間過長,雖然對風(fēng)味形成具有一定的作用,但浪費能源和時間,增大生產(chǎn)成本[18-19]。

乳酸菌菌株的酸化能力如圖4所示。由圖3菌株的生長特性可知,所有乳酸菌菌株在分別在10～16 h先后進入穩(wěn)定期。而從圖4可以看出滴定酸度在穩(wěn)定期依然增大,說明菌株在進入穩(wěn)定期后菌株依然生長繁殖,只是菌株的生長率和死亡率達到了動態(tài)平衡。從圖4還可以看出,在發(fā)酵前2 h,各菌株產(chǎn)酸能力很低,隨著發(fā)酵時間增長,乳酸菌的產(chǎn)酸速率達到一定值并且產(chǎn)酸速率逐漸達到穩(wěn)定。一般認(rèn)為用作酸奶發(fā)酵劑的乳酸菌菌種的產(chǎn)酸能力應(yīng)該在70～110°T之間較好。菌株G1、G2和G4在發(fā)酵8 h時已經(jīng)達到所需的滴定酸度,在整個發(fā)酵周期內(nèi)酸度均大于110°T,因此,G1、G2和G4具有很強的酸化能力。菌株G3、Q1、Q2在10～12 h內(nèi)達到所需滴定酸度,發(fā)酵過程中酸度達到最大值時在88.39～99.27°T之間,說明這3株菌的產(chǎn)酸能力相對較低?？傮w而言,6株菌的酸化能力強弱為G2>G4>G1>G3>Q2>Q1。本試驗中菌株凝乳時滴定酸度在73.42～89.38°T之間變化,高于楊俊俊[7]的研究結(jié)果64.17～69.49°T。而吳均[20]的研究發(fā)現(xiàn),不同乳酸菌在發(fā)酵凝乳時酸度最大為86.92～92.31°T,與本文的研究結(jié)果較一致。這表明了不同乳酸菌之間產(chǎn)酸能力的差異性。

圖4 發(fā)酵過程中滴定酸度的變化Fig.4 The titratable acidity variation of yoghurt during fermentation progress

2.3.3 菌株后酸化能力的測定 在貯藏期,乳酸菌的后酸化能力直接決定了酸乳在貯藏期的品質(zhì)和保質(zhì)期,菌體仍然繁殖代謝發(fā)生后酸化,導(dǎo)致產(chǎn)品過酸,降低保質(zhì)期。因此,生產(chǎn)中需要后酸化能力較弱的乳酸菌[12]。

6株菌冷藏期間酸度的變化如圖5所示。由圖5可以看出,所有菌株在冷藏期酸度有逐漸增大的趨勢。其中,菌株G2和Q2在冷藏期間滴定酸度分別增加了20.93和20.24 °T,后酸化能力較強。菌株G4和Q1滴定酸度增加值分別為19.79和19.13 °T,后酸化能力較弱。菌株G1和G3在冷藏期間滴定酸度分別增加了16.02和14.22 °T,說明菌株G1和G3后酸化能力相對更弱。研究表明,不同菌種的后酸化能力存在差異。秦虹等[21]對不同乳酸菌后酸化能力研究發(fā)現(xiàn),在冷藏期滴定酸度上升了13.72～21.16 °T,與本試驗的研究結(jié)果一致。萬金敏[22]的研究表明,冷藏期滴定酸度上升了10.00～17.76 °T,低于本研究的結(jié)果。本試驗中6株菌的后酸化能力強弱各不相同,通常用于生產(chǎn)的發(fā)酵劑是由兩種或兩種以上的菌株組合而成,這樣就可以彌補有些菌后酸化能力較強的缺陷[18]。

圖5 冷藏期間菌株滴定酸度的變化Fig.5 The acidity variation trend of yoghurt during cold storage

2.3.4 冷藏期間黏度的變化 發(fā)酵乳具有較好的黏度是評價益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn),黏度會影響產(chǎn)品的組織狀態(tài)和感官品質(zhì),乳酸菌可通過產(chǎn)生大量的胞外多糖改善其黏度,另外,乳酸菌蛋白水解能力對黏度存在一定的影響[16]。

不同菌株在冷藏期間黏度的變化如圖6所示。由圖6可以看出,冷藏期間所有菌株發(fā)酵乳的黏度總體呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,所有菌株分別在貯藏10和15 d時黏度值達到最大,其中菌株Q2在整個貯藏周期中黏度一直保持最高,黏度達到最大時為7.84 Pa·s,產(chǎn)黏性能優(yōu)良。菌株Q1、G2黏度達到最大時分別為7.46、7.31 Pa·s。菌株G1、G3、G4黏度達到最大時分別為6.85、5.42、6.75 Pa·s,因此,菌株G3在整個貯藏期黏度相對較低。但總體而言,在25 d冷藏期間內(nèi),各菌株所發(fā)酵酸乳依然具有較高水平的黏度。本試驗6株乳酸菌發(fā)酵乳黏度在冷藏期間黏度值呈先升高后降低的趨勢,這與范瑞等[23]的研究結(jié)果一致。歐陽霞[24]對乳酸菌產(chǎn)黏性能研究發(fā)現(xiàn),所分離菌株的黏度最高為4 Pa·s,低于本試驗的研究結(jié)果,說明本試驗乳酸菌菌株具有較好的產(chǎn)黏性能。

圖6 冷藏期間黏度的變化Fig.6 The viscosity variation trend of yoghurt during cold storage

2.3.5 冷藏期間乳酸菌活菌數(shù)的變化 發(fā)酵乳中含有大量的活菌數(shù)也是評價益生菌的重要指標(biāo)。國標(biāo)GB 5009.239-2016規(guī)定,發(fā)酵乳中的活菌數(shù)不低于106CFU/mL,并且當(dāng)活菌數(shù)高于這個數(shù)量時才能在人腸道中發(fā)揮益生作用[14]。

6株菌發(fā)酵乳冷藏期乳酸菌活菌數(shù)的變化如圖7所示。由圖7可以看出,在冷藏期間,所有乳酸菌菌株發(fā)酵乳活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并且,不同菌株的活菌數(shù)在冷藏期間變化存在差異。菌株Q2在冷藏期的15 d內(nèi)的活菌數(shù)大于其他菌株,在15 d之后活菌數(shù)迅速下降,說明該菌株耐酸性可能較差,在酸性條件下不利于生長。在冷藏期間,所有菌株的活菌數(shù)分別在第5和10 d達到最大值,并在貯藏期間活菌數(shù)均大于107CFU/mL。在4 ℃冷藏25 d之后,菌株G3的活菌數(shù)最低。本試驗中所有菌株發(fā)酵的酸乳在貯藏期內(nèi)活菌數(shù)均大于107CFU/mL,而且呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,這與Güler等[25]的研究結(jié)果一致。原因是在冷藏初期乳酸菌可以繼續(xù)利用乳糖等營養(yǎng)物質(zhì),使活菌數(shù)呈現(xiàn)上升的趨勢;但在貯藏后期隨著冷藏時間的延長,酸度的繼續(xù)升高、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的積累使得活菌數(shù)降低[23]。吳均[20]對從牦牛酸奶中乳酸菌研究發(fā)現(xiàn),所以菌株發(fā)酵乳冷藏期活菌數(shù)均大于107(CFU/mL),這與本文的研究結(jié)果一致,但高于萬金敏[22]活菌數(shù)大于106(CFU/mL)的研究結(jié)果。

圖7 冷藏期間活菌數(shù)的變化Fig.7 The change of LAB counts in the yoghurt during cold storage

3 結(jié)論

從甘南地區(qū)采集的9份曲拉樣品中初步篩選出6株性狀優(yōu)良的乳酸菌,以分子生物學(xué)方法鑒定這6株菌,結(jié)果表明:菌株Q1為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus);菌株Q2為耐久腸球菌(Enterococcusdurans);菌株G1、G2、G3、G4為瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus);對6株菌性能研究表明,這6株乳酸菌凝乳時間在4～7 h之間變化,凝乳時的滴定酸度在73.42～89.38 °T之間變化,乳酸菌菌株發(fā)酵乳冷藏期間滴定酸度增加了14.22～20.93 °T,活菌數(shù)含量均大于107CFU/mL,黏度最大時為5.42～7.84 Pa·s。經(jīng)綜合分析,各菌株性能較為突出,具有開發(fā)利用價值。